文摘

透明质酸(HA)、多糖提供了广泛的各种动物的细胞外基质,是作为可注射凝胶再生医学材料由于其生物相容性。透明质酸水凝胶可以从公顷产生分子通过交联。物理交联通过共价债券比而不是化学交联使用交联剂,以防止意外相互作用在生物环境和减少炎症反应造成的副产品。在这项研究中,HA与两种类型的修改补充单链DNA通过消化与限制酶Bsp1286I pUC118向量。当HA-DNAs涨跌互现,杂化互补链作为交联形成水凝胶。切应力应用于混合这些DNA-conjugated HA解决方案。因此,僵硬的水凝胶的弹性模量约100 Pa。凝胶从而获得简单处理作为可注射凝胶,增加其结构特性依赖于剪切应力应用通过注射针。此外,DNA交联的点可用于杂交与其他生物聚合物水凝胶,乳沟限制性内切酶和离解的热变性。

1。介绍

高分子水凝胶是一种三维网络,里面保留水分子的能力。由于其良好的生物相容性基于高吸水和潴留,水凝胶被广泛用于医学应用、卫生用品和化妆品。水凝胶,由天然聚合物的化学或物理交联胶原蛋白、海藻酸等,利用在再生医学和组织工程支架等领域的细胞粘附、细胞打印和制动材料植入材料。透明质酸(HA)水凝胶是一种最有前途的材料生产的再生医学(1]。

哈,一个D-glucuronic酸和D -组成的生物高聚物N乙酰氨基葡萄糖与通过交替β1、4和β1、3糖苷键,表示无所不在地粘多糖在细胞外基质(ECM)的各种动物(2]。与胶原蛋白等蛋白质的序列不同于物种,HA抗原性较低,因此尤其有望被应用作为可注射凝胶。

已经表明,HA的self-association感应生物高聚物分子的分子间相互作用和纠缠[3- - - - - -5]。然而,利用哈水凝胶材料,交联是必不可少的,因为自然发生的交互强烈依赖于HA的浓度和链长度(6,7]。以前,各种交联化学官能团的引入了羧基侧链的哈,已报告。在这些报道,官能团如环氧丙基甲基丙烯酸(8,9)、甲基丙烯酸(10),儿茶酚胺(11],2-dithiopyridyl集团[12),和benzoylcysteine集团(13]。然而,化学交联可能会导致意想不到的侧链和生物分子之间的相互作用。炎症反应可能是由于反应的副产品和自由基引起的。此外,凝胶的过程中可能会受到生物环境的影响,如盐浓度、含水量、温度、和博士出于这个原因,医疗用注射凝胶应该交联的身体,但不是通过共价债券。例如,聚离子复合凝胶的哈,聚阴离子,静电与聚阳离子,以前曾有报道称14- - - - - -17]。也有报道凝胶肽形成的地方β表是用于交联(18]。Physically-crosslinked水凝胶是有利的,因为它可以真正地准备化学交联凝胶相比,通过调整盐浓度和pH值等条件;然而很难精确控制交互。出于这个原因,物理凝胶的互动互补DNA用于交联已经被提出,近年来开发的,如peptide-DNA凝胶(19- - - - - -21)和acrylamide-DNA凝胶(22,23]。然而,根据最新的评论24,25),HA的物理凝胶交联与DNA并没有被报道。DNA是一个安全的材料的亲水性和生物相容性。互动互补链的特异性高特异性酶的乳沟和连杆也有用的属性的DNA。此外,双链DNA解离成两个单股和无规卷曲构象供暖。因为这个过程是可逆的,可以由温度控制溶胶-凝胶转变。

在这项研究中,我们关注的优势相互作用DNA单链DNA和捏造HA修改两个连接器与互补序列。通过混合和促进互补链之间的杂交,HA分子可以相互交联。然而,短链DNA之间的相互作用(~ 20基地)较弱(26),可能不是有效的HA分子作为交联点之间。因此,很长一段DNA链~ 100基地被用作链接器。然而,很难获得大量长链DNA通过化学合成。因此,我们获得的DNA质粒扩增DNA片段的酶治疗大肠杆菌。

2。材料和方法

2.1。材料

透明质酸钠盐链球菌zooepidemicus(公顷;fch - 200 MW 180 k - 220 k):龟甲万公司(日本东京);主管细胞(DH5α),pUC118质粒DNA, Bsp1286I和T4 DNA连接酶:豆类生物公司(志贺、日本);硫醇盐低聚糖和5′末端dna与C6修饰符(1 -修改O-dimethoxytrityl-hexyl-disulfide-1′- [(2-cyanoethyl) - (N,N二异丙基)]-phosphoramidite (Oligo1: thiol-5′-TTTTGTGCA-3′, Oligo2: thiol-5′-TTTTGTGCT-3′,)):合成和脱盐的明星益生元Rikaken有限公司有限公司(日本名古屋);(ethyl-3) - 3-dimethylaminopropyl cabodiimidehydrochloride (EDC): Dojindo实验室(熊本、日本);N-hydroxysulfosuccinimide钠盐(NHS)和N——(2-aminoethyl)马来酰亚胺盐酸盐(AEM):东京化工有限公司有限公司(日本东京);和光纯化学试剂将军:kouichi公司(日本大阪)。

2.2。裂解制备质粒DNA

根据制造商的指示,pUC118质粒转化为主管细胞使用结扎强大的组合。板文化生长与氨苄西林(50磅的媒介μg / mL)在37°C,过夜。质粒提取大肠杆菌使用Genopure质粒Midi设备(罗氏),根据制造商的指示。质粒DNA用乙醇沉淀,然后溶解在水中。整除的质粒DNA (1μg)是与Bsp1286I孵化反应缓冲一夜之间在30°C。乙醇沉淀后溶解在水中获得裂解质粒DNA。

2.3。修改的HA裂解质粒DNA

购买硫醇盐低聚糖dna被孵化0.1二硫苏糖醇水溶液为去30分钟。后,解决方案是加载到一个反相色谱柱(Sep-Pak C1,水域)。色谱方法包括以下步骤:平衡和列用2 M triethylamide醋酸和30%乙腈洗脱。色谱法筛选了产品冻干后。HA是溶解在50毫升0.1 MES缓冲区(pH值6.0)使HA浓度0.2% (w / v)。接下来,1.44毫克/毫升的EDC和0.86毫克/毫升的NHS补充说,解决方案是混合(30分钟,RT)。此外,1.78毫克/毫升的AEM添加,混合物在室温下孵化一夜之间获得HA-Mal。孵化后,解决方案是透析(MWCO 10 kD) 50 mM氯化钠2 h和蒸馏水48 h,然后冻干。Deprotected HS-oligo DNA添加到0.5% (w / v) HA-Mal水溶液的最终浓度30μM和孵化(48 h, RT)获得HA-Oligo1 HA-Oligo2。产品是透析(MWCO 7 kD)和蒸馏水24 h和冻干完全除去未反应的DNA寡聚物。HA-Oligo1和HA-Oligo2分别溶解在600年μl (T4连接酶缓冲做出最后浓度0.5% (w / v) 10μ克裂解质粒DNA的解决方案和1050单位的T4 DNA连接酶和孵化(1 h, 37°C)。然后,等量的10 M尿素溶液添加混合反演和加热在90°C为变性10分钟。淬火后冰,HA-Plasmid1和HA-Plasmid2获得,透析(MWCO 10 kD)与蒸馏水24 h和冻干。

2.4。琼脂糖凝胶电泳

样本在2% TAE琼脂糖凝胶电泳50 V 1 h。接下来,50个基点DNA梯(GeneDireX Inc .)被用作分子质量标准。乐队是沾SYBR™黄金核酸凝胶染色呈现(热费希尔科学)和使用的凝胶Doc EZ成像仪系统(Biorad)。

2.5。¹H核磁共振

的¹H NMR光谱记录来确定的详细结构聚合物使用JEOL JNM-ECX500 (500 MHz)光谱仪。设置一个精确的化学位移,同轴插入(Wilmad-LabGlass)与核磁共振管用于外部锁(参考:CHCl₃TMS)为0.1%。

2.6。动态粘度分析

频率依赖的动态粘弹性流变仪测量了(Anton洼地,MCR 302 / F)。三百毫升的样品被夹在锥板(φ25毫米)。测量进行了应变为1%,37°C。

3所示。结果与讨论

3.1。低聚糖的制备dna重组哈

如计划所示1HA与低聚糖修改DNA的合成工艺进行了用碳化二亚胺(27]。葡萄糖醛酸的羧基哈被激活和EDC NHS, maleimidizedN——(2-aminoethyl)马来酰亚胺盐酸盐(AEM)获得HA-Mal,再加上硫醇盐低聚糖dna (Oligo1: thiol-5′-TTTTGTGCA-3′和Oligo2: thiol-5′-TTTTGTGCT-3′)。的¹H NMR光谱哈,HA-Mal,产品HA-Oligo1和HA-Oligo2如图1。基于比例积分的乙酰基峰来源于公顷(1.6 ppm)和胸苷的DNA的甲基(1.3 ppm), DNA替换的程度(DS)计算HA-Oligo1和HA-Oligo2 4.7%和5.6%,分别。

在初步实验中,当HA与poly-A20修改与HA与poly-T20修改,混合凝胶的形成,但其机械强度很弱(数据未显示)由于弱t债券。侧链之间的相互作用强劲和高特异性,我们延长了修改DNA长互补DNA链。计划2显示了一个过程扩展DNA链和HA分子的交联。扩展DNA的原因,而不是直接修改长DNA链合成HA是由于担心DNA分子的高阶结构形成修改后降低了产量。此外,长DNA片段的合成的成本也高。

消化片段的质粒DNA pUC118被用来扩展修改DNA。悬臂乳沟Bsp1286I结果在4所示方案3。表1显示了悬臂长度和序列3′的细节为每个片段。质粒pUC118 DNA裂解与Bsp1286I几乎完全(图2,弄2)。当裂解DNA片段混合着哈,乐队成为涂片和转移到高分子量(图2,莱茵4)。大片段的影响尤为显著。这个结果是观察到由于DNA分子之间的相互作用和HA的连锁店。

如表所示1,片段F4包含85个基地,其3′过剩Oligo1和Oligo2互补。因此,F4 DNA片段的结扎HA-Oligo1和HA-Oligo2获得各自的分子改良与质粒DNA片段,HA-Plasmid1, HA-Plasmid2。在电泳过程中,乐队HA-Plasmid1和HA-Plasmid2出现一抹带对应于50 - 100 bp分子质量(图2道5和6)。DNA被认为是在多个站点在一公顷分子共轭;但是很难观察到它作为一种独特的乐队,因为它是单链。

3.2。动态粘弹性测量

分析凝胶化过程中,粘弹性是衡量使用流变仪。等量的HA-Plasmid1 1%和1% HA-Plasmid2被放在测量板的流变仪和微量吸液管和混合。依赖的动态粘弹性的频率测量。解决方案(图3(一个))变成了凝胶后测量(图3 (b))。重复测量时,得到的凝胶(图3 (c))。连续三次进行了测量。频率依赖性的储能模量和损耗模量测量结果如图所示4。HA和HA-Mal显示频率依赖性sol-like行为(图表示4(一))。HA-Plasmid1和HA-Plasmid2时首先分析,这表明sol-like行为;然而储能模量的变化对频率很小在第二次和第三次测量。第三次测量后,储能模量和褐色δ这种凝胶是55.5 Pa和0.31,分别,这表明网络结构形成和软凝胶。可注射凝胶形成的两个组件通常立即混合形式。然而,有趣的是,我们的水凝胶剪切后才形成的。DNA分子是没有完全混合和杂化在第一次测量由于位阻高分子量的HA-Plasmids所致。假设剪切应力测量中应用促进了分子凝胶形成的过程,因为适当地混合,从而相互关联和杂化。

第三次测量后,整除的限制性内切酶Bsp1286I (1μl(15)和10×l缓冲区μl)被添加到135μl凝胶和混合是孵化一夜之间在30°C。在孵化后,混合物的流变特性测量。因此,储能模量显著下降到0.7 Pa,但弹性模量没有依赖于频率的低频区域(图4 (b))。这触变特性是由于存在网络结构aftesr酶治疗,尽管交叉耦合点消失了。

4所示。结论

水凝胶有望应用于再生医学材料由于其吸收和留住水和活组织的成分相似。哈,一个代表多糖在活组织,具有良好的生物相容性,因此它有一个巨大的潜力在水凝胶中使用生产。然而,HA分子被添加交联剂交联或引入官能团。然而,HA凝胶和化学交联剂使产品难以使用作为植入材料,因为它是难以控制的反应环境。此外,有细胞毒性的风险和炎症反应,这可能是由于反应残留物和反应副产物。因此,physically-crosslinked哈水凝胶被认为是更安全、更不会引起排斥的。

在这项研究中,HA与DNA片段通过共轭的消化与Bsp1286I pUC118质粒。由于DNA杂交水凝胶形成。通过应用一定的剪切应力,相对僵硬的凝胶,与弹性模量约100 Pa,。研究表明,注射凝胶容易处理,因为它是一种胶凝液注射针。一般来说,凝胶用作细胞培养支架弹性模量约为30 - 300 Pa,因此我们认为准备哈水凝胶可以作为细胞支架。凝胶硬度可以控制通过改变maleimidization的程度。自交联发生互补DNA链通过杂交,这种水凝胶可以修改其他生物聚合物使用相同的杂交技术。这种水凝胶也可以很容易裂解和限制性内切酶的分离热变性。这个属性还可能导致基因传递到应用程序。因此,该材料具有潜在的生物和医学应用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们承认科学研究补助金从jsp (25242041)。