发展和特征的聚乙二醇色谱巨石小说平台聚乙二醇核糖核酸酶的分离同分异构体

文摘

聚乙二醇或聚乙烯glycol-modified蛋白质作为药物在不同的疾病。然而,他们采购的主要缺点是净化过程中未反应的蛋白质分离和聚乙二醇的物种。做了努力通过使用不同的固定相色谱分离PEGylation反应和修改支持。在这种背景下,本研究介绍了色谱的使用整块材料改性与单独的聚乙二醇聚乙二醇(PEG)的核糖核酸酶(核糖核酸酶A)。为此,对流媒体交互(CIM)乙二胺(EDA)整体磁盘使用三聚乙二醇PEG分子量(1、10和20 kDa)。用于单独的聚乙二醇核糖核酸酶的聚乙二醇巨石被修改,也有三个PEG分子量(5、20和40 kDa)通过疏水作用色谱法。性能结果表明,牛血清白蛋白(BSA)结合聚乙二醇巨石和绑定BSA增加当硫酸铵浓度和流量增加。此外,当聚乙二醇核糖核酸酶是加载到聚乙二醇巨石,PEG-PEG交互成为主流的分离(即不同的聚乙二醇物种。,mono和di-PEGylated)。也观察到,接枝PEG链的分子量决议的庞然大物强烈影响操作。有趣的是,可以分开,第一次同分异构体40 kDa聚乙二醇核糖核酸酶通过疏水作用色谱法。这项技术,基于聚乙二醇巨石,代表了一个新的方法来有效地分离蛋白质和聚乙二醇的蛋白质。 Besides, it could be used to separate other PEGylated molecules of biopharmaceutical or biotechnological interest.

1。介绍

在过去的几十年里,一些蛋白质已经被用于治疗不同疾病的高生物活性、高特异性已经证明。然而,其中一些种类的蛋白质有不利的特性如溶解度低,不稳定,快速清除人体(1]。在这种背景下,PEGylation一直是最成功的策略来克服这些缺点2]。PEGylation是一个激活的共价连接聚乙二醇(PEG)的分子蛋白(3]。这一修改形成了空间屏障对蛋白水解酶或抗体,增加热稳定性,减少免疫反应,还增加了蛋白质分子的大小,提高人体的循环和间隙时间(4,5]。第一个商业聚乙二醇蛋白质,供人类食用,30年前成立,此后几个聚乙二醇药物已经被FDA批准(2]。

共同PEGylation反应,几个配合不同的挂钩链连接到他们了。,反应混合物包含未反应的蛋白质,mono-PEGylated和di-PEGylated蛋白质(有时甚至poly-PEGylated配合),和未反应的挂钩4,6]。然而,聚乙二醇的物种有不同的效果和活动水平,所需的共轭通常mono-PEGylated蛋白质,它提供了一个更高的生物活性和最好的药代动力学性质。di-PEGylated蛋白或配合PEGylation度较高的生物活性较低主要是因为挂钩的活性位点成为阻碍链(6,7]。出于这个原因,它是非常可取的区分mono-PEGylated蛋白质和其他物种。尽管如此,它的分离是一个困难的问题,一个有趣的工程问题,因为物理和化学性质类似的不受欢迎的产品。在这种背景下,色谱方法代表了最有吸引力和有效的替代的分离,因为它可以利用不同的属性更改在PEGylation反应(4]。

的色谱方法用于分离mono-PEGylated蛋白质疏水作用(嗝)、阴离子交换(AEX)成分股,大小排斥(SEC)和阳离子交换(CEX)色谱法(4,6,8]。我们的研究小组一直在聚乙二醇的分离蛋白质。2009年Cisneros-Ruiz et al。9]分离聚乙二醇从unPEGylated核糖核酸酶使用激活CH琼脂糖(核糖核酸酶A) 4 b媒体;2014年Hernandez-Martinez和阿基拉6)使用PEG-modified琼脂糖6 b支持550,2000,5000克摩尔⁻¹挂钩分离相同的聚乙二醇酶发现PEG-PEG聚乙二醇和聚乙二醇的支持蛋白质之间的相互作用促进了分离;2016年Mayolo-Deloisa et al。4]分析了聚乙二醇核糖核酸酶的分离,β乳球蛋白,溶菌酶之间的嗝传统(toyopearl丁基650 c和丁基琼脂糖)和单片(CIM C4)支持,他们发现整体支持一个合适的替代传统的色谱分离的媒体聚乙二醇的蛋白质。

最后两个提到的作品提供一个指导的新理念:把色谱聚乙二醇支持的优势与整体的特性:聚乙二醇巨石。色谱巨石,被认为是4^th代色谱材料,由一块高度开放的多孔材料。整块材料可用于所有色谱模式。这种色谱支持可以在对流率很高,因为他们拥有小微孔隙和中孔,让低背压在洗脱液流率高10]。这些优势已经被用来净化寡核苷酸,蛋白质,聚乙二醇蛋白质和其他生物技术产品(11]。独石的另一个重要优点是可调的化学,物理和生物特性,因为它们可以呈现不同的化学组,可以携带一个广泛范围的分子来创建支持与新颖的配体(12]。在他们的工作,Almedia et al。(13)修改巨石有两个配体(赖氨酸和尸胺)的恢复minicircle DNA。在这工作,巨石与乙二胺(EDA)组使用不同PEG分子量聚乙二醇。聚乙二醇巨石被用于单独的聚乙二醇核糖核酸酶A,治疗蛋白质具有抗癌特性(14]。,有可能建立一个新的高效的基础平台分离不同的聚乙二醇蛋白质用于多个应用程序。

2。材料和方法

2.1。材料

核糖核酸酶A,牛血清白蛋白(BSA), cyanoborohydride钠、盐酸酸,和三(羟甲基)氨基甲烷从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。硫酸铵,磷酸氢二钾(K₂HPO₄),单碱的磷酸钾(KH₂阿宝₄)购买的j·t·贝克(美国中心山谷,PA)。甲氧基聚(乙二醇)丙醛的名义分子质量为1.0,10.0和20.0 kDa来自JenKem技术(艾伦,TX)。CIM EDA磁盘巨石被从BIA购买分离(Ajdovščina、斯洛文尼亚)。甲醇的高效液相色谱级从霍尼韦尔购买Burdick和杰克逊(美国新泽西州莫里斯平原)。所有其他的化学物质都至少为分析纯。

2.2。色谱庞然大物PEGylation

CIM EDA磁盘(列体积,简历0.34毫升)使用三聚乙二醇PEG分子量(1.0、10.0和20.0 kDa)通过还原胺化作用。修改整块材料,注射泵(融合200年,Chemyx Inc .)系统。10.0毫升的巨石被洗MilliQ (MQ)水1.0 mL / min,然后平衡5.0毫升的甲醇溶液为10.0%,20.0%,50.0%,75.0%,100.0%在pH值为6.0 v / v使用相同的流量。之后,在pH值20.0毫升的甲醇100.0% v / v 6.0与250.0毫米cyanoborohydride钠和甲氧基聚(乙二醇)丙醛(mPEG)使用摩尔比率5:1(胺:醛活跃网站)15)是通过磁盘在24小时0.1毫升/分钟。巨石被洗5.0毫升的甲醇pH值6.0解决方案为100.0%,75.0%,50.0%,20.0%,和10.0% v / v, 5.0毫升的水和5.0毫升乙醇20.0% v / v 1.0毫升/分钟连续。实验在室温下进行,与聚乙二醇巨石被储存在4°C,直到他们的使用。

2.3。庞然大物PEGylation收益率计算

收益率(或程度)的庞然大物PEGylation决心通过测量自由胺组的支持使用相同的注射泵系统如前所述。自由胺组量化使用诺尔et al .,描述的方法适应独石(16]。短暂,聚乙二醇巨石MQ 5.0毫升的水清洗和条件与5.0毫升的MQ水pH值3.0 1.0 mL / min。之后,5.0毫升的50.0毫米橙色二世与MQ解决方案准备水pH值3.0泵出的巨石在0.16毫升/分钟淹没在40°C水浴。然后,修改后的巨石被风干。飘散的橙色二分子被移除,25.0毫升的MQ水pH值3.0是泵使用1.0毫升/分钟的流量。保税分子筛选了使用MQ 90.0毫升的水pH值12.0 2.0 mL / min,收集体积分数。聚乙二醇的巨石被洗与MQ 5.0毫升的水和乙醇溶液在20.0% v / v。收集了成交量的pH值调整的250.0µL 1.0盐酸和在484海里使用微型板块分光光度计测量吸光度(美国VT Biotek)。橙色II浓度确定校准曲线之前准备(毫米⁻¹厘米⁻¹)。摩尔百分比计算修改根据以下方程:

2.4。吸附实验

由于单片支持的性质,聚乙二醇巨石上的吸附实验进行只有在动态模式。为此,BSA被用作蛋白质模型作为首选使用和在其他地方类似实验报告(6,17]。突破曲线得到连接的聚乙二醇巨石Akta先锋派的色谱系统(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)和平衡缓冲B由20.0毫米Tris-HCl pH值8.2与1.5或2.0米的硫酸铵()。蛋白质溶液在不同浓度BSA(1.0, 2.0,和3.0毫克/毫升准备在缓冲B与1.5或2.0米)加载使用50.0毫升superloop(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典),直到这些巨石被饱和。蛋白质保税与20.0毫米Tris-HCl pH值8.2筛选了缓冲区。动态绑定能力(DBC)获得突破曲线的每一个聚乙二醇庞然大物的蛋白质保税出口时每列体积浓度达到10%的饲料蛋白质含量。10%的突破( )计算使用以下方程:

在哪里V_C在mL列卷,V₁₀的体积是毫升应用突破10%,C_F毫克/毫升的饲料蛋白质含量和C_出在毫克/毫升出口蛋白质浓度。所有实验都进行了一式三份,提交的值对应于这些结果的平均值与相应的标准误差。

2.5。聚乙二醇核糖核酸酶的制备

PEGylation反应是根据Mayolo-Deloisa等报告的方法。4]。短暂,5.5毫升的核糖核酸酶溶液浓度为3.0 mg / mL的100.0毫米磷酸钠缓冲NaBH的pH值5.1 + 100.0毫米₃CN是添加到瓶含有82.5毫克mPEG的分子量为5.0,20.0,和40.0 kDa。反应混合物搅拌了17个小时在4°C,停在冻结−20°C,在这个条件,直到他们的使用和存储。

2.6。聚乙二醇核糖核酸酶的纯化交会的配合

得到聚乙二醇蛋白质标准,之前准备PEGylation反应被秒使用一个Akta ' +色谱分离系统(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)配备5毫升注射循环,和一个XK 2670列挤满了Superose 12(70.0×2.6厘米,简历320.0毫升)。流动相,10.0毫米磷酸钠缓冲区在pH值7.2 + 150.0毫米氯化钾是用于执行权力平等主义的洗脱1.0毫升/分钟。吸光度在280海里的分数是收集和集中使用Amicon室和一个Diaflo 3.0 kDa的超滤膜(美国马Amicon Inc .)。每一个聚乙二醇和未反应的物种的身份之前已经确认和报告。最后,聚乙二醇蛋白冻干并存储在−4°C (6]。这些蛋白质冻干聚乙二醇作为标准进行分离研究和聚乙二醇巨石峰鉴别分析。

2.7。聚乙二醇的分离核糖核酸酶通过聚乙二醇巨石

聚乙二醇巨石被连接到一个Akta先锋派的系统,配备了一个0.1毫升注射循环。实验在室温下进行,使用流量等于1.0 mL / min。缓冲,由20.0毫米Tris-HCl pH值8.2和B阶段形成的阶段与3.0(由于低疏水性的核糖核酸酶A)被用于疏水作用模式。

色谱运行使用下面的程序是:平衡与B阶段(10.0 CVs),注入(0.1毫升PEGylation反应没有稀释),清洗与B阶段(3.0 CVs),然后立即一步梯度受雇,50%的B阶段(20.0 CVs), 20%的B阶段B阶段(17.5 CVs)和0.0% (20.0 CVs)。柱洗脱液监测在215海里,也在每次运行电导率测量。所有的实验都是在相同的条件下进行了一式三份,允许性能比较。

2.8。sds - page分析

稍后会提到,两个部分解决峰出现40.0 kDa聚乙二醇核糖核酸酶的纯化20.0 kDa聚乙二醇庞然大物。评估他们的身份,钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)方法根据执行报告Mejia-Manzano et al。18使用12.0% (w / v) Mini-PROTEAN预制凝胶(BIO-RAD、钙、美国)。包含获得峰值涨跌互现的脱盐分数6 x加载缓冲区和加热10分钟在99°C。这种凝胶是silver-stained检测蛋白质和barium-iodine复杂用于可视化mPEG有报道称它为其他地方(18]。

2.9。聚乙二醇独石的组合来提高分离

改善聚乙二醇核糖核酸酶的分离,两个和三个巨石被连续进入Akta先锋派的系统在不同的订单。使用连续的巨石是可能的因为BIA分离提供的住房可以容纳三个单一磁盘。聚乙二醇庞然大物配置试:10 - 20、20,1-10-20,和20-10-1 kDa。运行进行使用2.0毫升/分钟的流量,色谱程序是和前面描述的一样。

3所示。结果与讨论

3.1。巨石PEGylation收益率的修改

聚乙二醇的分离和纯化蛋白质一直关注在不同的生产方案。在这工作,整体磁盘通过分离不同的还原胺化聚乙二醇聚乙二醇核糖核酸酶结合后获得的一种反应。EDA巨石以来主要胺和mPEG与醛团体被激活,可以接枝聚合物链支持使用cyanoborohydride钠作为还原剂和甲醇质子溶剂(19]。此外,挂钩也溶于甲醇,甚至比在水中(20.)和PEG浓度的溶液粘度可以忽略不计。PEGylation反应的有效性在每个挂钩的巨石分子量确定间接通过测量大量的未反应的主要使用橙色二胺染料。这种染料的优点将通过静电电荷主要胺在酸性条件下,可以发布在碱性条件下(16]。表1显示了聚乙二醇的摩尔比例修改整块材料在相同的实验条件下不同的挂钩大小。挂钩的数量分子绑定到巨石礼物最多当使用mPEG 10.0 kDa,后来减少。这种行为显示了PEG分子量的影响在其链接功能的单片表面。在低分子量的mPEG(即。,1。0 kDa), the interactions between PEG chains and the amine groups on the monolithic surface are lower than those observed with the 10.0 kDa mPEG. On counterpart, at a high molecular weight of mPEG (i.e., 20.0 kDa), the polymeric chains attached to the support can probably change their structure to mushroom conformation [21)允许立体效果和PEG-PEG交互阻碍胺组之间的接触和自由连锁挂钩从而避免新债券的形成和聚合物之间的庞然大物。在这种情况下,PEG-PEG 20 kDa mPEG链之间的相互作用更加频繁由于其高结构的灵活性,允许不同的空间配置,加强它们之间的交互(6]。有趣的是,修改这一工作不同于数据获得的屈服行为报道Hernandez-Martinez和阿基拉6),结论表明,PEG分子量较高,修改比例减少传统树脂支持。这种不同的行为可能与不同的支持结构。巨石的高度多孔结构允许更好的移动和静止阶段之间的相互作用。因此,即使使用较大的mPEG分子(例如,10 kDa),收益率的修改不妥协。最后,由于聚乙二醇的修改比例巨石是摩尔,这意味着20.0 kDa PEG链20倍比1.0 kDa PEG链醇组,预计其色谱行为上的差异。

3.2。聚乙二醇独石的吸附能力

定列的性能相关参数是动态绑定能力(DBC)。在这部作品中,DBC嗝模式确定了每个聚乙二醇庞然大物用BSA作为模型蛋白在不同操作条件下:流量、盐浓度、和饲料蛋白质浓度。由于EDA整体磁盘是一个弱阴离子的支持(8),它是不可能使用它作为一个控制饱和曲线在相同条件下的实验。突破曲线,显示废水中蛋白质浓度的上升随着时间的推移直到这个值达到相同浓度的提要(22),呈现在图1。见,突破曲线呈现相同形状独立于mPEG分子量的庞然大物,这表明蛋白质吸附过程在所有三个案例都是一样的。然而,在高流量(即。,2。0 mL/min), the amount of BSA adsorbed by the PEGylated monoliths increases. This could be related to the transfer mechanism of the monolith: convective mass transfer. This behavior is opposite to that reported by Hernández–Martínez and Aguilar [6)因为他们使用聚乙二醇琼脂糖6 b,多孔珠材料扩散传质。

另一方面,当一个2.0的浓度,聚乙二醇巨石花了更多的时间来饱和浓度比1.5米,这意味着修改支持吸附更多的BSA在更高的浓度。这种行为是观察到,因为在较高的浓度,蛋白质的疏水区域变得更加暴露,促进更多的互动与接枝PEG链的庞然大物。当1.5米,使用浓度,这些疏水区域受阻甚至在饲料蛋白质含量高,因此plateau-like曲线在更短的时间内达到。最后,聚合物链分子量与庞然大物在2.0 SA影响更饱和的时代。PEG分子的疏水性与其分子量增加(23]。因此,在高分子量之间的疏水相互作用蛋白质和聚乙二醇庞然大物增加导致更多的蛋白质吸附到支持。

在这同一行,聚乙二醇巨石被确定(表的值1)每一个突破曲线如图1。的聚乙二醇的巨石随流量的崛起。这种行为是违反Hernandez-Martinez报道和阿基拉6由于传质机制的差异。的值在表1由Hernandez-Martinez高于报道,阿基拉的聚乙二醇琼脂糖6 b。独石+高可用的对流传质表面积挂钩的整体结构和疏水性分子允许更好protein-support交互和增加其吸附能力即使在高流率。另一方面,较高的DBC值观察在高蛋白质含量和美联储,它对应于突破曲线的行为。最后,分子量的PEG分子接枝庞然大物显示一个单一的行为。挂钩的聚乙二醇庞然大物10.0 kDa DBC值最低,而修改的mPEG 1.0和20.0 kDa显示,概括地说,类似的价值观。这种趋势可以归因于PEG链的结构灵活性以来灵活性增加长度一样(24]。10.0 kDa的挂钩连接到庞然大物可以修改其直系结构到不同的空间配置。不同的挂钩配置允许交互隐藏一些疏水性区域不能绑定到蛋白质或较弱的方式这样做。类似的效应发生的20.0 kDa挂钩,但尽管如此现象,其长度允许在其表面吸附的蛋白质。就其本身而言,1.0 kDa链挂钩可以避免其他空间配置使其疏水区域用于蛋白质绑定。DBC值越高获得的分别为6.85±0.21,6.88±0.09毫克/毫升1.0 kDa和20.0 kDa聚乙二醇巨石,分别为2.0毫升/分钟,随着浓度的2.0米和3.0毫克/毫升的组织。

3.3。聚乙二醇巨石分离聚乙二醇蛋白质的能力

聚乙二醇巨石分离性能的聚乙二醇蛋白质是评估使用聚乙二醇核糖核酸酶A .核糖核酸酶共轭和三个PEG分子量分析挂钩的大小的影响链连接到蛋白质的分离PEGylation反应。如前所述,DBC结果表明,在2.0毫升/分钟吸附过程有更好的性能;然而,聚乙二醇蛋白质,结合蛋白的数量在这个特定的流量较低(数据没有显示)。因此,它是决定使用1.0毫升/分钟的体积流率在随后的实验。图2显示了分离的PEGylation核糖核酸酶a的反应需要提到的一个重要的一点是,在以前的报告,PEGylation反应稀释作为缓冲列前注射(4,6,17]因为蛋白质绑定到嗝配体在高盐浓度和筛选了较低的(25]。在这部作品中,反应混合物注入之前没有稀释的缓冲区。尽管如此,聚乙二醇蛋白质使用聚乙二醇巨石附加和分离,表明PEG-PEG交互管理在这种色谱分离。在所有情况下,少量的本机蛋白质结合弱的支持,使其保留时间不同的聚乙二醇的物种。在阴离子交换色谱支持、蛋白质PEGylation减少他们的结合强度26]。然而,在聚乙二醇巨石对面的效果是由于PEG-PEG聚乙二醇蛋白质之间的相互作用和聚乙二醇的巨兽。在分离过程中,保留时间(RT)盯住强烈依赖于聚乙二醇核糖核酸酶的分子量蛋白质(表2),而分子量的PEG接枝的庞然大物只有转变RT轻。这种行为在事实上盯住一个解释分子PEGylation混合物(即。、自由和蛋白结合的挂钩)超过挂钩分子接枝到石门。因此,PEG-PEG聚乙二醇物种之间的相互作用的强度和聚乙二醇庞然大物无论PEG分子量非常相似的支持。另一方面,当钉连接到蛋白质的分子量增加,RT增加(表2)因为PEG-PEG交互的数量增加。

的分离能力,分辨率增加的分子量聚合物附着在庞然大物增加(图2和表2)。盯住在高分子量的庞然大物,PEG-PEG di-PEGylated物种的相互作用与修改后的庞然大物是更广泛的比mono-PEGylated物种的相互作用。因此,di-PEGylated共轭结合强相比,另一个,从而实现更好的分离。

有趣的是,当20.0 kDa聚乙二醇庞然大物是用于分离40.0 kDa聚乙二醇核糖核酸酶A,得到了两座山峰而不是一个,通常预期(图2)。核糖核酸酶的分子量为13.68 kDa [27),因此,不太可能di-PEGylated共轭的形成与40.0 kDa的挂钩,因为位阻。一旦这种规模的PEG链连接到蛋白质,它阻碍了其他氨基酸残基反应与其他分子[挂钩1]。因此,这两个峰值可能对应于亚型的40.0 kDa mono-PEGylated核糖核酸酶A(即。与位置异构,配合)。为了验证这一点,银和我₂-BaCl₂染色的sds - page凝胶的峰值进行了分析。图3表明这两个山峰有相同的概要文件,由于其分子量,对应于mono-PEGylated物种,而不是di-PEGylated物种。保留时间的差异在mono和di-PEGylated物种增加当挂钩MW附着在蛋白增加。例如,聚乙二醇核糖核酸酶的5.0和20.0 kDa,保留时间的不同变化从1.11到1.75毫升,两峰的保留时间的差异在图3(聚乙二醇核糖核酸酶A和40 kDa)只有0.55毫升。因此,可以得出结论,这些峰值对应异构体的物种。蛋白质有几个可用的活性组以来,mPEG可能是绑定到不同的残留蛋白质(1]。聚乙二醇的异构体分离蛋白质早些时候报道使用离子交换色谱法(3,8]。然而,据我们所知,其分离嗝尚未报道。PEGylation往往导致盯住“charge-shielding效应”的连锁店可以减少一些聚乙二醇蛋白质之间的静电相互作用和固定相由于位阻3]。在这项工作中,类似的现象发生:“hydrophobicity-shielding效应”,根据PEGylation网站,疏水相互作用可以改变由于疏水或亲水残基的屏蔽效果。

聚乙二醇核糖核酸酶的分离与接合反应进行了研究。Mayolo-Deloisa等。(4]分离聚乙二醇核糖核酸酶使用CIM C4单片磁盘,他们最好的最高分辨率为1.16,在这部作品中,最佳分辨率达到1.1±0.04。另一方面,Hernandez-Martinez和阿基拉6]也实现了聚乙二醇的分离核糖核酸酶配合使用聚乙二醇琼脂糖6 b。然而,它们的运行时和工作卷至少两倍用于这项工作。

3.4。改善聚乙二醇核糖核酸酶分离

达到一个更好的聚乙二醇物种之间的分离,两个,三个,前面描述的聚乙二醇巨石,被连续色谱系统在不同的配置。4个组合(10 - 20、20 - 1-10-20,和20-10-1 kDa)进行了测试。表3显示了最高分辨率和保留时间获得不同的聚乙二醇的物种。使用2或3的顺序聚乙二醇巨石允许使用更快的体积流率而不会影响保留时间和分辨率。两个流率(1.0和2.0 mL / min)进行了测试,因为这个因素并不影响色谱概要文件(数据未显示),2.0毫升/分钟的流量是用于以下实验。在所有情况下,使用一个以上的聚乙二醇庞然大物增加聚乙二醇物种的保留时间和这个参数没有影响磁盘的顺序放置(图4)。当使用多个修改支持时,聚乙二醇蛋白质之间的相互作用和聚乙二醇支持更大比使用单一磁盘。

使用一个以上的聚乙二醇庞然大物,最高分辨率改善略只有5.0 kDa PEG-RNase反应。这是归因于PEG链长度的不均匀性由于使用聚乙二醇巨石与不同分子量挂钩。20.0和40.0 kDa PEG-RNase轭合物,PEG-PEG相互作用的强度是不一样的支持,因此,蛋白质在不同的时间筛选了诱导更广泛的山峰和减少他们的决议,因为它可以观察表3和图4。此外,当聚乙二醇巨石放在减少PEG分子量秩序,最高分辨率下降。这种现象是因为当聚乙二醇蛋白质释放20.0 kDa聚乙二醇庞然大物,盐浓度不足以将聚乙二醇蛋白质绑定到10.0 kDa聚乙二醇巨石,因此,PEG-RNase物种经过和峰值分辨率降低。

这些最后的实验证据的能力使用两个或两个以上的巨石在高流速没有可见分离行为的变化。在我们的具体情况,提高分离聚乙二醇核糖核酸酶生物技术感兴趣的一个物种或其他蛋白质聚乙二醇,需要使用更大的聚乙二醇PEG分子量相同的巨石。

4所示。结论

正如已经提到的,聚乙二醇的分离和纯化蛋白质在许多生产过程是一个关键的步骤。出于这个原因,不同的色谱支持与不同的测试结果。在这项工作中,小说类型的支持创建和研究:聚乙二醇巨石。由于化学EDA磁盘,可以使用mPEG丙醛PEGylate它们通过显示其还原胺化改性程度取决于长度的mPEG(分子量)。这个反应可以外推到更大的整块材料相同的活性组增加工作流和处理能力。

聚乙二醇巨石是合适的选择分离通过嗝,因为不同的蛋白质:(1)可以使用他们在高流速自动态绑定能力不降低;(2)这些修改支持利用疏水性PEG-PEG聚乙二醇蛋白质之间的相互作用和聚乙二醇庞然大物分离过程中占主导地位;(3)样品制备(在一个合适的缓冲稀释)注射前是没有必要的,这意味着它可以处理更大的样本容量用更少的时间;(4)可以单独聚乙二醇蛋白亚型当桩长链连接到整块石料和蛋白质。另一方面,解决能力,与大型PEG分子量聚乙二醇巨石允许更好地分离聚乙二醇的物种。

这种策略基于聚乙二醇巨石有很大的潜在的分离不仅蛋白质或聚乙二醇的蛋白质,而且其他聚乙二醇分子生物制药或生物技术的兴趣。因此,这是一种机会的研究领域,需要整体结构的优化支持PEGylation反应来实现更高的分辨率能力和推断其使用到其他分子。通过这种方式,一个新的和更有效的平台分离和净化聚乙二醇可以建立蛋白质和其它配合挂钩。

数据可用性

使用的实验数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

Calef Sanchez-Trasvina希望感谢阿隆索Ornelas-Gonzalez和马可Mata-Gomez的技术支持。作者要感谢学院科学和工程学,FEMSA-Biotechnology中心学府de蒙特雷的支持通过生物处理战略焦点小组(0020209 i13)和墨西哥的国家科学技术委员会(CONACyT;项目242286)。Calef Sanchez-Trasvina希望感谢CONACyT,与492276年奖学金的支持。

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