文摘
背景。球蛋白链合成(GCS)分析是用于地中海贫血的诊断。然而,广泛参考范围限制了其作为决定性的诊断工具。它已被证明α和β球蛋白mRNA通过刺激细胞增加interleukin-3 (IL-3)。因此,本研究主要探讨等离子IL-3和之间的关系β/α球蛋白比率。方法。收集血液样本来自32个健康的参与者两次一个月。gc分析、实时PCR和ELISA试验进行确定β/α球蛋白比,球蛋白mRNA表达和稳定汇率,IL-3水平。结果。IL-3水平的基础上,参与者被分成两组。包括一组参与者有显著提高IL-3显示的平均值显著上升α,β,γ球蛋白mRNA,α和β球蛋白、红细胞和血红蛋白。另一组包括参与者IL-3水平没有区别上述参数无显著变化。结论。这项研究的结果表明,IL-3有着积极的影响α和β球蛋白链的合成。因此,IL-3水平不解释的参考范围宽α/β球蛋白比率。
1。介绍
地中海贫血是一个在伊朗最常见的遗传性疾病。为了限制新病例的出现主要β地中海贫血,卫生当局正在开发一个国家项目准确诊断不同类型的地中海贫血。有超过200个基因突变,地中海贫血有不同的临床表现从无症状到严重的疾病。目前,尽管这一事实DNA地中海贫血分析提供有用的信息,它不能单独使用作为一个决定性的诊断工具。这是因为疾病包括未知的缺失和突变,突变基因调控网站,和基因突变产生trans-elements球蛋白基因表达(nonglobin基因相关的地中海贫血)。在某些情况下,球蛋白链合成所需的诊断,因为它使各级监测基因表达,包括转录(信使核糖核酸生产),一代的稳定信使核糖核酸,在核糖体翻译(1]。球蛋白链合成进行了确定α/β球蛋白比,球蛋白生成的所有中间阶段(从没有一代信使核糖核酸或不稳定信使核糖核酸没有翻译在核糖体)控制。因此,本次测试的结果表明球蛋白基因的最终效率和诊断非常有价值。然而,参考范围宽(2,3),由于生理变化的更大的影响力与方法论的变化(2,4),限制了这种方法的使用作为一个决定性的和最终的诊断工具。为了解决这个问题,有必要研究生物上球蛋白链合成物质的影响测试结果。
先前的研究已经表明,interleukin-3 (IL-3)可以改变球蛋白链合成,进而影响翻译的水平。这样,IL-3生成胎儿血红蛋白通过其刺激作用α球蛋白和γ球蛋白链合成(5]。
IL-3是淋巴细胞、上皮细胞和星形胶质细胞分泌细胞因子。IL-3分子有糖蛋白抗原的结构和生成结果或促有丝分裂的刺激。它会影响血液细胞和其他细胞的繁殖和分化通过特殊受体(6]。Ras途径IL-3能促进红细胞生成的激活,导致细胞凋亡控制和Jak2 / stat5级联,并通过刺激DNA合成(7]。
血红蛋白分子结构复杂,分子结构导致的组件是通过复杂的协调机制。然而,协调代链导致血红蛋白的结构取决于其他因素,包括血铁水平,铁蛋白浓度、转铁蛋白受体,细胞因子浓度,血红素浓度(8]。此外,蛋白质亚基的生成导致血红蛋白结构协调的产生率α链几乎非的方法α链。这个过程可以防止细胞损伤的增加水平的一种链但在地中海贫血是中断。
本研究旨在调查IL-3的具体影响α球蛋白mRNA和β球蛋白mRNA稳定,α球蛋白和β球蛋白生产、的范围α/β球蛋白比,假设抗原和促有丝分裂的刺激会导致血液中不同浓度的IL-3在不同的时间(影响稳定的排斥信使rna球蛋白的生成α和β链)。
2。材料和方法
收集血液样本来自32个健康的参与者,一个月两次。参与者被分为两组基于IL-3水平。组1包括参与者在IL-3水平有显著提高,和第二组包括参与者显示没有改变或减少IL-3水平。
入选标准基于血液样本分析如下:MCV > 80 fL,妇幼保健> 27 pg,总铁的正常水平,TIBC,铁蛋白,正常血红蛋白电泳。之前所有的参与者提供书面,知情同意参加这项研究。
全血细胞计数(CBC)进行了测试使用Sysmex kx - 1000设备和血红蛋白电泳进行醋酸纤维素。总铁浓度和使用比色法测定TIBC和铁蛋白水平(Darman Kav co .)工具包)和ELISA方法(Padtan-Teb公司装备),分别。
在研究开始的一个月后,球蛋白链合成,实时PCR和ELISA试验进行确定α/β球蛋白比率(球蛋白链代),球蛋白mRNA表达和稳定速度,分别和IL-3水平。
因此,克莱格方法9)是用于球蛋白链综合确定α/β球蛋白比率。球蛋白链分析是通过使用Mono-S离子交换柱和高效液相色谱法(HPLC)设备(2]。
IL-3浓度使用ELISA方法测定(研发公司装备!不。765250.1)。
实时PCR用于调查的表达式和稳定性α球蛋白mRNA,β球蛋白mRNA,γ球蛋白mRNA,(10- - - - - -12]。首先,信使核糖核酸纯化,互补脱氧核糖核酸生产,实时PCR进行。使用连续稀释的标准图形构造互补脱氧核糖核酸健康人样本,以确定每个基因PCR的效率,包括α球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白的基因,GAPDH参考基因。
三试剂(σ,DB)被用来净化信使核糖核酸,一直在水里含有焦碳酸二乙酯(DEPC)。验证的质量信使核糖核酸,260和280纳米波长的光吸收测定使用Nanodrop光谱仪(Implen,慕尼黑,德国)。纯化样品的光学吸收的平均值为2.02。试剂盒工具包(猫。205311号)被用于制造互补脱氧核糖核酸。实时PCR测试使用ABI 7300执行序列检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。的寡核苷酸引物α,β,γ球蛋白基因和GAPDH参考基因设计引物表达软件版本。3(应用生物系统公司,培育城市,CA)。引物的特异性序列被确认在NCBI /爆炸数据库的搜索。引物的特点如表所示1。
在确定的最佳浓度互补脱氧核糖核酸,为了避免二聚体引物的生成,一个实时PCR试验进行了特殊板块,以确保最佳的反应和引物的浓度。对于每一个反应,溶液的体积25毫升。解决方案的内容如下:电力SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司、英国),12.5毫升;α,β,γ引物3 pmol;GAPDH引物5 pmol;水,6.5 7毫升;和互补脱氧核糖核酸,25 ng。测试是所有四个基因在两个同时进行系列和平均Ct计算为每个基因。
下面的时间表是用于实时PCR测试。
第一个周期在95°C进行了10分钟,达到表达的主要分离模式互补脱氧核糖核酸。接下来,两个热时间表是重复40周期:95°C为1分钟15秒和60°C。
每完成生殖阶段,分离步骤融化曲线进行了分析:95°C 15年代,30年代60°C, 90°C 15 s。
确定繁殖效率(11,12的α,β,γ球蛋白基因和GAPDH参考基因,连续稀释的互补脱氧核糖核酸样本的研究参与者准备和实时PCR测试进行了分别使用不同的引物和不同浓度。最后,一个标准的图形绘制了四种基因部分。所有四种基因的PCR效率计算通过测定标准曲线斜率和来自以下方程: 当足以允许的使用效率方法(表2和图1),实时PCR测试进行α,β,γ球蛋白参与者的样本和基因GAPDH参考基因。复制完整的时候,画一个图表每个PCR反应,基于Ct(数字2和3)。一个指数计算出样品的标准,研究推导的平均Ct目标参考基因的基因和导致的因素,这是由以下方程: 最后,的表达率α,β,γ球蛋白确定使用公式。
根据研究目标和假设,结果分析,使用SPSS版本编译和解释。16(美国SPSS,芝加哥,IL)。
3所示。结果
IL-3水平的基础上,参与者被分成两组。其中一组包括15个参与者有显著提高IL-3后一个月,另一组包括17名参与者或减少IL-3水平没有差异。
表3显示结果的均值±标准差和证明,所有的参与者没有正常的MCV和妇幼保健价值和缺铁的证据。
Kolmogorov-Smirnov测试用于测试的分散研究变量,以下变量的平均值和统计分析和比较:α球蛋白mRNA,β球蛋白mRNA,γ球蛋白mRNA,α球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白,α/β球蛋白比例铁蛋白,红细胞,血红蛋白,IL-3,网织红细胞计数。表4总结了的结果。遵循正态分布的变量。因此,一个配对以及用于比较变量之间的组织。在组1(参与者与IL-3增加),平均的值α球蛋白mRNA,β球蛋白mRNA,γ球蛋白mRNA,α球蛋白,β球蛋白,红细胞,血红蛋白,IL-3都增加了超过一个月的学习。增加是很有意义的α球蛋白mRNA,β球蛋白mRNA,γ球蛋白mRNA在90%的显著性水平和血红蛋白,红细胞,IL-3在95%的显著性水平。在组2,IL-3显示的平均浓度减少一个月后,95%的显著水平。使用成对的参数研究以及,没有表现出显著差异之间的两个测试步骤的重采样间隔一个月。健康的参与者,在目前的研究α/β球蛋白率范围是0.74 - -1.31,同意与最近的研究的结果(2,3]。
4所示。讨论
许多研究表明,转录控制机制调节基因的表达,和最近研究证实转录后的的重要性在真核基因表达的调控机制1]。增加信使核糖核酸阅读的核糖体(13),增加保护蛋白质产生退化机制(14,增加稳定性信使核糖核酸翻译水平变化是可能的机制。先前的研究表明,除了增加转铁蛋白受体(CD71),α球蛋白mRNA和β球蛋白mRNA通过刺激细胞增加IL-3。这归因于稳定的增加α球蛋白mRNA和β球蛋白mRNA分子(5]。
铁蛋白水平的下降与增加IL-3组1本研究可以归因于增加CD71受体以及增加IL-3 (CDw123)受体。铁蛋白水平的减少可能是由于铁产生血红素分子要求。CD71受体和CDw123网织红细胞受体的存在已被证实(5]。它也表明,CD71受体数量的增加随着IL-3浓度增加(5]。这可能发生,因为增加球蛋白mRNA将导致提高翻译水平。此外,由于血红蛋白分子的生成需要一个血红素组件,CD71受体的数量将会增加,使血红素分子的生成。
血红蛋白生成的复杂的过程依赖于许多因素,包括血铁水平,铁蛋白浓度、转铁蛋白受体,细胞因子(IL-3和IL-9)浓度,血红素浓度、造血GTPase RhoH所需调整的信号影响IL-3 [15),和CD133的存在与否红细胞表面的细胞。这些因素导致成年细胞反应IL-3更强烈激活红细胞生成(16]。很难解释为什么的参考范围α/β球蛋白比率是如此广泛和未来综合研究需要回答这个问题。最近的研究表明,IL-3受体的表达,以及信号传感器和转录(STAT)活动的催化剂,是调整的影响下GTPase RhoH,进而导致IL-3信号的调整(15]。
这项研究的结果α/β球蛋白比率意味着因为IL-3相当于有积极影响的一代α球蛋白和β球蛋白,它不可能是潜在的广泛的生物因素α/β球蛋白比率球蛋白链合成测试。
同意
签署知情同意参与这项研究获得。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者感谢同事在生物化学,分子医学部门,和免疫学的伊朗的巴斯德研究所的合作项目。他们还想特别感谢提供参与者的合作在这个项目。