的能力荚膜组织胞浆菌堆肥过程中生存

文摘

荚膜组织胞浆菌(h . capsulatum)thermal-dimorphic真菌,组织胞浆菌病的因果代理。其在环境与鸡粪由于他们的氮和磷含量高。在哥伦比亚,鸡粪堆肥过程中是最常用的原料;然而,没有信息的能力h . capsulatum生存和继续生存在一个堆肥有机肥料。为了解决这个问题,本研究显示了三个基于微生物化验文化和Hc100嵌套PCR。首先,堆肥反应器系统旨在改变有机物质在实验室条件下,原料与真菌接种。从这些反应堆,真菌并不是孤立的,但它的DNA检测。在第二个测定,样品从工厂真菌以前检测到的DNA PCR进行了分析。在原材料样品,3的殖民地h . capsulatum被孤立,其DNA检测。然而,在堆肥过程中,真菌是恢复了文化和DNA检测。第三分析,消毒和nonsterilized有机堆肥样品注射h . capsulatum然后评估期间每月一年。在这两种类型的样本,真菌DNA检测到Hc100嵌套PCR在整个一年,但真菌只从无菌样品在前两个月评估。一般来说,化验的结果表明h . capsulatum不能生存一个全熟堆肥的过程。

1。介绍

荚膜组织胞浆菌(h . capsulatum)是一个热双晶的真菌和因果代理组织胞浆菌病。在其自然栖息地或培养约28°C,它像一个增长缓慢的模具3到6周恢复的文化。的模具形式h . capsulatum薄透明有隔膜的菌丝,结核性的macroconidia测量在7到15μ米直径,薄壁microconidia测量2到6μm。microconidia和菌丝片段构成了传染性微粒。当真菌暴露在温度约37°C,是发生在哺乳动物宿主或在实验室条件下,酵母真菌变成测量2到4μ米直径(1- - - - - -3]。

h . capsulatum栖息多孔土壤与高浓度的磷和氮,有一个很大的有机质含量和酸性博士的气温22日和29°C之间,年降水量1000 - 1200毫米左右³相对湿度在87%至67之间。这些特征发生尤其是土壤富含鸟类和蝙蝠排泄物。当一个环境污染的h . capsulatum打扰,感染性粒子雾化,然后吸入可能主机(4- - - - - -7]。在主机内,真菌变成酵母。组织胞浆菌病的发展取决于几个因素,如接种体大小、真菌的毒力,以及宿主的免疫状态和肺条件。感染h . capsulatum可无症状,急性(流行),慢性或成为致命取决于这些因素之间的相互作用。此外,在暴露于真菌,人们可能会经历一个潜伏性感染,可以被重新激活。人重新激活潜伏的风险组织胞浆菌病包括移植受者,血液恶性肿瘤患者,那些接受皮质类固醇治疗,或晚期的患者感染人类免疫缺陷virus-acquired免疫缺陷综合症(艾滋病)1,8,9]。组织胞浆菌病诊断通常是在城市和农村地区和可能影响农民、园丁、管家、建筑商、探险家、洞穴学者,考古学家。从事这些职业的人更倾向于感染h . capsulatum;因此,组织胞浆菌病已被分类为一种职业和娱乐疾病(10- - - - - -13]。

第一个隔离h . capsulatum从土壤被埃蒙斯报道1949年,维吉尼亚州(美国)。在这个研究中,387个样本进行测试,只有两个是阳性h . capsulatum(14]。后来,Ajello [15研究了生态之间的关系h . capsulatum和不同地方的病人诊断为组织胞浆菌病生活和发现25%的阳性样本包括土壤含有家禽粪便(15]。相反,土壤样本没有家禽粪便是积极的只有7%。这些结果,得出结论,鸡舍有利于真菌的存在(15]。此外,其他研究描述的隔离h . capsulatum从相关网站大量的鸟类和蝙蝠的粪便在附近等脏地板,农场,旧水塔、矿山、树洞、废弃的建筑物,堆肥肥料、洞穴,和被遗弃的机库16- - - - - -22]。

尽管许多研究都已经进行搜索h . capsulatum从不同的地理位置,土壤是知之甚少的能力h . capsulatum堆肥过程中生存。此外,没有信息真菌可以保持多长时间可行的富含有机质的衬底。虽然是缺乏知识关于这个主题h . capsulatum疫情的记录,与鸡粪等基质富含有机物的处理或有机肥料。例子包括报告的疫情Medellin-Colombia Acapulco-Mexico,在这两种情况下,感染源是室内植物含有肥料富含鸡排泄物(11,23]。其他相关疫情的鸟类排泄物,如疫情发生在密歇根的纸业公司和疫情发生在阿根廷,与一个机库空军基地(22,24]。这些疫情显示的特点h . capsulatum有亲和力与封闭和废弃的空间有大量鸟类和蝙蝠排泄物。这些报告也证明能力的真菌感染哺乳动物进入或生活在这些受污染的地区。

在哥伦比亚,h . capsulatum也已经从环境样品分离。蒙等人4%的土壤样本中分离出的真菌蝙蝠和鸟类居住的洞穴在力拓色味俱淡的地区(Antioquia-Colombia)。收集的样本之间的过渡区潮湿的热带雨林非常潮湿的热带雨林的年平均降水量3200毫米³,相对湿度80%,平均温度24°C。这些都是常见的特征描述h . capsulatum栖息地(5]。

德等。1218]聚集信息组织胞浆菌病暴发发生在哥伦比亚,在1970年至1997年之间,和确定位置代表的首选栖息地真菌。根据他们的结果,与拆迁有关的活动,清洁的建筑物,日志,去洞穴与组织胞浆菌病暴发有关(12]。2002年,吉梅内斯等人报道一个额外的哥伦比亚爆发组成一个家庭后感染一个家庭成员一个包含污染鸡粪有机肥处理h . capsulatum从当地的幼儿园11]。

哥伦比亚家禽行业正经历着持续增长,这创造了需要寻求替代排泄物的处理。例如,在2018年,增长了6.7%的生产肉鸡和表鸡蛋(25]。这种日益增长的结合需要恢复农业生态系统的有机物质(26生成一个集约化生产有机肥料由家禽粪便,必须稳定和消毒。堆肥是最常用的稳定过程27]。

有机肥料在哥伦比亚主要是由家禽粪便,这些肥料用于恢复贫瘠土壤的肥力。这些产品都是由堆肥过程提供肥料的化学和生物稳定(26]。堆肥是一个自发的有氧活动过程,分解有机物的分解器真菌和细菌等微生物。这个人口众多的腐生的微生物互相争夺空间和营养,最终把有机物转化为无毒素和病原体(消毒衬底的28- - - - - -31日]。堆肥后,得到的材料为土壤调节具有重要的物理化学特征,包括pH值稳定、充足的水分和养分(氮、磷、钾)浓度在1%以上(26]。

因为繁荣的堆肥有机肥料的生产和使用在哥伦比亚,农业部和ICA生成的政策处理的有机肥料,是包含在2003年的150号决议(32]。这一政策轮廓的参数的技术监管肥料和土壤调节剂和定义了有机肥料的物理、化学和微生物变量包含在哥伦比亚技术标准5167 (NTC) (33]。微生物的研究是寻找的目标沙门氏菌spp,兼性嗜温菌,肠道菌和真菌;文化媒体如Sabouraud或马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)用于后者的目的。h . capsulatum不搜索,很难从这些媒体,因为这种真菌生长缓慢恢复(3 - 6周);因此,快速增长的环境细菌和霉菌克服h . capsulatum在大多数情况下。

家禽粪便支持的增长h . capsulatum由于其高含量的磷和氮也因为它是许多有机肥料的原料生产,我们建议这些肥料可能代表的一个重要来源h . capsulatum感染。然而,基于禽粪便有机肥的作用的一个潜在来源h . capsulatum感染对堆肥工人、管家、园丁、和那些参与这些产品的生产和使用并没有得到充分的研究。同样,长寿的h . capsulatum在化肥生产这种材料是未知的。本研究旨在确定的能力h . capsulatum生存堆肥过程,调查其在堆肥有机肥料长寿。

2。材料和方法

2.1。剂的h . capsulatum

荚膜组织胞浆菌隔离13180年从支气管肺泡灌洗获得样本提供的一个病人医疗实验真菌学单位参加,在营救过程对位Investigaciones Biologicas (CIB)。隔离是在室温下保持在菌丝体的阶段,使每三个月管包含新鲜Mycosel琼脂(洗液™^;ref。211462。美国新泽西富兰克林湖)。

对于每个实验,培养液是由培养真菌在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(洗液™;ref。213400。美国新泽西富兰克林湖)其次是孵化25°C 14天。潜伏期之后,3毫升无菌0.85%生理盐水含有0.01%渐变80(σ,裁判P4780。圣路易斯,密苏里州,美国)添加到文化管。刮了空中菌丝接种循环,和产品的洗涤是存入无菌烧杯。菌落的数量每毫升(CFU /毫升)是由镀在重复Sabouraud葡萄糖aAgar(洗液™;ref。211584。美国新泽西富兰克林湖),200μl每个系列稀释1:10,1:100年,和1:1000。堆肥样品被人为污染通过添加5毫升剂解决方案/ 10 g的样本。

2.2。堆肥反应器系统

的h . capsulatum堆肥过程是生存能力评估在小型堆肥系统设计允许控制条件。mesophilic-type堆肥过程中执行玻璃瓶,是反应堆,有机质的自然改变了整个45天只有衬底(图中的土著微生物存在1)。

系统由两个玻璃瓶(反应堆)与4升容量。每个反应堆都有橡胶帽允许软管通过两个洞。一个软管连接到一个气泵允许曝气的有机质和其他软管允许气体释放到消毒剂溶液(次氯酸盐5000 ppm)避免感染性粒子的毒素到环境中。每个反应堆都有一个网格底部,防止粘结的有机物,实现同质衬底的曝气。

2.3。的堆肥基质

鸡粪和锯末混合在一个1:1的比例。六百克的这种混合沉积在每个反应堆(玻璃瓶)。一个反应堆的培养液接种300毫升h . capsulatum第二个反应器接种同样体积的0.85%无菌生理盐水。两个反应堆都位于在生物安全柜3级。20毫升无菌0.85%生理盐水被添加到每个反应堆每两天,手工摇动使有机质的曝气。45天之后,有机物质被认为是一个稳定的产品,和控制反应堆内容分析了根据5167年全国过渡委员会参数确认产品是完全改变了。产品在反应器接种h . capsulatum分析如下:反应堆瓶划分根据深度;表面,5厘米,10厘米和15厘米深度,分别和每个深奥的衬底被放到一个容器下游使用Hc100嵌套PCR分析,和Mycosel文化如下描述。

2.4。从堆肥物料中提取DNA

土壤®FastDNA旋转工具(MP生物医学,圣安娜、钙、美国)被用来从堆肥中提取DNA化肥使用制造商的指令做了一些调整。短暂,提取使用后得到的上层清液暂停执行10 g的堆肥样品在30毫升含有抗生素80二层的0.001%和0.1%的生理盐水(庆大霉素和青霉素)。悬架是搅拌1分钟,并且允许接受20分钟。这个过程重复两次。最后搅拌后,悬架被允许坐直到最大的粒子被解决。接下来,上层清液收集DNA提取。其他修改包括试剂样品之间的接触时间增加和工具包。

2.5。Hc100嵌套PCR

Hc100嵌套PCR试验在堆肥肥料进行描述之前,戈麦斯et al。34]。

两套特定PCR引物h . capsulatum使用(一对外部引物Hc我⟶5′GCG TTC CGA GCC TTC CAC CTC AAC-3′和Hc II⟶5′atg TTC猫CGG GCG 20 TGT AGT-3′和一对内部引物Hc三世⟶5′gag ATC标签TCG CGG CCA GGT TCA-3′和Hc IV⟶5′gg AGA棉酚CTG答CGG TGG三大总部′),由先前的调查设计(35]。这些引物扩增片段的单份基因编码一个100 kDah . capsulatum蛋白质(36]。外部引物扩增391 bp的片段,而内部引物扩增210 - bp碎片。这个放大产品的存在被认为是积极的h . capsulatum。引物被集成的DNA合成技术(美国IA IDT,珊瑚镇)。

2.6。h . capsulatum生存能力的有机肥料

的能力h . capsulatum生存在一个有机堆肥肥料生产从鸡粪中评估堆肥鸡粪的样品是符合5167年全国过渡委员会所描述的条件33),和浓度的氮、磷、钾(氮磷钾)1%以上。堆肥样品分为两个部分,一个在121°C 15分钟消毒,另一个是为下游分析保留。两样本整除成26份50毫升10 g的锥形管。5毫升的h . capsulatum剂的解决方案是添加到每个管。52污染管被用来评估真菌的生长在无菌和未杀菌的样本。从天0,15、30、45、60、90、120,150,180,210,240,270,到300年,从样品中提取的DNA检测h . capsulatum使用Hc100嵌套PCR,部分样品受到Mycosel文化。

2.7。h . capsulatum坚持在堆肥工厂

样本发送给Grupo Interdisciplinario de Estudios分子(GIEM),化学学院,学院准确、自然科学,安蒂奥基亚省大学德,谁有许可接受Agropecuario (ICA)通过124号决议00005865于5月19/2017执行物理、化学和微生物分析有机肥料、土壤改良剂、有机肥料和氮源。

在早期的研究中,Hc100嵌套PCR用于检测h . capsulatum在堆肥有机肥料;阳性的肥料制造商h . capsulatumDNA新联系的一部分本研究调查的持久性h . capsulatum在这些工厂34]。制造商被要求提供两个样品之间的500 g和1000 g的材料来自相同的堆肥堆,代表不同的时期:第一与堆肥过程的零天(即。原材料的混合堆肥之前),第二个端点的过程(即。转换后的产品)。这些样本检测的存在h . capsulatum使用嵌套PCR Hc100 Mycosel琼脂和文化。

2.8。检测h . capsulatumMycosel琼脂培养

文化是使用后得到的上层清液暂停执行10 g的样本在30毫升无菌生理盐水(0.85%)包含0.001%渐变80(σ,裁判P4780。圣路易斯,密苏里州,美国),100 pg / ml氧四环素(可卡利、山谷、坳),和0.1%的抗生素(庆大霉素、青霉素)。悬架是搅拌1分钟,并且允许接受20分钟。这个过程重复两次。最后搅拌后,悬架被允许来解决。收集得到的上层清液,连续稀释进行(1:1:10日100年,1:1000),和200年μ每个稀释的l是镀在重复Mycosel琼脂。文化在两个月后,在室温下孵化和文化观察5天,10、15、30、45、60,寻找h . capsulatum兼容殖民地。

2.9。确认殖民地兼容h . capsulatum

殖民地一致h . capsulatum是棉的,提高,锋芒毕露的,白色,奶油或浅咖啡,生长缓慢。怀疑是每个殖民地h . capsulatum亚文化在新鲜Mycosel琼脂板与乳酚蓝为随后的显微镜检查,观察特征兼容h . capsulatum即。,thin septate hyaline hyphae, thin-walled microconidia, and tuberous macroconidia. Colonies with compatible features were subcultured in brain heart infusion agar (BHI Agar, BBL^™;ref。211065。美国新泽西富兰克林湖)补充1%葡萄糖(σ,裁判G5400。圣路易斯,密苏里州,美国),0.001%半胱氨酸(σ,裁判c - 7755。圣路易斯,密苏里州,美国),5%实际上血,然后是文化在37°C 5%孵化有限公司₂大气证据转换进入酵母相。

3所示。结果

3.1。反应堆的设计和装配系统

反应堆系统的效率将有机物转化为稳定的产品是评估在接种前的原材料h . capsulatum。曾经在反应器堆肥过程完成后,分析了产品根据5167年全国过渡委员会设定的参数。最终,最终产品被发现含有氮(N)、磷(P)和钾(K),水平超过1%,与5167年全国过渡委员会提供的参数一致。

5随后进行了化验飙升的原材料(锯末+家禽)量化h . capsulatum剂的解决方案。的试验,真菌不是孤立在Mycosel媒介文化;然而,在所有反应堆产品的遗传物质h . capsulatum被检测到。表1总结了每个实验的结果。

3.2。h . capsulatum生存能力的有机肥料

在这项研究中,整除无菌和nonsterilized堆肥样品污染h . capsulatum分析了在不同的时间点。Mycosel培养基的微生物研究在所有样本都nonsterilized消极,积极与不同的cfu无菌堆肥样品。相比之下,Hc100嵌套PCR阳性的结果在所有样本,无菌和nonsterilized。表2结果说明了h . capsulatum在不同的样品处理的日子复苏。

3.3。h . capsulatum坚持在堆肥工厂

五个公司联系的h . capsulatum持久性同意参与研究。

共有56个样本分析文化Mycosel和Hc100嵌套PCRh . capsulatum搜索。从这些,33(59%)样本原料,和23(41%)样本转换堆肥产品的过程。从工厂的样本1,3,5,无论是h . capsulatumMycosel文化隔离,而它的DNA没有Hc100嵌套PCR检测到的。相反,h . capsulatumDNA检测到Hc100嵌套PCR在原始样本工厂2和4和一个堆肥样品从工厂4。有趣的是,只有从一个工厂的原始样本2 (F2),真菌的三个殖民地成功种植在Mycosel文化(表3)。

3.4。确认殖民地兼容h . capsulatum

殖民地兼容h . capsulatum从Mycosel文化经显微观察。此外,所有h . capsulatum殖民地变成了酵母阶段获得成功。

从其他真菌属殖民地被识别和丢弃。属最常见Chrysosporiumspp。Sepedoniumspp。曲霉属真菌spp。青霉菌spp。枝顶孢属sp。Chrysoniliasp。木霉属没有孢子形成sp.等模具。此外,酵母不同属殖民地也被孤立。这些措施包括假丝酵母spp。红酵母属spp。,地丝菌属spp。一些细菌菌落也讲究的,虽然没有试图确定这些。

4所示。讨论

这项工作的结果表明全熟堆肥过程结果的有机肥料免费h . capsulatum。尽管h . capsulatumDNA可以使用Hc100嵌套PCR检测出来,这种DNA的基因指纹真菌。

决定的能力h . capsulatum在堆肥过程中,执行了三个化验。第一个试验是获得一个堆肥产品在实验室条件下进行的,5167年(NTC)[见过哥伦比亚哪条规定33]。一旦全熟堆肥过程成功获得5进行了进一步的实验产生的堆肥产品,涉及接种它包含生活解决方案h . capsulatum。最后的堆肥产品的分析后,可行h . capsulatum不能分离的Mycosel文化。然而,分析Hc100嵌套PCR显示阳性结果几乎所有反应堆的深度分析。因此,检测h . capsulatumDNA在几乎所有深度的实验室反应堆系统显示环境中的真菌分布的异质性。

在第二个实验中,五个堆肥公司提供开始和结束时采集到的样本的堆肥过程(表3)。h . capsulatumDNA检测的原材料来自工厂2和4,从一个堆肥样品从工厂4。此外,一个可行的真菌是成功孤立文化从原材料工厂提供的2。对于工厂发送的样品1,h . capsulatum可行的真菌的DNA没有检测,隔离并没有实现,尽管大量的材料化验和真菌堆肥产品中被发现。这个结果可能是由于控制策略,该公司实施以来的初始检测真菌,提高最终产品的质量和卫生安全。一般来说,这个试验有一个行为类似于先前描述;积极性高的原材料与堆肥的不同(34]。不幸的是,没有其他类似的作品比较本研究结果所示。

重要的是要注意,检测的h . capsulatum遗传物质在有机肥料在过程开始和结束的时候,此外,隔离的h . capsulatum文化从原材料带领我们发出警报的存在h . capsulatum在堆肥过程的开始。因此,重要的是要鼓励使用保护措施的人参与的生产有机肥料,也强调公司的协议,我们先前报道(34];最好是通过定期检查使用Hc100嵌套PCR,的存在h . capsulatum在原材料和最终的堆肥产品。最终,在堆肥过程中常规筛查可以避免感染的人h . capsulatum和减少疫情的发病率37]。

具有挑战性的隔离h . capsulatum使用直接的文化特征,从环境样品和其他热双晶的人类真菌病原体形成类酵母菌皮炎芽生菌和Paracoccidioidesspp。尽管数据的特点,它们的栖息地,如气象参数和土壤的化学特性,他们居住或感染的可能来源,所有试图把它们与环境没有成功(38- - - - - -41]。

另一个常见的困难与隔离h . capsulatum使用培养基是真菌的分离具有类似特征的观测以来的真菌有起毛的殖民地,白色米色,结节macroconidia不保证h . capsulatum被恢复。h . capsulatum可以和其他fungi-like形态错了吗Sepedonium种虫害结核macroconidia或Chrysosporiumspp,产生microconidia相似h . capsulatum;在这些情况下,有必要确定诱导转化酵母相(42,43]。考虑到隔离的h . capsulatum使用Mycosel文化是耗时,并且需要一个熟练的观察者,Hc100嵌套PCR的搜索成为一个优秀的替代品h . capsulatum在环境样品。

在第三个实验,实验建立的可行性h . capsulatum在一个有机肥料和观察到的恢复h . capsulatum从无菌样品天0,15日,30日和45 postinfection是2400,22000,37600,和7800 CFU /毫升。CFU /毫升的量h . capsulatum建议增加与最初的培养液。较高的增长可能是由于高压灭菌法灭菌的过程,导致两种不同的效果:一是土壤的水解导致高pH值显著增加,没有₃- n, NH-N,可推断出的镁、锰、铁、死,另一个是土壤的生物群体。这两个效应有利于营养和增长没有竞争对手。埃蒙斯描述进行研究后相似的结果h . capsulatum接种于无菌样品富含腐殖质的土壤,然后他注意到真菌生产macroconidia自由遍布。考虑到h . capsulatum有能力扩散在无菌土壤有机质含量高,我们到达了隔离的真菌从原始Mycosel鸡粪利用传统文化,这将是有趣的开发一个特定的和丰富的媒体文化有机质提高隔离的基础上吗h . capsulatum从环境资源(14,44]。

开始这项研究,实验进行标准化培养液的大小(结果未显示)污染环境样品h . capsulatum。在这些试验中,我们观察到,恢复文化真菌培养液高于40000 CFU /毫升h . capsulatum是必要的,相比之下的DNA从三个细胞h . capsulatum需要检测的Hc100嵌套PCR (34]。同时,我们观察到这些文化的众多的生长环境样品模具Chrysosporiumspp。Sepedoniumspp。青霉菌spp。曲霉属真菌spp。木霉属spp。,地丝菌属spp。这些模具也已经在其他的研究报告。这些真菌的分离表明他们的栖息地h . capsulatum作为空间和营养的强劲的竞争对手;这个因素影响h . capsulatum生存的土壤,而且它的复苏传统文化传媒(43]。在与堆肥过程,因为这是一个分解的过程中涉及多个微生物如真菌、细菌、放线菌、隔离的h . capsulatum从给定的样本是非常困难的,这些微生物增长速度和数量多h . capsulatum(45,46]。

这项研究的结果指出了使用重要性Hc100嵌套PCR等分子工具由于分离困难h . capsulatum从土壤样品在文化47]。这使我们相信大多数的研究报道h . capsulatum在低百分比从土壤样品并没有反映出真实的数据可能被感染的地方(6,7,10,14,48,49),这对公众健康产生重大影响的真正来源感染没有确定性。

此外,在哥伦比亚、组织胞浆菌病的速率计算在0。6例每100.000居民基于出版物、疾病报告,和哥伦比亚人口的估计,但众所周知,这个速度是低估了50因为这个疾病没有强制性的报告。在其他国家,古巴,1996年通过2号联合决议,他们认识到组织胞浆菌病作为一种职业病,强制要求通报卫生权威。呼吁卫生监管部门是很重要的在哥伦比亚需要实现一个模型组织胞浆菌病的监测类似于由古巴实现。

5。结论

在结论中,基质富含有机质h . capsulatum理想条件的维护。因此,h . capsulatum是社区的一部分存在的生物原料,改变了堆肥过程中,这是不可否认的,这种真菌的存在以来的过程。因此,为了避免疫情和案例h . capsulatum内,这是至关重要的促进堆肥工厂推荐的预防措施的实施疾病控制和预防中心(CDC)保护工人和也充分执行确保卫生处理的堆肥过程的最终产品(37]。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢参与者研究小组的成员为他们的反馈和改进建议。作者感谢乔尔Barratt英语编辑的手稿。本研究支持了拉西对位el Desarrollo de la Investigacion (CODI)的安蒂奥基亚省大学(2014 - 1010年项目代码,2014)和Departamento Administrativo de Ciencia Tecnologia e Innovacion (COLCIENCIAS),波哥大,哥伦比亚,国家博士学位项目(647年宣布,2014)释放。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

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