退化草场重氮营养细菌群落

摘要

牧草退化可引起重氮营养细菌群落的变化。因此，本研究旨在评估可培养重氮营养细菌群落和总重氮营养细菌群落，与根际和根的区域相关Brachiaria decumbensStapf。不同退化阶段的牧草。根系和根际土壤样品分别采集于轻度、部分和高度退化草场。利用McCrady’s table得到每克样本中细菌的最大可能数(MPN)，以确定种群密度，计算Shannon-Weaver多样性指数。采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术测定了重氮营养总细菌群落的多样性nifH基因，可培养重氮营养细菌的多样性通过聚合酶链反应(BOX-PCR)技术测定。在降解阶段的增加b . decumbensStapf。放牧并没有降低重氮营养细菌群落的种群密度，表明任何程度的严重降解对细菌都是高度有害的。总重氮营养细菌群落结构与b . decumbensStapf。被草场退化阶段改变，表明细菌对改变的环境具有较高的适应能力。

1.介绍

在巴西，大约有1.8亿公顷的牧场，绝大多数牧场都有该属的物种Brachiariaspp。1］．在该国进行的诊断发现，70%的牧场处于某种程度的退化[2］．各种因素导致这些草场的退化,如种植区域的管理不足,使用饲料物种适应edaphoclimatic条件,降低土壤肥力,造成水土流失,土壤养分的固定和提取转换成[动物源性食品3.］．

在作物-畜牧生产系统中使用新技术已经具有相关性，有助于更可持续的系统，使管理能够降低牧场的退化和对土壤的影响，并最大限度地减少对与植物相关的有益微生物群的损害[4.那5.］．这些微生物，尤其是虚拟营养细菌，具有固定大气N的能力，并溶解无机磷酸盐，重新建立土壤肥力并降低使用化学肥料引起的负面影响，除了促进植物生长[6.那7.］．

重氮营养细菌可与许多植物结合[8.]，使他们对不同类型的压力有高度的抵抗力[9.］．尽管这些细菌在牧草栽培系统中的重要性已被普遍承认[1]，这些微生物与这些不同管理制度下的植物之间的相互作用尚不清楚[10］．尽管如此，对不同环境中细菌群落的功能beta多样性的比较研究，一直被用作指示生态系统中生物和非生物现象的稳定性的参数[11那12］．

因此，本研究旨在评估根际和根内生生态位中可培养和总重氮营养细菌群落的密度和多样性b . decumbensStapf。不同退化阶段的牧草。

2.材料和方法

2.1。植物收集遗址及根流层土壤样品及牧草管理特征

在牧草退化的3个阶段(高度、部分和轻度)采集植物和根际土壤样品。牧场是由b . decumbensStapf。种植在Riacho do Papagaio农场，在São João市，伯南布哥州，巴西(08°52 ' 30 " S和036°22 ' 00 " W)。市区海拔716米[13］．

根据伯南布哥水和气候署的数据[14)，年平均雨量780毫米，雨量最多的四个月为五月至八月。根据Beltrão等人的研究，该地区年平均气温为21.1°C，气候类型为Aw [13］．

将牧区土壤划分为典型的富营养化地区新土[15那16］．在每个退化草场区0.0-0.2 m土层随机采集10个土壤样本，转化为土壤理化表征区组成的样本(表1)1)．

化学表征评价了pH (H₂O),^２＋、镁^２＋K⁺, Na⁺,艾尔。^３＋(H + Al)、P和TOC(总有机碳)。Ca^２＋、镁^２＋,艾尔。^３＋用1.0 mol L^-1氯化钾滴定加药。磷、钾⁺和na⁺用Mehlich-1提取;用分光光度法测定P和K⁺和钠⁺通过火焰光度法。用0.5 mol L萃取电位酸性(H + Al)^-1醋酸钙滴定加量。采用重铬酸钾湿燃烧法测定总有机碳，滴定法加量。所有的分析都是根据Donagema等人所描述的方法进行的[17］．

这些化学分析的结果被用来计算碱饱和度()、铝饱和度()、有效阳离子交换容量()和电位阳离子交换容量()．通过粒度分析对土壤进行物理表征，确定其结构类别[17］．

基于Stoddart等建立的牧草退化标准[18在施氮时间，选择3个区域采集植物和根际土壤样品，以评价细菌群落:高度退化草地，形成30年未施肥(P1)，地理坐标08°49′11”S和036°23′38”W;部分退化草地，形成10年，6年未施肥(P2)，地理坐标08°48 ' 35 " S, 036°24 ' 27 " W;(P3)，地理坐标08°49 ' 00 " S, 036°23 ' 38 " W。

当牧场施肥时，100公斤公顷^-1播施氮肥，每年沿雨季(5 - 8月)分播。氮源为尿素，不施磷和钾。在每个区域(P1、P2和P3)采集10个植物样本。

在退化草场的各个区域随机取样。各地区根际土壤样品采集地点与采集植物物质的地点相同，在0.0-0.2 m土层。根系收集后，通过循环运动将多余的土壤抽走，并在实验室中收集与根系直接接触的剩余土壤(根际土壤)。

2．2．重氮营养细菌群落培养的种群密度

根据Döbereiner等人的研究，对根际和根内生重氮营养细菌进行了分离[19和Kuklinsky-Sobral等人[20.］．

为了分离根际土壤中的细菌，取根际土壤5 g，置于装有5 g玻璃微珠(0.1 cm)和50 mL含1.44 g L磷酸盐缓冲盐水(PBS)的容器中^-1Na的₂HPO._4.；0.24 g L^-1KH的₂阿宝_4.；0.20 g L^-1KCL;和8.00 g l^-1氯化钠，在pH 7.4缓冲。这些容器在环境温度下搅拌(90转/分)40分钟。然后，连续稀释(10^-4, 10^-5和10.^-6)接种于相同的PBS缓冲液中，并将等量的这些溶液接种于选择性半固态NFb培养基中[5 g L^-1苹果酸;0.5 g L^-1K.₂HPO._4.；0.2 g L^-1的MgSO_4.h·7₂O;0.1克L.^-1NaCl;0.01 g l^-1的CaCl₂h·2₂O;4毫升L^-1Fe·EDTA(1.64%溶液);2毫升L^-1溴百里酚蓝(0.5%);2毫升L^-1微量营养素溶液(0.2 g L^-1Na的₂MoO_4.h·2₂O;0.235克L.^-1的MnSO_4.·H₂O;0.28 g L^-1H._3.博_3.；0.008 g L^-1的CuSO_4.h·5₂O);1.75 g L^-1琼脂，pH 6.8缓冲]，加入50μ克毫升^-1杀菌剂Cercobin 700(甲基硫菌酸酯)的含量。

为了分离根内细菌细菌，忽略了植物样品的芽，并将根部在蒸馏水中洗涤。对浅表消毒的方法约3至5g根（在70％醇中1分钟;在Na次氯酸盐中3分钟;酒精30秒;和在无菌蒸馏水中的两个洗涤剂）。在对照样品中评估消毒效率。然后，使用用于旋转层土壤细菌的接种的上述方案，具有连续稀释度（10^-3, 10^-4和10.^-5)．

根据Döbereiner等人的研究，重氮营养细菌群落的种群密度是通过McCrady 's表确定的，获得每克样品中细菌的最大可能数(MPN)。[19］．

在半固体NFB培养基中分离后，将90种细菌中培养并分离在固体NFB培养基中，每个牧场（P1，P2和P3）中的30个（P1，P2和P3）和每个Niche（脱蛭土壤和根内胚胎）。基于菌落的形态变异性进行细菌分离物的选择。评价所选择的细菌分离株在28℃下在28℃下没有N源的培养基中的生长八天[19］．同样，在培养基中观察到的具有生长特征晕的分离物被认为是正生长。为了更好地验证结果，试验进行了三次，并重复了两次。

半固态NFb培养基的使用有利于重氮营养细菌的选择，因为它们移动到一个氧气扩散速率与呼吸速率平衡的区域，形成细菌生长膜。当过量的氧被较高的细菌生长去除时，固氮酶被激活。因此，在半固态NFb培养基上能够形成生长特性膜的细菌分离物被认为是重氮营养的[19］．没有使用其他技术来验证细菌的重氮营养特性，如乙炔还原活性(ARA)或放大nifH基因。

2．3.重氮营养细菌群落的遗传变异

通过遗传可变性评估90个细菌分离物通过聚合酶链反应（Box-PCR）技术。使用基因组DNA纯化试剂盒（FERMENSA）提取细菌DNA。在萃取细菌DNA后，用底漆BOXA1R（5'-CTACGGCAAGGCGCGCGCGCGCG-3'）进行PCR反应，最终体积为25 μL,包含1μ总DNA的L(纳米滴分光光度计定量10ng);1μ底漆的m;每个dNTPs 1 mM;1x的DMSO（二甲基亚砜）;1x酶缓冲液，Taq缓冲区；3.5 mM的氯化镁₂；Taq DNA聚合酶为0.08 U。放大从95°C开始，持续2分钟;35个循环，94°C, 2分钟;92°C 30秒;50°C 1分钟;65°C 1分钟;最后一步65°C 10分钟。PCR产物在1x TAE缓冲液中进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳4 h，染色蓝色绿色加载。用于比较带宽/重量的分子标记为1 kB。

人工制作BOX-PCR基质，观察凝胶中条带的存在和缺失，获得遗传图谱的二元基质。

２.４.重氮营养细菌总群落的多样性

用重氮营养细菌的多样性分析技术变性梯度凝胶电泳(DGGE)nifH.提取根际土壤和根系的DNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳，在1x TAE中验证DNA的完整性和质量。的nif利用引物FGPH19 (5 ' -TACGGCAARGGTGGNATH-3 ')和PolR (5 ' -ATSGCCATCATYTCRCCG-3 ')扩增H基因，最终体积为25μl含有10 ng的土壤或根部的DNA;1μ每个引物的M;每个dNTPs 1 mM;1x酶缓冲液，Taq缓冲区；3.5 mM的氯化镁₂: 0.05μBSA的(牛血清白蛋白): 0.08 U的Taq DNA聚合酶。94℃下扩增周期为5 min;94°C下1分钟30次循环;1分钟在56°C;72°C 2分钟;最后一步是在72°C下30分钟。

产生的扩增子用于第二次反应nifH基因，利用引物PolF-GC (5 ' - gcccgccgcgcccggcccgcccccgcccctgcgayccsaa RGCBGACTC-3 ')和AQER (5 ' -ACGATGTAGATYTC CTG-3 ')。扩增发生在50μL中含有10 ng的第一反应DNA;1μ每个引物的M;每个dNTPs 1 mM;1x酶缓冲液，Taq缓冲区；3.5 mM的氯化镁₂；Taq DNA聚合酶为0.08 U。94℃下扩增周期为5 min;94°C下1分钟30次循环;1分钟在48°C;72°C 2分钟;最后一步是在72°C下30分钟。所使用的凝胶为6%聚丙烯酰胺，变性梯度为40 - 65%，1x TAE, sybr -金染色。

DGGE在Ingeny PhorU系统(Ingeny, Goes, Netherlands)中进行分析。PCR产物制备6%聚丙烯酰胺凝胶(w/v)，变性梯度为40 ~ 65%nifH基因。凝胶在75伏，60°C的温度下进行16小时电泳。电泳后，用SYBR-gold (Invitrogen公司，Breda，荷兰)和1x TAE按1:10 000的比例染色30分钟，并拍照记录。

利用Image Quant软件(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA)对PCR-DGGE获得的扩增谱进行分析和比较，生成条带存在和缺失矩阵。

2．5．Shannon-Weaver多样性指数

基于遗传矩阵，Shannon-Weaver多样性指数()的计算公式如下: ，其中 ,在那里为遗传上不同分离株的数量;N为分离株总数;ln是自然对数[21］．该指数分别计算了培养重氮营养细菌群落和总重氮营养细菌群落。

2．6．统计程序

基于变异系数（CV），平均角误差（ %)，以及学生的表格值T.-显著性水平为0.05的分布( ） 和 （ )自由度[22那23］．

因此，细菌密度和Shannon-Weaver多样性指数的数据被分析为一个因子排列( )，由3个退化阶段、2个定殖龛和10个重复组成。将密度数据转换为均数采用fisher - snede’s方差分析统计数据。当主因素和/或交互作用显著时，斯科特-诺特检验( )用于平均数的比较。

通过DGGE和BOX-PCR技术评价的重氮营养细菌群落多样性进行多元分析，通过相似性分析确定群落间的变异，通过菌群间平均距离算法识别显著差异。生成R.相关性(24］．

3.结果与讨论

3．1.培养(未验证)重氮营养细菌群落

牧场部分退化条件下，重氮营养细菌群落的种群密度随植物/细菌组合生态位的变化而变化，仅根际土壤中较高(表1)2)．

当牧草轻微退化时，不同生态位间细菌群落密度无差异(表1)2)．随着牧草退化，根际土壤生态位表现出更多重氮营养菌，而根-内生生态位则出现下降，可能是由于退化牧草营养不足，无法满足重氮营养菌的需求。根际是根系分泌物释放和有机质富集的区域，这使得该生态位成为微生物相互作用和选择的环境[25那26］．

此外，在植物物质(根)和根际土壤收集过程中，高度和部分退化草地休养6个月，而轻度退化草地仅休养1个月。这有利于有机质在土壤上的大量沉积1)，从而增加细菌密度(表2)．根据Rasche等人[27有机质是土壤微生物生长的重要能量来源。

当牧草进一步退化时，土壤对牧草和微生物也失去了营养能力，特别是磷含量的下降加剧(表)1)，导致根际和根内生潜在重氮营养细菌群落之间的差异不再存在(表2)．

在使用化肥后，预期对与植物相关的微生物群落的影响是预期的化学肥料后[28那29]及管理上的变动[10］．

在每个生态位上，重氮营养细菌群落的种群密度均不随草场退化阶段的变化而变化。根际土壤生态位的细菌数量和根际土壤内生细菌数量均未因牧草的退化而发生变化2)．这表明，在牧草退化的任何阶段，无论退化的严重程度如何，种群密度都有下降。这种严重程度并没有加剧细菌种群的减少，因为种群在降解开始时就已经减少了，因此，它并没有随着降解的增加而改变。

通过BOX-PCR检测的重氮营养细菌群落遗传多样性数据进行多变量分析，未发现牧草退化不同阶段与植物/细菌关联生态位之间存在独立的类群，存在细菌类群之间的重叠(图)1)．这是由此引用的R.对于所有组的所有交叉点，相似性分析的值（表格）3.)．

培养的重氮营养细菌群落的分离株不随草场退化而变化，根际土壤定植的细菌与内生定植的细菌没有区别。该群落的更大的特异性不允许细菌适应牧场退化的不同阶段。种群密度可能下降，但群落结构保持不变，证明了群落多样性数据的重叠。

重氮营养细菌群落的Shannon-Weaver多样性指数随降解阶段的不同而变化b . decumbensStapf。植物/细菌群落生态位的变化4.)．根际土壤和根内生细菌分离株的多样性在轻度退化草地与高度退化草地相似。仅在高度退化草地，根际细菌群落多样性指数高于根-内生细菌群落多样性指数(表2)4.)．

热带土壤低氮一直是热带牧草生长发育的主要限制因素[1那3.］．真正营养细菌和牧草之间的关联可以克服部分对植物发展的影响[30.］．然而，自然和人为的失衡会影响细菌群落，干扰其生化活动[31和遗传多样性[27］．

重氮营养群落可以被改变，特别是土壤特征，植物的渗出模式[32]，按植被类型、植物基因型之间、物候阶段和定殖生态位[6.那10那26那33]，除了动物在植物上的活动，在放牧期间[34］．然而，这些细菌与牧草的结合是一种重要的资源，可用于不同退化阶段土壤和牧草的恢复[7.那30.］．

与牧草相关的重氮营养细菌的密度和多样性已有文献报道[35那36]，但是这些草的栽培管理和殖民生态位可以改变这个群落[12那30.］．因此，由于能够在细胞内和细胞间定植，内生微生物与宿主有密切的关系[10，这导致了它们多样性的减少。

关于微生物多样性的知识的进展是通过应用于环境研究的分子生物学方法的演变来提供[37］．细菌多样性的研究可以通过BOX-PCR技术进行，该技术利用细菌培养的DNA在体外。然而，细菌培养物提供有限的信息，因为培养基在实验室环境中没有准确地再现不同的生态利基[38那39］．

PCR-DGGE技术评估土壤中的主要微生物群体或与工厂相关的主要群体[40］．该技术可用于评估微生物群落结构变化对环境和管理参数变化的响应[41］．

3．2．重氮营养细菌总群落

通过DGGE测定的重氮营养总细菌群落遗传多样性数据的多变量分析表明，不同草地退化阶段和植物/细菌生态位之间形成了独立的群体，除高度退化草地根际重氮营养总细菌群落多样性外，均与轻度退化草地根际内生细菌群落相一致(图2)2)．

的引用该分组为0.163，高度退化草地和根际土壤生态位组与轻度退化草地和根-内生生态位组相似度为0.1635.)．根据克拉克和格利[24]，价值观 确定不同的群体。为 ，组也不同，但有重叠，而值 表示组的重叠。

草地退化阶段和细菌定殖生态位改变了重氮营养细菌群落总量。细菌群落适应了更退化的环境。此外，根际土壤定植的细菌与内生定植的细菌不同(图)2)．

另一方面，在轻度退化草地的根-内生生态位上定植的细菌在退化草地时与根际土壤相同，这证明了这两组细菌的重叠(图)2和表5.)．

重氮营养细菌群落与b . decumbensStapf。不同退化阶段和不同退化区域的植物/细菌组合发生了正向变化，以适应土壤条件、植物营养需求、植物渗出模式的变化和牧草多样性的变化，并在退化区域增加，促进了牧草在胁迫条件下的持久性;与Bacon和Hinton报告的结果一致[9.］．

香农-韦弗多样性指数以数字表示一个样本的生物多样性[42］．重氮营养细菌群落的这一指标随降解阶段的不同而变化b . decumbensStapf。牧场并取决于植物/细菌协会的区域（表6.)．对于脱菱土的细菌分离物，略微降解的牧场中的多样性显着高。然而，随着牧场降解阶段的增加，根内细菌细菌分离株的多样性增加（表6.)．

在根际，环境越肥沃，微生物的多样性就越大。随着环境的肥力下降，例如牧场的退化，多样性趋于减少，因为该地区变得有选择性，只留下一小部分微生物对不利的环境条件更具抵抗力[6.那26］．

本研究使用的PCR-DGGE技术旨在评估细菌的总体多样性。未进行DGGE凝胶带测序，不限制组，提供重氮营养群落的通用评价。这些限制组可能是由于PCR-DGGE技术的局限性;例如，不推荐长序列，因为PCR产物不能超过500 bp，这可能限制了系统发育推断的信息[43];细菌的DNA序列可以迁移到其他条带[44];DGGE技术只比较群落中最丰富的成员，通常限制在群体中最常见的50个生物，这代表了一个重要的限制[45］．

4.结论

在退化阶段的增加b . decumbensStapf。牧草对养殖重氮营养细菌群落的种群密度没有降低，表明退化对细菌没有任何严重的危害。根际土壤生态位中重氮营养细菌群落的种群密度高于内生定植细菌群落。非培养重氮营养总菌群的结构与b . decumbensStapf。受牧草退化阶段的影响，表明该细菌对恶劣环境具有较高的适应能力。培养的重氮营养细菌群落不受降解阶段的影响b . decumbensStapf。牧草，不考虑植物/细菌组合的生态位。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者通过区域会议感谢Riacho do Papagaio农场的土壤和植物样本的收集，以及高等教育人员改善协调(CAPES)和国家科学和技术发展委员会(CNPQ)授予的奖学金。

参考文献

1. M. Hungria, M. A. Nogueira，和R. S. Araujo，“用植物生长促进细菌Azospirillum brasilense接种臂虫:在热带退化牧场开垦中的环境友好成分，”农业、生态系统与环境，第221卷，第125-131页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. m . b . Dias-FilhoDiagnóstico das Pastagens no Brasil， Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Belém，巴西，2014。
3. m . b . Dias-FilhoDegradação de Pastagens: Processos, Causas e Estratégias de Recuperação， Edição do Autor, Belém，巴西，2015。
4. C. Loredo-Osti, L. López-Reyes, D. Espinosa-Victoria， " Bacterias promotoras del crereciimiento vegetalassociadas con gramíneas， "Terra Latinomericana， vol. 22, pp. 225-239, 2004。视图:谷歌学术搜索
5. M. L. G. Ramos, M. F. S. Meneghin, C.佩德罗萨，C. M. M. Guimarães, M. L. F. Konrad，《微生物功能组的发展》生物科学杂志，第28卷，第58-68页，2012。视图:谷歌学术搜索
6. F. D. Andreote, T. Gumiere和A. Durrer，“探索植物微生物群系的相互作用”，Scientia阿格里科拉，卷。71，没有。6，pp。528-539,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. M. I. Rashid, L. H. Mujawar, T. Shahzad, T. Almeelbi, I. M. I. Ismail，和M. Oves，“细菌和真菌可以促进退化土壤中营养物质的生物有效性和团聚体的形成，”微生物研究，第183卷，第26-41页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. J. P. Panizzon和H. L. Pilz Júnior，“细菌-土壤-植物的相互作用:为食品工业产生可投入物和新产品的关系”，水稻研究:开放获取，第4卷，第4期。1, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. C. W. Bacon和D. M. Hinton，“mojavensis:它的内生性质，表面素，及其在植物对感染的反应中的作用镰刀菌素verticillioides,“在农业生物学中的细菌:植物生长， D. K. Maheshwari, Ed.， pp. 21-39, Springer-Verlag，柏林，德国，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. F. weemheuer, B. weemheuer, D. Kretzschmar等，“草地管理制度对不同草种细菌内生真菌多样性的影响不同，”应用微生物学书信第62期4, pp. 323-329, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. R. Pariona-Llanos, F. Ibañez de sananti Ferrara Felipe, H. H. Soto Gonzales, H. R. Barbosa，“有机施肥对甘蔗中可培养重氮营养内生细菌数量的影响”，欧洲土壤生物学杂志第46卷，第46期6，页387-393,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. R. S. Vargas, R. Bataiolli, P. B. da Costa等，“Pampa生物群落土壤微生物质量对不同放牧压力的响应”，遗传学与分子生物学第38卷第2期2, pp. 205-212, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. B. A. Beltrão, J. C. mascararenhas, J. L. F. Miranda, L. C. Souza Júnior, M. J. T. G. Galvão, S. N. Pereira，Diagnóstico do município de São João，巴西伯南布哥， Serviço Geológico do Brasil，累西腓，巴西，2005。
14. l.m. e.j. Povóas, m.m. Barros和r.v. Ribeiro，Boletim de Monitoramento de Qualidade das Águas dos Reservatórios de Pernambuco，巴西， Agência Pernambucana de Águas e Clima，累西腓，巴西，2016。
15. J. C. Santos, V. S. Souza Júnior, M. M. Corrêa, M. R. Ribeiro, M. d. Almeida, and L. E. Borges， " Caracterização de neossolos regolíticos da região semiárida do Estado de Pernambuco， "resta Brasileira de Ciência do Solo第36卷第2期3，第683-696页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. H. G. Santos, P. K. T. Jacomine, L. H. C. Anjos等，Sistema Brasileiro de C Lassi Ficação de Solos， Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Brasília，巴西，2013年第3版。
17. G. K. Donagema, D. V. B. Campos, S. B. Calderano, W. G. Teixeira, J. H. M. Viana，手册Métodos de Análise de Solos， Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária，里约热内卢de Janeiro，巴西，第二版，2011。
18. 洛城·斯托达特，a·d·史密斯和t·w·博克斯，范围管理， Mcgraw-Hill Book，纽约，纽约，美国。
19. J. Döbereiner, V. L. Baldani和J. I. Baldani，Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas， Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Seropédica，巴西，1995。
20. J. Kuklinsky-Sobral, W. L. Araújo, R. Mendes, I. O. Geraldi, A. A. Pizzirani-Kleiner, J. L. Azevedo，“大豆相关细菌的分离和特性及其促进植物生长的潜力，”环境微生物学，第6卷，第2期12, pp. 1244-1251, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. J. W. Hendrix, B. Z. Guo, Z.- q。作物生产系统中菌根真菌群落的分化植物和土壤第170卷1，页131-140,1995。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. H. L. Santos和C. A. Vasconcelos，“Determinação do número de amostras de solo para análise química em diferentes condições de manejo，”resta Brasileira de Ciência do Solo，第11卷，第97 - 100,1987年。视图:谷歌学术搜索
23. V. Azevedo, D. Barbosa, F. Freire等，“不同土壤取样仪器对评估巴西caatinga地区土壤肥力的影响”，非洲农业研究杂志，第736-740页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. K. R. Clarke和R. N. Gorley，入门v6:用户手册/教程，普利茅斯，英国，2006年。
25. C.贝塞拉-卡斯特罗，P. S.基德，Á。Prieto-Fernández, N. Weyens, M.-J。6 . Acea和J. Vangronsveld，“与生长在六氯环己烷污染土壤上的纹状囊藻相关的内生细菌和根平面细菌:分离和特性”，植物和土壤号，第340卷。1，页413-433,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. (C. Murphy, B. Foster, C. Gao，“三种多年生草地根际细菌群落的时间动态”，)农学，第6卷，第2期1，第17页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. F. Rasche, D. Knapp, C. Kaiser等，“季节性和资源可用性控制温带山毛榉森林土壤中的细菌和古菌群落”，ISME杂志，第5卷，第5期。3, pp. 389 - 402,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. S.-Y。元,I.-C。黄,B.-V。红树林沉积物中邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的生物降解及微生物群落变化危险材料杂志，第184卷，第2期。1-3，第826-831页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. Wang j, Zhang D.， Zhang L. et al.，“soil diversity and diversity of nitrogen ecology in china，”农业、生态系统与环境，卷。216，第116-124,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. M. C. P. Silva, A. F. Figueiredo, F. D. Andreote，和E. J. B. N. Cardoso，《brizantha腕鱼的植物生长促进菌》，世界微生物与生物技术杂志，第29卷，第2期1，pp。163-171,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. C. W. Bacon, E. R. Palencia, D. M. Hinton，“内生芽孢杆菌种产生的非生物和生物植物抗逆和有益的次级代谢物”，植物微生物共生:应用方面， pp. 163-177, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. 王志强，王志强，王志强，“草地土壤微生物群落结构对土壤微生物多样性的影响”，生态学报，2018,29(4):591 - 598。应用土壤生态学第36卷第2期2-3，页147 - 155,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. G. S. Magnani, C. M. Didonet, L. M. Cruz, C. F. Picheth, F. O. Pedrosa，和E. M. Souza，“巴西甘蔗内生细菌的多样性”，遗传学与分子研究，第9卷，第5期。1，页250-258,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. L. F. Chávez, L. F. Escobar, I. Anghinoni, P. C. Carvalho, e . J. Meurer，“Diversidade metabólica e atividade microbiana no solo em sistema de integração lavoura-pecuária sob intensidades de pastejo，”尽管Agropecuaria Brasileira第46卷，第46期10, pp. 1254-1261, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. R. M. Boddey和R. L. Victoria，“与...相关的生物氮固定估算Brachiaria和雀稗notaturn简历。batatais使用¹⁵氮标记有机物和肥料植物和土壤， 1986年，第90卷，265-292页。视图:谷歌学术搜索
36. M. D。Brasil，J.I.Baldani和V.L.Labani，“ocorrênciaE多样性DeBactériasdiazotróficassocaidasagramíneasforrageiras做Pantanal Sul Matogrossense，”resta Brasileira de Ciência do Solo，第29卷，第2期2，页179-190,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. R. I. Amann, W. Ludwig和K. H. Schleifer，“不经培养的单个微生物细胞的系统发育鉴定和原位检测”，微生物学检查，第59卷，第59期1，页143-169,1995。视图:谷歌学术搜索
38. L. F. W. Roesch, R. R. Fulthorpe, R. J. S. jacques, F. M. Bento，和F. A. de Oliveira Camargo，《土壤重氮营养细菌的生物地理学》，世界微生物与生物技术杂志第26卷第2期8, pp. 1503-1508, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. F. D. Andreote, J. L. Azevedo，和W. L. Araújo，“评估与植物相关的细菌群落的多样性”，巴西微生物学杂志，第40卷，第5期。3，第417-432页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. J. D. van Elsas和F. G. H. Boersma，“研究土壤和真菌球菌群的分子方法综述”，欧洲土壤生物学杂志，第47卷，第47期。2，第77-87页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. M. H. Nicolaisen和N. B. Ramsing，“变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法研究氨氧化细菌多样性”，微生物方法杂志，第50卷，第5期。2，页189 - 203,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. J. C. Zak, M. R. Willig, D. L. Moorhead，和H. G. Wildman，《微生物群落的功能多样性:定量方法》，土壤生物学与生物化学第26卷第2期9，pp。1101-1108,1994。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. G. Muyzer和K. Smalla，“变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)在微生物生态学中的应用”，安东尼·范·列文虎克，第73卷，第2期1, 1998。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. A. V. Piterina和J. T. Pembroke，“使用基于PCR-DGGE的分子方法分析ATAD废水污泥处理过程中嗜热阶段的微生物群落多样性和稳定性，作为性能监测的辅助，”ISRN生物技术， 2013年第1期，文章编号162645,13页，2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. D. Spiegelman, G. Whissell，和C. W. Greer，“微生物群落和群落表征方法的调查”，加拿大微生物学杂志第51卷第1期5，页355-386,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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