生存的Rifampicin-Resistant荧光假单胞菌应变在9个软土

文摘

荧光假单胞菌应变D7 (P.f。D7)是一种天然土壤细菌显示承诺作为年度草坪杂草的生物除草剂抑制增长,包括柔和的布罗姆(叶片tectoruml .),在农作物和牧场。荧光假单胞菌应变D7rif (P.f。D7rif)是一个rifampicin-resistant应变P.f。D7。成功的最大障碍之一生物除草是生物体在现场条件下的生存。9土壤在软土的分类顺序,从柔和的brome-infested收集美国西部和中部、接种P.f。D7rif和孵化实验室确定土壤类型的影响,土壤性质、孵化温度和土壤水分潜在的生存P.f。D7rif超过63天。粉砂壤土土从林德,华盛顿,震响,俄勒冈州,持续的最高P.f。D7rif人口和复苏的最低彭德尔顿,俄勒冈州的土壤。生存和恢复P.f。D7rif随土壤类型和温度而不是两个土壤水分潜力测试。63天之后,P.f。D7rif恢复水平大于日志5.5 g集落形成单位(CFU)⁻¹的九个测试土壤,土壤从五个水平足以抑制领域或范围条件下柔和的布罗姆。

1。介绍

一年一度的草坪杂草柔和的布罗姆或cheatgrass (叶片tectoruml .),再加上2200万公顷在美国西部1)和退化耕地用于小型粮食生产和用于放牧的牧场。在太平洋西北地区农田、严重侵扰,柔和的布罗姆可能减少小麦(小麦l .)以平均27%的收益率2)根据位置、植物密度和时间的杂草出现(3,4]。因为它有一个类似的生命周期小麦、柔和的布罗姆非常竞争与小麦稀缺的水分和营养。耕作、残渣燃烧和除草剂的控制选择小麦生产国;然而,这些选项可能不良可持续作物生产。耕作可能离开土壤受到侵蚀,燃烧作物残留物是有害的空气质量。除草剂来控制柔和的布罗姆小麦是昂贵的和化学残留物可能限制作物轮作选项。在牧场,柔和的布罗姆继续被放牧的地区,主要是由于过度放牧和人类干扰。在爱达荷州和犹他州,500万公顷的牧场单作柔和布罗姆由于过度放牧2]。柔和的布罗姆可能会提供一些价值在生长季节的早期放牧;然而,它在夏季干的很快,森林大火造成了严重的危害,增加了火灾的频率导致增加侵蚀和沉积1]。在农田中,选择控制柔和的布罗姆在牧场是有限的。

荧光假单胞菌应变D7 (P.f。D7)是一种天然土壤细菌从小麦根部分离,表明承诺有选择地控制农田柔和的布罗姆(5]。当应用在秋天,P.f。D7殖民柔和的布罗姆的根源,抑制其增长和允许的物种以获得竞争优势。细菌需要凉爽、湿润的环境,为了生存,在足够高的水平在根和抑制柔和的布罗姆增长;然而,天气条件在室内的西部美国通常是温暖和干燥到秋天的几个月。作为正在进行的研究的一部分来决定最优的生存土壤条件和效力P.f。D7,研究使用九个地区收集的土壤受到严重的美国柔和的布罗姆的侵扰。本研究的目的是确定土壤类型的影响,土壤性质、孵化温度和土壤水分的生存rifampicin-resistant应变的潜在生物控制剂荧光假单胞菌D7 (P.f。D7rif)。在第二个研究中,我们审查的生存P.f。D7rif应用于泥炭颗粒是否存活的细菌可以增强了这些材料。我们假设应用程序泥炭的细菌颗粒可能封装和保护P.f。D7场条件下提高生存和功效。

2。材料和方法

2.1。土样的采集

从表面土壤样本收集15厘米在九个地点在美国西部和中部在柔和的布罗姆负责农田(表中严重的产量损失1和2)。土壤被选出来代表的主要土壤类型的范围内有机物质水平的美国西北部和北部中央与柔和的布罗姆的侵扰。土壤收集从三个网站在华盛顿州(林德,拉克罗斯,普尔曼),两个网站在俄勒冈州(震响,彭德尔顿),一个站点在爱达荷州(刘易斯顿),一个站点在科罗拉多州(阿),和两个网站在堪萨斯州(海斯附近;指定为“A”和“B”)。在每个站点上,土壤收集从顶部4英寸7随机在每个地区的农业领域。中使用的土壤保持凉爽,直到孵化研究,在两周内发生。这些孵化研究之前,可见土壤有机物质被撤,和土壤渗通过屏幕2毫米。建立了土壤湿度曲线的土壤类型使用压盘的方法(6),和土壤特征(pH值、磷、钾、有机质、没有₃- n,在北半球₄- n和阳离子交换量)测定爱达荷州大学的土壤分析实验室。9土壤属性为每个表中列出1土壤粒度分布,农业部结构类,分类分类表中列出2。使用每个土壤的水分曲线构造,重量百分比计算土壤水分将每个土0.03 MPa和0.10 MPa。去离子水的适量添加到每个土壤和土壤充分混合。

2.2。细菌培养

荧光假单胞菌从人口的应变D7rif被选中P.f。耐100毫克L D7殖民地⁻¹利福平当生长在沙地上的琼脂(7与利福平)修改(金沙_rif)。的P.f。D7rif股票文化用于这些实验都维持在50%甘油−80°C。液体的文化P.f。D7rif,生长在假单胞菌最小的盐(PMS)肉汤8)和准备使用一个轨道振动器,是由前48小时内接种土壤。P.f。D7rif文化连续稀释,镀以确定最初的日志集落形成单位(CFU)毫升⁻¹培养液接种前的土壤。初始浓度的P.f。D7rif日志9.0 CFU毫升⁻¹孵化研究和日志CFU 10.2毫升⁻¹泥炭颗粒的研究。

2.3。孵化研究

添加适量的水分后每个土壤类型,土壤被传播到一个托盘和10毫升P.f。D7rif剂应用于100 g d.w.土壤使用喷雾器。土壤被彻底混合,放置在可密封的塑料袋。土壤的类型和每个两水分含量(0.03和0.10 MPa)孵化在三个温度:5、10和20°C。有两个复制每个土壤type-temperature-moisture组合,加上一个参与的每个土壤类型在湿度控制在10°C孵化。之前添加的P.f。D7rif培养液,2 g的每个土壤连续稀释,镀和土壤稀释到MMN,胰蛋白酶的大豆、马铃薯葡萄糖、蛋白水解,砂和砂_rif琼脂为了确定背景rifampicin-resistant生物的数量以及总假单胞菌(数据没有显示)。未发现rifampicin-resistant生物接种前的土壤。

土壤采样时的应用P.f。D7rif然后再3、7、10、14、21、28、接种后63天。在每个采样时间、土壤喜忧参半,包被打开,和土壤很快被取样。袋被关闭迅速,避免水分流失和污染。三个复制样本在每个采样时间从每袋。土壤是连续稀释,适当的稀释被镀到金沙,金沙_rif,大豆胰蛋白酶的琼脂。只有从金沙计数的结果_rif琼脂将报告在这里。稀释板在22°C,孵化,48小时后殖民地数增长。整个实验进行了两次。两个实验之间的关系是相似的,所以只有第二个实验的结果报道。没有rifampicin-resistant细菌控制样本中发现任何采样时间的土壤类型。

2.4。的生存P.f。在泥炭D7rif颗粒

泥炭颗粒注射P.f。D7rif生存是否可能改善在直接接种到土壤里去的。泥炭颗粒的初始pH值为4.3,为最佳的生存是太低了P.f。D7rif。泥炭颗粒被高压灭菌法研究准备三次15分钟每修改与碳酸钙(泥炭颗粒干重的10%)为最终的pH值为6.0。在接种P.f。D7rif,连续稀释的泥炭颗粒被镀到金沙_rif媒体,未发现rifampicin-resistant细菌。P.f。D7rif文化准备如上所述和50毫升的文化被添加到泥炭颗粒可密封的塑料袋。泥炭颗粒和细菌彻底涨跌互现。泥炭颗粒的水分含量研究的持续时间为25%,和孵化温度是20°C。泥炭颗粒的混合物P.f。D7rif当时采样无菌接种,在天2,7日,9日,16日,23日,30日,37岁,2 g系列稀释材料移除,电镀到沙滩上_rif琼脂如上所述。

2.5。统计分析

生存的差异P.f。D7rif土壤类型、温度、土壤水分含量,以及方差在泥炭颗粒的研究中,通过方差分析分析测定用JMP软件使用Tukey-Kramer HSD在0.05级(10]。相关的生存土壤特性是决定通过简单的回归分析11]。

3所示。结果

3.1。孵化研究:生存和恢复P.f。D7rif

方差分析分析的结果P.f。D7rif复苏和生存63天的潜伏期如表所示3。荧光假单胞菌D7rif复苏受土壤类型和孵化温度在每个采样时间()。土壤含水量仅受到影响P.f。D7rif复苏在7天采样。土壤类型之间的相互作用和孵化温度只能检测到第三天采样时间。没有土壤类型和土壤含水量之间的相互作用研究。

当平均水分治疗,P.f。D7rif生存急剧下降为所有土壤类型20°C孵化温度(图1)。项P.f。D7rif高于8.5日志CFU g⁻¹土壤对林德,佤邦,震响,或者,在研究的开始和拒绝不到日志3.0 CFU g⁻¹63年天土壤。在所有的土壤也有所下降P.f。D7rif从第三天到第十天,但林德,拥抱,和海斯,KS -“A”土壤显示增加14天前恢复人口下降到63天。28天,没有P.f。D7rif从彭德尔顿,或者,或者海斯,KS -“B”的土壤,和白天63从拉克罗斯没有复苏,佤邦、土壤。在5°CP.f。D7rif康复五的九5.5测试土壤大于日志集落形成单位(CFU) g⁻¹土壤(图后63天2),一个适合压制柔和的布罗姆的领域或范围条件下(肯尼迪未发表的数据)。复苏的P.f。从10°C D7rif孵化温度略低于5°C;然而,土壤之间的关系类似于最大的复苏从林德和莫罗彭德尔顿土壤的土壤和最少的复苏(数据没有显示)。

在每个孵化温度、P.f。从林德D7rif复苏最高,莫罗土壤(表4),这两种土壤也有最小的斜率值在5°C和10°C的温度。P.f。D7rif复苏彭德尔顿土壤的最低5°C和10°C的温度。最陡的坡度值在63天的孵化也发现彭德尔顿土壤的温度。三种土壤,海斯-“B”,拉克罗斯,彭德尔顿,没有P.f。D7rif复苏后63天。最陡的坡20°C是海斯-“B”的土壤。回归分析表明,63天的潜伏期,之间没有相关性P.f。D7rif生存和土壤结构和化学性质(所有< 0.09;数据未显示)。

3.2。的生存P.f。在泥炭D7rif颗粒

最初的水平P.f。在泥炭颗粒D7rif日志9.1 CFU g⁻¹泥炭颗粒(图3)。P.f。D7rif是恢复日志的峰值水平10 CFU g⁻¹泥炭颗粒在7天之前下降到7.0级别的日志CFU g⁻¹泥炭颗粒37天,最后研究的取样时间。

4所示。讨论

Rifampicin-resistant有益的细菌菌株已经被其他研究人员利用监控介绍生物生存在土壤或植物组织(12,13)和许多年之后应用领域(14]。我们研究的最终目标是要表明,有前途的生物控制有机体荧光假单胞菌应变D7土壤中可存活足够长的时间在柔和的雀麦草种子和根茎,抑制杂草生长,直到有益的作物和牧场植物可以获得竞争优势。我们来演示使用P.f。D7rif, rifampicin-resistant应变的有机体。

九个不同位置的土壤为孵化研究,以确定是否选择土壤质地或其他土壤性质影响生存P.f。D7rif如果可能位置的范围加以限制P.f。D7可以被用作生物控制剂与柔和的布罗姆。粉砂壤土、粉砂质粘壤土和粘土土壤是在这项研究中(表表示2)。在他们的研究中微生物群落的土地利用类型,到来et al。15)发现,土壤pH值和纹理显著地影响细菌的组成社区,在相关百分比淤泥和粘土。粘土含量较高的土壤被认为是更多的保护土壤微生物生物量因为它们能够保护细菌免受干燥和保持土壤pH值,因为粘土吸附化合物微生物增长不利的(16]。在这项研究中,海斯,KS -“B”土壤粘粒含量最高;然而,这并没有转化为更大的细菌生存(数字1和2)。从荷兰的农业土壤,Garbeva et al。17)发现,植物种类和土壤类型影响根际细菌社区是重要因素,包括总假单胞菌。他们表明,细菌总数,包括假单胞菌,生长在植物的存在时更高。荧光假单胞菌从小麦根D7最初是孤立的5在足够高的数字),幸存下来殖民抑制杂草生长的根际。的生存P.f。D7rif在我们的研究中可能增加了植物根系的存在。

成功的最大障碍之一的生物防治剂,及其随后的商业化,是土壤中生存的能力。rhizobacteria作为生物防治制剂的生存也受到足够的殖民影响杂草种子和根茎和根际微生物生态学的杂草和其他寄主植物(18]。的生存P.f。D7rif超过63天的孵化研究显著下降孵化温度从5°C增加到20°C。其他科学家看到了生存的下降假单胞菌种虫害的土壤温度增加25 - 35°C (18)和35°C (19]。荧光假单胞菌生存也被证明是对土壤水分变化敏感的潜在当比较饱和和不饱和(−0.06 MPa)土壤条件(20.];然而,我们没有看到任何显著差异P.f。D7rif两者之间的生存土壤水分潜力测试。有可能两个水潜力测试(0.03和0.10 MPa)不够明显,导致细菌生存的显著差异和恢复。

土壤有机质质量和作物残留影响土壤微生物群落功能如酶活性、呼吸、和N矿化(21]。一般来说,更高的土壤中发现的微生物种群与更多的作物残留物(22),土壤与有机或无机肥料(修订23)和土壤有机C高(24]。高有机质和之间没有相关性P.f。D7rif复苏孵化研究。土壤有机质在土壤范围从刚刚超过1%的林德土壤为刘易斯顿5%;然而,林德土壤显示存活率最高,而最高的土壤有机质、刘易斯顿,是土壤最低的存活率。

土壤从彭德尔顿任何测试土壤的pH值最低(5.2),和生存的P.f。D7rif最低在彭德尔顿的孵化温度(表4)。他等。25)发现在森林土壤微生物分类和代谢多样性最低最低的博士Hartel et al。19),在一个类似的孵化研究比较野生型的生存假单胞菌putida转基因突变,发现土壤环境影响不同的两种生物的生存。他们显示减少生存的野生型和突变体隔离在更高的温度,虽然野生型能更好地承受极端的高温或低土壤含水量。更多的酸性土壤中细菌生存的最低研究[19]。

土壤养分含量的因素之一是土壤中细菌生物防治制剂的生存。Krumins et al。26发现细菌社区在桑迪,森林土壤的变化应对氮作为NH添加₄没有₃,他们得出的结论是,在砂质土壤细菌群落对N的增加更敏感比真菌社区。在我们的孵化研究中,整体之间没有相关性P.f。土壤NH D7rif复苏,或高或低₄- n或没有₃- n。当北半球₄- n,没有₃- N值组合为每个土壤(数据未显示),两个最低的土壤总N(林德,莫罗)最高P.f。D7rif总体生存率。在他们的研究P和K缺乏红色土壤(老成土和氧化土)在中国,他等。25]表明,pH值和土壤有机碳是土壤最重要的特征影响土壤微生物群落,但其他因素,如氮、阳离子交换能力、土壤湿度、压实土壤微生物群落的影响。Vasquez et al。27]发现更大的土壤N导致更大的竞争力cheatgrass范围内设置,因此土壤的养分状况可能影响的能力所需的植物群落和减少cheatgrass竞争。我们并没有发现土壤养分或化学性质之间的相互关系P.f。D7rif生存在这个研究。

顾和Mazzola28)发现,生产环境可能会影响细菌生物防治剂的能力生存和功能。有限的碳环境可能导致改进生物当暴露于其他的生存压力,包括极端温度(29日]。不同的生长条件P.f。D7rif培养液没有这个实验的一部分P.f。D7rif文化种植使用标准方法(5,30.];然而,C和暴露隔离限制在更大的压力可能是改善生存在野外条件下的方法。

在泥炭颗粒的研究中,初始浓度P.f。D7rif相当的开始P.f。D7rif人口从林德土壤中恢复过来,最高的生存孵化研究。28天的潜伏期后,复苏的P.f。D7rif从林德土壤是日志6.0 CFU g⁻¹从泥炭土壤,而复苏颗粒为1.0日志,日志7.0 CFU g⁻¹37天后泥炭。Elzein et al。31日发现mycoherbicide尖孢镰刀菌“狡猾的2”可以封装在一个pesta配方改善货架寿命,和Kohlschmid et al。32)发现,海藻酸颗粒和pesta颗粒与制定尖孢镰刀菌隔离雾更有效和可靠控制寄生杂草支肉苁蓉(Phelipanche ramosa(l)在现场条件下球形顶饰)的控制。泥炭颗粒用于商业各种豆类,和封装在泥炭颗粒或其他材料来保护细菌生物防治剂似乎承诺允许最大的生存,在杂草生物功效和成功控制。

5。结论

P.f。D7rif复苏从土壤后63天的孵化最高最低的孵化温度(5°C),并从林德在土壤,华盛顿,和拥抱,俄勒冈州。的能力P.f。D7生存在土壤和植物根和殖民残渣冷却器温度经验在美国西部在秋季对应良好最优的温度对细菌生物防治剂的应用控制在冬小麦柔和的布罗姆。的生存P.f。D7rif 9中不同土壤,但我们没有发现明显的土壤结构和化学特性之间的关系P.f。D7rif生存。的应用P.f。D7rif封装在泥炭颗粒出现承诺保护细菌免受严酷的环境条件下,允许的最大生存和生物除草。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢纳尔逊Jean-Anne优秀的技术援助。作者感谢菲尔·斯塔尔,亚历克斯Ogg,兰迪·安德森,克莱德道格拉斯为本研究提供土壤样本。

引用

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