文摘
真菌构成土壤生态系统的重要组成部分,在分解扮演关键角色,循环过程和生物相互作用。分子的方法被用来评估真菌社区提供一个更实际的观点的多样性。为此,总DNA提取大部分土壤栽培番茄(STC)、蔬菜(自燃)和原始森林(SMS)从三个网站Sumare Taquara布兰卡流域的县,圣保罗,巴西。这个宏基因组DNA作为模板放大真菌18 s rDNA序列,和图书馆了大肠杆菌通过克隆PCR产品。质粒插入排序,而基因库数据库中的已知rDNA序列。的克隆测序,22从短信样本,获得18的自燃样本,从优质样本和6。尽管大多数的克隆序列不匹配数据库中的序列存在,个体放大序列与Glomeromycota (SMS),真菌incertae基准(SMS),和Neocallimastigomycota(自燃)。大多数的序列放大类群代表无教养的真菌。分子方差分析(AMOVA)表示,波动观察组成的单体型可能与除草剂的应用程序。
1。介绍
尽管土壤微生物群落在调节土壤生态层面的重要性的过程,如养分循环和有机物分解,对这些微生物群落的结构和土壤因素的影响。缺乏知识的出现,在某种程度上,从土壤微生物群落的巨大复杂性估计包含超过4000种不同的基因等价物在一克的土壤(1]。因为他们的广泛的生态范围,准备好适应能力,和广泛的营养来源,丝状和类酵母菌能够在许多不同的领域或基板2]。作为土壤生态系统整体组件、真菌发挥重要作用作为植物残体的重要的分解者,释放营养物质,维持和促进植物生长3]。尽管它们的重要性,但很少有对土壤中真菌的社区进行了报道。
比较研究报道,微生物群落可以改变土壤扰动,和差异之间观察到微生物群落与不同领域的历史土壤改良剂、灌溉、耕作和植物群落结构(4]。土壤微生物的知识扩大随着新方法用于描述生物在自然5]。Cultivation-independent使用核糖体rna基因序列分析方法被用来探索分类土壤微生物群落的多样性。最近的技术进步在dna方法允许快速、准确鉴定真菌和酵母物种从各种各样的样品2]。关于rDNA基因,小亚基16 s已成功用于评估细菌多样性的自然生态系统,提供可能发现新物种(6- - - - - -9]。这种方法已经成功的土壤中细菌群落的评价8本文研究的区域。
很少有土壤真菌多样性的描述基于核糖体RNA序列。本文的目的是比较真菌社区样本的砖红壤种植的西红柿和蔬菜,,原状土,原始森林;这些样本被分析评估18岁的宏基因组DNA序列从真菌可以rDNA放大。
2。材料和方法
2.1。土壤样品
表面视野(0到30厘米)的红色砖红壤土壤取样2001年2月(夏季)从三个网站Taquara布兰卡Sumare县河流域(22°49 13′′′年代,08年47°16′′′W),圣保罗,巴西。年平均降水量和年平均温度是1100毫米和21°C,分别。培养字段管理了超过10年使用传统的管理实践和种植了西红柿(Lycopersicon esculentum机)(STC)、蔬菜(芸苔属植物oleracea各种葡萄孢属)(自燃)的土壤取样。第三个字段有本机不受干扰的森林土(SMS),特点是抑制菌丝体生长的植物病原体辣椒(10]。土壤化学和物理性质测定根据IAC风干土壤土壤分析系统(11]。
2.2。可培养的真菌
真菌社区被摇动10 g的批量提取土壤样品800毫升的8μL焦磷酸溶液0.1%含青霉素(100 mg·L−1)和链霉素(100 mg·L−1在200 rpm) 30分钟25°C。连续稀释10倍后(100年μL)被传播到马丁介质(12)含有青霉素G(5数以百万计的单位)和链霉素(2克100 mg·L−1在28°C)和盘子孵化。枚举的真菌,殖民地被数日常直到第十天。连续稀释进行了一式三份。
2.3。DNA程序
从土壤中微生物群落总DNA提取土壤使用FastDNA旋转工具(101年生物,目录# 6560 - 200年)根据制造商的指示使用1 g的每个土壤样本。引物对EF3 (5′-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3′)和EF4 (5′-GGAAGGG (G / A) TGTATTTATTAG-3′)被用于18 s rDNA放大(13]。反应是再次进行热循环(ptc - 100可编程温度控制器,乔丹研究,Inc .)和PCR产品温度低熔点琼脂糖电泳纯化的1% (Gibco)和插入pGEM-T克隆载体(美国WI Promega,麦迪逊,目录# A3600)根据制造商的指示。克隆库是由转换大肠杆菌DH5α。筛查插入克隆后,重组质粒DNA克隆选择的分离,纯化,量化(14]。测序PCR在微型板块进行包含100 - 150 ng模板质粒DNA, 1μL BigDye终结者;3.2 pmoles寡核苷酸引物M13 /加州1211转发(5′gta AAA CGA CGG CCA GT-3′)和缓冲5 x(400毫米Tris-HCl pH值9;10毫米MgCl2)完成10μL反应混合物。反应进行以下循环参数:初始变性在96°C 2分钟,然后在96°C 40周期为10秒,退火在20秒52°C,在60°C和扩展了4分钟。ABI的扩增子被毛细管测序音序器模型3700(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。
2.4。系统发育分析18 s rDNA序列
重复测序分析3.4软件生成的。计算机程序phr(可用http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phred.html)被用来分配基地重复。消除向量序列后,程序phrap(可用http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)是用于分析的序列。ContiGEN。pl程序只是用于确定核苷酸序列在大小和超过400个基点phr质量> 20(质量分数分配给每个基地调用自动测序仪痕迹)被选中(15]。这个分析中使用的所有片段测序三次为了确认碱基序列。以来单基地改变用于区分群体,这种高质量的标准是绝对必要的:任何问题关于序列的质量可能会影响最终结果的准确性。用于比较的程序基本局部比对搜索工具(爆炸)16)和序列与在线在基因库;这些序列被确定为无教养的生物。18 s rDNA代表一致反对克隆序列最相似的序列使用实际提取和报告语言(Perl)项目由微生物和植物的生物化学实验室实现本地化UNESP / FCAV。序列比对是第一个使用Clustal W(1.8版)(17),然后调整使用BioEdit(版本5.0.9)项目(18]。系统发育关系推断土壤真菌的优惠比对序列从基因库中获得。这样做是使用这个程序MEGA5(2.1版)(19]。引导分析2000复制(20.]。
2.5。遗传多样性
遗传多样性指数计算使用三个土壤样本的DNA序列分类根据系统发育关系揭示了优先排列。
遗传距离:群体之间的遗传距离计算的值从不同的土壤和相同的土壤真菌。遗传距离的估计被用来评估内部和真菌群体间遗传分化(21]。群体内遗传距离估计的算术平均值的一个群体中的个体两两分类单元之间的距离,以及群体之间的遗传距离估计的算术平均值的两两之间的距离两组在组间比较22]。
2.5.1。成对固定指数()值、平均成对差异和其他索引
这些值计算估计如果孤立的群体从不同土壤结构根据其来源和土壤耕作。Arlequin软件(23)是用来估计遗传结构组间不同的土壤和种内遗传多样性。成对固定指数差异的重要性)值和平均成对孤立组之间的差异计算分子方差分析(AMOVA)。的测试是用来比较每组内的遗传多样性与总根据方程结合遗传多样性,在那里所有样本的遗传多样性和吗是每个群体的遗传多样性24]。统计学意义的被随机分配序列计算1000年人口和排列。平均估计成对差异对比在一群不同序列之间的一个给定的序列和所有其他序列(23]。来估计土壤真菌群体内的遗传多样性,一些指标计算距离与p-distance核苷酸替换模型方法。平均成对差异和核苷酸多样性计算每组。此外,分子指标,如基因拷贝数和单体型的位点总数,可用的位点,多态性网站,和核苷酸多样性计算为每个数据集。
3所示。结果
3.1。土壤分析
有机质是土壤中最低种植番茄。然而,土壤种植蔬菜和抑制原始森林有相似的有机物质内容。土壤pH值、磷、钾、钙和镁在栽培土壤(表更高1)比不文明的森林土壤,可能反映了普通石灰和受精来支持农作物生产。pH值的增加通常是伴随着减少可交换的阳离子交换容量的增加和艾尔(CEC)和其他阳离子(K、Ca、Mg)。
3.2。可培养的真菌的数量
最可能使用microassay真菌种群数量方法技术(25)是沉积40µL整除个人选择性琼脂板下镀方法(3复制/稀释)。可培养的真菌的数量了CFU / g(菌落每克)的土壤种植蔬菜,对自然森林CFU / g,CFU / g的土壤种植西红柿。
3.3。系统发育分析18 s rDNA序列
576年克隆获得对于每一个土壤样本,只有38有插入的预期规模和质量,比如短信,22人体自燃现象为18岁,06失学。rDNA碎片18 s rDNA大约有400个基点,这是足够的系统识别,至少对生物的分类单元水平属于组织代表在序列数据库中。大多数0.4 kb的片段克隆18 s rDNA获得来自土壤样本数据库中的不匹配。分组的克隆序列的优越的基因库中真菌序列存在三个土壤样本如图1。总的来说,相关的序列Glomeromycota(2序列从SMS),真菌incertae基准(1序列从SMS)和Neocallimastigomycota(1序列从自燃)和其他序列无教养的真菌。对齐的序列导致系统树与几个演化支,其中一些包含至少一个已知的序列。相似度值从97%到69不等。
进化史的推断是使用最大似然方法基于Jukes-Cantor模型(26]。引导共识树推断从2000年复制(27)是代表类群的进化历史分析(27]。分支对应分区复制不到50%引导复制崩溃。的比例复制的树分类群聚集在一起,引导相关测试(2000复制)显示分支[旁边27]。初始树(s)启发式搜索得到自动Neighbor-Join和BioNJ算法应用到一个矩阵的两两距离估计使用复合(制程)可能性最大的方法,然后选择拓扑与优越的对数似然值。一个离散伽马分布用于模型进化速率差异网站(5类(+ G、参数= 25.0042))。58所涉及的分析核苷酸序列。密码子的位置包括是。所有职位只有不到95%的站点覆盖率都消除了。对齐差距不到5%,缺失的数据,和模棱两可的基地被允许在任何位置。有共有51在最终的数据集。进化分析进行MEGA5 [19]。
核苷酸序列都是提交给NCBI和加入数字DQ641264 AY613927, AY645193 AY645205, AY646688 AY646692, AY646694, AY646696 AY646699, AY646701, AY646702, AY646704, AY646707 AY646711, DQ641264.1, DQ792517.1, DQ792532.1, DQ792534.1, DQ792535.1, DQ792536.1, DQ792544.1, DQ792551.1, DQ792556.1, DQ792559.1 DQ792563.1。
3.4。遗传多样性和成对固定指数(),平均成对差异,其他索引
最高的遗传多样性采样分布在土壤组(98.48%)和一小部分在土壤中取样组(1.52%)(表2(a))。的价值最高的番茄作物(STC)相比,原生森林(0.01888);的人体自燃现象的价值和短信(0.01750)(表略低2(b))。平均成对差异和数量的多态是STC网站示例显示值最高(表2(c))。三种土壤没有共享单。
4所示。讨论
定期李明和受精保持土壤肥力的作物生产可能改变土壤中有机质的数量(表1)。土壤有机质(SOM)是最常报道特点的长期试验,可以确定为农业生态系统发展的一个有价值的指标在特定的农业生态环境和农业实践(28]。虽然没有观察到土壤中,番茄栽培,土壤条件的变化由于表面残留积累在连续作物常常为土壤有机质的增加(29日]。作物残留影响土壤有机质动态最大程度的增加或减少分解和养分有效性,从而维持土壤肥力和农业生态系统的可持续性30.]。因此,耕作或土壤管理可以显著影响土壤性质和微生物群落结构。24年进行的一项研究表明,与免耕的生产力优于犁板耕耘和凿犁系统(31日]。作物残留物可以影响土壤有机质动态最大程度的增加或减少分解和养分有效性,从而维持生育的地面和农业生态系统的可持续性。因此,耕作或土壤管理可以显著影响土壤性质和微生物群落结构。
尽管cfu只提供一个粗略的土壤真菌群落,结果表明,这似乎是影响植被类型和管理强度,为番茄最低,栽培利用各种各样的农药。因为大多数殖民地在盘子里来源于真菌孢子(32),有可能从番茄土壤青睐一些特定的产孢菌类。这部分工作的结果与之前的研究一致对土壤中微生物群落结构的变化和变化管理;没有耕作,真菌的微生物群落转向更高的比例(33]。一般来说,高土壤肥力和养分有效性有利于细菌社区和低生育率有利于真菌(34]。这个结果可以与suppressiveness菌丝生长的植物病原体r .以上发现在这个土壤(10]。然而,没有殖民地化验r .以上在这工作。关于这一点,绝大多数的自然土壤抑制种子萌发和生长的真菌在某种程度上,这种现象被称为土壤抑真菌作用。此外,有一长串的例子抑制soil-born根病原体通过菌根真菌和细菌(34]。优质土壤DNA样本放大一些真菌18 s rDNA序列,尽管从这个土壤可培养的真菌有被隔离。这可能反映了观察到平皿计数技术支持快速增长的隔离,low-substrate-specific,产孢菌(35),而分子方法支持数值控制真菌相对大量的营养菌丝体。
有些真菌物种青睐和/或受土壤管理,如蔬菜和番茄栽培,土壤相比,原始森林。上下文中提到的培养是很重要的番茄利用多种农药(36),影响土壤微生物的集约管理通常有害的方式,尽管这很难准确地量化(37]。在maize-French bean字段试验观察到有机肥料尤其是农场院子肥料和植物肥料,对真菌的影响人口,其多样性和土壤的物理和化学性质比不添加有机修正案(38]。土壤微生物群落的结构和操作反映了许多生物和非生物因素之间的相互作用。最重要的因素之一是可用有机基质的质量(39]。营养基质的类型是不同的与对比土壤有机质质量,直接影响土壤微生物群落和主动动物群的性质。此外,有机质影响土壤的结构属性,如聚合和曝气,会影响生物体的生长生活在土壤40]。有机物质影响酶活动的内容和大多数酶的活性物质含量增加反映出较高的微生物群,进一步稳定酶的腐殖质材料(41]。土壤宏基因组研究的重要理由提出的低频序列属于真菌,尽管真菌土壤生物量的主要成分,这出现在菌丝的形式,由于这种真菌DNA提取fromsoil大约是10倍低于细菌的DNA提取土壤细菌多样性的研究(42]。
5。结论
番茄栽培出现减少的丰度和多样性相比,蔬菜种植和原生森林土。然而,这个结论必须小心因为土壤采样是局限于选择实验的阴谋。需要有一个更广泛的研究领域找到真菌多样性。发生一些18岁序列未分组的任何门,表明存在的土壤研究的新门。