文摘

白车轴草经常用作豆科作物,作为绿肥,还包括与草牛饲料的混合物。众多的生物效应苜蓿种植的报道已被归因于生物活性次生代谢产物的生产。到目前为止在土壤生物活性次生代谢产物的三叶草已收到有限的注意力。在本文中,我们首次研究类黄酮的释放来自field-grown白三叶草和soil-incorporated白车轴草植物黄酮类化合物的波谱分析的质/女士。主要的类黄酮苷配基芒柄花黄素,medicarpin、山柰酚。Soil-incorporated白车轴草植物产生高浓度的苷kaempferol-Rha-Xyl-Gal quercetin-Xyl-Gal。土壤中大量的山柰酚持续数天而另一化合物降解更快。这些化合物在将来的研究中应考虑土壤疲劳,他感作用的活动,从扩展种植三叶草和潜在的环境风险。

1。介绍

可持续农业实践包括使用豆科植物轮作的土壤氮供应策略限制农药的使用。豆科作物白车轴草经常作为覆盖作物作为绿肥,也包括在混合物与草牛饲料。豆类作为覆盖作物或纳入土壤也可能作为补充甚至替代杀虫剂。几项研究已经报道抑制白三叶草对杂草的影响压力和疾病或原因不明的失败oversown草的草地由三叶草(1- - - - - -12]。次生代谢物被怀疑导致这些影响,释放和基本知识,主动或被动,白车轴草的生物活性次生代谢产物因此急需的。这些知识将帮助一个评估的重要性从白车轴草次生代谢物的生物效应。因此,本研究的目的是阐明模式两类黄酮释放field-grown白车轴草及其浸出与白车轴草植物土壤修正。

2。材料和方法

2.1。白三叶草和抽样的起源

整个白车轴草的植物品种克朗代克地区收集2008年6月,随着土壤深度的15厘米Flakkebjerg有机领域,丹麦土壤(土壤)。小心地从植物原料中删除。确定黄酮浓度和相对分布在不同的植物部分,植物从17×17厘米情节分为根,茎,叶,和鲜花。材料重量,冻干,又重,磨成粉末,并存储在−18°C到分析(见表1)。

2.2。土壤数据

土壤的收集字段用于种植三叶草植物节中描述2。1。分析之前,已筛,冻干,储存在−18°C。之前种植白三叶草品种克朗代克2008年在目前的研究中,领域曾在2003年用于种植白三叶草品种索尼娅用作绿肥,2004年春季大麦和燕麦的混合物,在2005年春天的大麦和豌豆混合饲料生产,在2006年春天大麦undersown米洛的白三叶品种,2007年,米洛的白三叶品种。土壤的特性如下(括号表示颗粒大小):粘土(< 2μ米),16.8%;淤泥(2 - 20μ米),13.2%;粗粉砂(20 - 63μ米),12.8%;细沙(63 - 200年μ米),34.5%;粗砂(200 - 2000年μ米),20.7%;有机碳,1.1%;土壤钾、8毫克/ 100克;土壤总磷,1.9毫克/ 100克;土壤镁,3.9克/ 100克;pH值(H₂O), 6.5;和含水量,4.8%。土壤B,砂壤土土用于掺入实验(见部分2。3)研究浸出和转换,采样2007年春天从30厘米Flakkebjerg传统种植场的丹麦。此前在2003年用于种植冬小麦,2004年对燕麦,大麦在2005年冬天,在2006年春天强奸。土壤B的特点如下(括号表示颗粒大小):粘土(< 2μ米),17.1%;淤泥(2 - 20μ米),21.9%;粗粉砂(20 - 63μ米),14.3%;细沙(63 - 200年μ米),25.6%;粗砂(200 - 2000年μ米),18.8%;有机碳,1.3%;土壤钾,10.4毫克/ 100克;土壤总磷,3.8毫克/ 100克;土壤镁,6.5克/ 100克;pH值(H₂O), 5.7;含水量,4.3%;和持水量(通车),44%(田间持水量,22%)。土壤渗之前使用的是公司的实验。此外,部分土壤冻干和作为一个空白样品以及经济复苏的决心,基体效应,检测极限。

2.3。结合实验

整个植物收集从56.5厘米×36.5厘米×20厘米的阴谋,重(湿重:939.0克),切成1厘米。然后植物材料上沉积34公斤的土壤B在一个塑料容器的同一区域与原始情节但略浅(56.5厘米×36.5厘米×18厘米)。植物材料的干重百分比是0.87%。植物混合物被放置在户外和浇水西隧的一半。孵化期间,与植物混合容器定期称重,含水量是适应广阔的一半。管(直径6厘米,高:4.3厘米)用于采样约190克的土壤在每个采样时间。采集标本在天0,1,2,3,5,6,8,16,从公司的日子白三叶草的植物物质进入土壤。取样后,土壤冻结在−18°C和冻干。所有植物材料手工从土样中删除。土壤样本随后已筛和植物样本的地面。 The mean dry weight of each soil sample was 156  ±  4 g and the mean dry weight of the plant material was 1.3  ±  0.7 g. The dry weight of the plant material removed from soil samples was 0.83  ±  0.11%, indicating that nearly all plant material had been successfully separated.

2.4。解决方案和化学物质

山柰酚(96%)、芒柄花黄素(99%),和coumestrol(95%)购买的丙烯酰胺(Brøndby、丹麦)。槲皮素二水合物(98%)、biochanin(97%),和黄芪甙(99%),买来Sigma-Aldrich (Brøndby、丹麦)。Kaempferol-Rha-Glc(99%)和hyperoside(99%)从罗斯购买(德国卡尔斯鲁厄)。黄素(97%)和染料木黄酮(97%)购买的兰开斯特(Brønshøj、丹麦)。槲皮甙(98.5%)、芦丁(99%)、芹黄素(99%)、isovitexin (99%)、saponarin(99%)、毛地黄黄酮(99%)、luteolin-Glc (95%)、luteolin-di-Glc(95%)、柚苷配基(99%)、黄豆苷(90%),和葛根素(99%)从Extrasynthese购买(Genay、法国)。见表2系统名称和ca数字。Kaempferol-Rha-Xyl-Gal、quercetin-Xyl-Gal quercetin-Rha-Xyl-Gal(表2)从白车轴草分离、纯化和鉴定的紫外线,质量,和核磁共振光谱作为一项研究的一部分13]。Medicarpin是来自诺丁汉大学的Paul m . Dewick博士,英国。股票类黄酮1 g / L的解决方案被溶解在甲醇和二甲亚砜的准备。工作30个化合物的标准解决方案通过串行稀释股票的标准解决方案在35%乙腈和水MilliQ 65% (v / v)包含20毫米醋酸。三个混合标准曲线苷的苷配基,两个都是来自8每个标准浓度,用于量化。

2.5。植物和土壤类黄酮的提取和量化质/女士

每个冻干土壤或植物样本放置在一个50毫升猎鹰管和悬浮在5毫升70%甲醇。土壤样品使用了5 g和0.3克植物样品。样本用近10分钟,提取4 h在室温下一个埃尔(里加、拉脱维亚)Intelli-Mixer 21 rpm。提取后,试管在4200转离心10分钟在贺利氏(Albertslund、丹麦)Multifuge 3因此。移除上层清液,稀释1:1 MilliQ水,过滤缝匠肌(Taastrup、丹麦)SRP 15 0.45μm聚四氟乙烯膜滤器,量化的AB Sciex (Nærum、丹麦)API 2000仪器。一个热(丹麦哥本哈根)BDS海波西尔C18柱(250×2.1毫米id, 5μ米颗粒大小)是用于苷配基,而Phenomenex (Allerød、丹麦)Synergi Polar-RP 80列(id 250×2毫米,4μ米颗粒大小)是用于苷。苷配基分离使用二进制梯度按照下列方法:0 - 3分钟,100%,权力平等主义的;3-13 min, 100 - 20%,梯度;13 - 16分钟,20%,权力平等主义的;16 - 20分钟,20 - 0%,梯度;20分钟0%、权力平等主义的;23 - 24日最小值,0 - 100%,梯度;100%,24-29分钟权力平等主义的。使用二进制苷分离梯度按照下列方法:0 - 5分钟,81%,权力平等主义的;5 - 15分钟,81 - 78%,梯度; 15–28 min, 78–40% A, gradient; 28–30 min, 40–0% A, gradient; 30–35 min, 0% A, isocratic; 35-36 min, 0–81% A, gradient; and 36–46 min, 81% A, isocratic. The flow rate was 200 μL敏⁻¹在这两种方法。溶剂是由7%的水和乙腈溶剂B包含78%的乙腈。两种溶剂所包含20毫米醋酸。质谱检测在多个执行反应模式(MRM)在积极使用大气压电喷雾电离模式苷和苷配基-模式。保留时间和MRM转换(Q1和Q3)表中列出3。相比,色谱峰被分配参考化合物的保留时间和MRM转换。

2.6。分析方法的验证

检测极限(类黄酮)和复苏从土壤被飙升的土壤样本估计B与苷配基的浓度250纳克/克(干重)和苷的浓度150纳克/克(干重),如表所示4。的和恢复苷和苷配基在植物样本估计飙升的样本苋属hypochondriacus简历。Criolla浓度667 ng / g(干重)。答:hypochondriacus因为它是使用缺乏23 27个化合物的研究。样本提取如前所述飙升,但有六个复制。标准偏差,年代测量浓度的计算为每个化合物,和作为3年代。复苏和检测限制植物不能确定芦丁,黄芪甙、槲皮素和hyperoside这些化合物丰富的空白样品。分析方法对山柰酚不敏感,阻碍了槲皮素的不稳定的解决方案。所有其他化合物时稳定保持在室温下74小时。样本类黄酮含量的经济复苏并没有调整比例(14]。浓度测量土壤中被土壤吸附的可用数量不会丢失。最后,有机carbon-normalized吸附系数()四类黄酮苷配基估计使用程序PCKOCWIN从美国环境保护署。

3所示。结果

3.1。恢复期间黄酮类化合物的提取

复苏植物样品(表中的值4)在69年为149%,所有化合物除了quercetin-Rha-Xyl-Gal(173%)和毛地黄黄酮(204%)。类黄酮为土壤样品恢复值低的相比之下,显示重要的土壤吸附。

3.2。在白车轴草类黄酮浓度

黄酮类化合物在植物的分布表中列出5。减少订单的摩尔量/干重,最突出的黄酮类化合物发现芒柄花黄素medicarpinsaponarin根,芒柄花黄素medicarpin > quercetin-Xyl-Gal > kaempferol-Rha-Xyl-Gal在茎和茎,quercetin-Xyl-Gal >芒柄花黄素> kaempferol-Rha-Xyl-Gal > medicarpin > hyperoside传单,hyperoside >芒柄花黄素≈quercetin-Xyl-Gal > medicarpin > kaempferol-Rha-Xyl-Gal > Quercetin-Rha-Xyl-Gal鲜花,和芒柄花黄素> quercetin-Xyl-Gal > medicarpin > kaempferol-Rha-Xyl-Gal > hyperoside在整个植物。苷葛根素、isovitexin槲皮甙,kaempferol-Rha-Glc白车轴草植物和土壤中检测到。黄酮类化合物主要存在苷在植物样品,但糖基化的类型根据不同植物(表内的位置5)。

Medicarpin和芒柄花黄素苷配基为代表的大多数isoflavonoids植物的所有部分。的浓度aglyconic芒柄花黄素最丰富的白色三叶草异黄酮,0.7毫克/克之间不同的根和茎和1.3毫克/克茎(干重)。更高浓度的槲皮素和山柰酚苷配基白三叶花头的观察比传单,茎,茎或根。传单包含quercetin-Xyl-Gal浓度显著高于其他地区的工厂。

3.3。命运在土壤中类黄酮的释放生活白车轴草植物

苜蓿种植了高浓度(所有作为干重)的生物活性苷配基芒柄花黄素(9114 nmol /公斤),medicarpin (832 nmol /公斤)和山柰酚(520 nmol /公斤)发现,土壤中a这些浓度混合领域样本的土壤样本中发现了白车轴草生长的地方。

3.4。类黄酮在土壤修正和白三叶草的命运

的浓度从土壤浸出的类黄酮苷和苷配基产生的修改与植物材料在0 - 1和2 - 5天达到最高水平,分别为(图1)。最丰富的苷配基可以从soil-incorporated三叶草中过滤出来是一样的大多数在苜蓿种植时释放(t表示浓度最大值的时间):芒柄花黄素(10.2更易/公斤,天),medicarpin(3.9更易/公斤,天),山柰酚(1.4更易/公斤,天)。其他苷也发现:kaempferol-Rha-Xyl-Gal(3.4更易/公斤,天)和quercetin-Xyl-Gal(0.5更易/公斤,天)。其余的分析化合物只出现在小金额或没有发现(图1)。所有浓度作为干重。

4所示。讨论

4.1。黄酮类化合物在植物的分布

我们以前不仅表明类黄酮糖基化的存储也苷有额外的植物中的生物功能13]。因此,测量和苷配基糖苷衍生物是重要的在调查类黄酮在白车轴草植物的作用。黄酮醇的总含量远高于isoflavonoids和黄酮在传单和白车轴草植物的花,而isoflavonoids更丰富的茎,茎和根。isoflavonoids和黄酮可能有其他比黄酮醇的生物功能,因为它已经表明异黄酮芒柄花黄素的浓度和黄素在白车轴草的根增加病原体感染的根腐霉属最后(15]。

先前的报道总异黄酮浓度的白车轴草植物介于0.09和1.0毫克/克之间干重(12,16- - - - - -19),与isoflavonoids主要发生糖苷轭合物(20.,21],芒柄花黄素葡萄糖苷(di)丙二酸酯(s)和白车轴草的主要isoflavonoids medicarpin-glucoside-malonate植物(19,21]。在我们的研究中我们没有量化糖共轭的芒柄花黄素或medicarpin,但是这两个化合物的苷配基的浓度很高相比以前的报告。浓度的升高可能是由于品种之间的差异,分析方法,或生长条件。另外,芒柄花黄素和medicarpin苷可能发生了水解之前或期间的分析。

Hyperoside浓度代表很大一部分的总类黄酮含量(表白车轴草花朵5),这与先前的报道是一致的的hyperoside花(13,22]。Hyperoside,槲皮素- (6′′-O3 -乙酰基)O半乳糖苷(槲皮素acetyl-Gal)和myricetin-3 -O半乳糖苷(myricetin-Gal)已报告的主要黄酮类化合物白车轴草的花(22],hyperoside也报道的一个主要从花中黄酮类化合物的实验种群选择prodelphinidin含量高(23),表明两者之间的相关性。

按照我们之前的结果(13)的浓度槲皮素和山柰酚苷配基在白三叶花头发现更高的比传单,茎,茎或根(见表5)。黄酮醇苷配基已经被分离出来并确认为生产功能性花粉管所需的活性化合物CHS200佩妮不足,活动是为山柰酚和异鼠李亭最高,其次是槲皮素、杨梅酮(24]。高浓度的槲皮素和山柰酚苷配基在花头因此可能由于这些化合物参与花粉生育能力。

传单的品种克朗代克quercetin-Xyl-Gal浓度明显高于其他地区的工厂。同样的,我们之前报道的相对浓度quercetin-Xyl-Gal和kaempferol-Xyl-Gal传单和茎而不是花13]。其他研究已经表明,白三叶叶片中最丰富的黄酮类化合物槲皮素和山柰酚衍生物,与quercetin-Xyl-Gal kaempferol-Xyl-Gal UV-B-irradiated植物中最重要的是(25,26]。值得注意的是,这些黄酮类化合物也证明防止UV-B-induced压力,和他们的位置在传单符合需要紫外线的应激反应。槲皮素和山柰酚苷的浓度(见表5)与那些报道UV-B-irradiated植物,而低浓度在控制植物被发现(25品种间差异),这表明,生长条件,分析方法可能掩盖一个假定的紫外响应。定量使用二极管阵列检测植物代谢产物的高效液相色谱分析中执行引用研究常矩阵受到严重的干扰,甚至可能是不可避免的在固相萃取预处理后(27]。

4.2。命运在土壤中类黄酮的释放生活白车轴草植物

当根积极释放化学物质,它们可能调控土壤微生物群落,促进有益的昆虫,抑制竞争的植物的生长28,29日]。更高浓度可能已经发现如果土壤样本收集根近多了。芒柄花黄素可以刺激经济增长的白三叶芽和殖民和根瘤数量的菌根真菌30.),芒柄花黄素和medicarpin可以抑制致病性真菌(径向生长31日]。这些化合物的释放可以明显影响白车轴草的生长。差异的能力和机制释放这些化合物的各种各样的白三叶品种需要进一步研究。很有可能,然而,测量化合物流露出三叶草根没有微生物改造时发生在足底(13]。

4.3。类黄酮在土壤修正和白三叶草的命运

类黄酮的白三叶品种克朗代克河是从植物淋滤后并入土壤。大多数类黄酮苷的降解土壤中发生迅速,恰逢苷配基的丰度增加。我们之前报道,大多数品种的类黄酮的浓度土壤亚兰和Rabani,分别为1.7和2.5倍,克朗代克河(13]。根据品种和生长条件,类黄酮浓度在不同的土壤环境中因此可以高于观察在这个研究。

免费的糖苷配基山柰酚,成立后的土壤中检测到白车轴草的植物,可能会渗透到土壤的自由形式,最有可能kaempferol-Rha-Xyl-Gal退化和kaempferol-Xyl-Gal之后形成的。后者化合物是不包括在这项研究作为一个标准是不可用的。Carlsen et al。13之前),然而,表明这种化合物是主要的白车轴草黄酮类化合物之一。最高的山柰酚浓度被发现在5天(1355 nmol /公斤干重)对它有所下降后再次上升。山柰酚停留时间的土壤仍有待调查但可能影响山柰酚或其衍生品在随后的作物不应该打折,因为山柰酚可以抑制线粒体磷酸化在玉米、原浆流在燕麦根头发32- - - - - -34),和黄瓜hypotyls线粒体ATP形成根,玉米胚芽鞘,豌豆根(32]。山柰酚是否autotoxicity是苜蓿土壤疲劳应该调查的一个因素。

三叶草植物进入土壤后,芒柄花黄素浓度几乎翻了一倍达到天3和5之间的最大。这可能是由于释放和随后的芒柄花黄素苷的降解三叶草植物。芒柄花黄素苷没有测量在这项研究中,但是一些formononetin-glucoside——(di)丙二酸酯(s)是已知的主要isoflavonoids白车轴草(19,21]。在一些情况下,芒柄花黄素已被证明是退化黄素在由细菌或真菌的环境中(12]。之间的时间差所观察到的这些化合物的最大浓度(与d,表6)可能会出现因为芒柄花黄素引起的退化,大,最大的大豆苷浓度。第一个最大的大豆苷浓度,相比之下,可能源于糖苷黄豆苷的降解。从天0 - 3 medicarpin的浓度增加,然后迅速下降。芒柄花黄素的能力和medicarpin白三叶增长发挥重要的积极作用,因此丛枝菌殖民似乎只存在在早期阶段,或者当发布在增长。

Quercetin-Xyl-Gal的浓度从第0天迅速下降到第三天。没有显示槲皮素产生糖化的退化形式,但这可能是由于低恢复土壤(表的槲皮素4)。

4.4。环境风险从类黄酮

最丰富的黄酮苷配基检测土壤中芒柄花黄素,medicarpin、山柰酚。这些化合物在土壤的总浓度修正与白三叶草植物,是几乎肯定会高于实际决定在这个研究。复苏实验提出重要的土壤吸附反映在减少可抽出的浓度。尽管检测槲皮素糖苷配基很穷,高浓度的配糖体被发现,这类黄酮应该包括在未来的研究中。的这四个苷配基值估计使用PCKOCWIN如下:山柰酚,327;槲皮素,510;芒柄花黄素,1600;medicarpin, 33570。相比之下,一个实验值1318已经报道了芒柄花黄素(35]。浸出的槲皮素和山柰酚地下水因此可能和应该被包括在整体风险评估在未来,记住的不仅仅是合成农药化合物可以农业实践或人类的健康都有负面影响。

确认

作者感谢Paul m . Dewick博士medicarpin诺丁汉大学提供一个示例。这个项目被奥尔胡斯大学资助的内部。