文摘
Aroclor 1260分析了微生物污染的土壤样本PCB脱氯的潜力,即病原反应一步完成PCB退化。平均氯联苯整个网站表明不同利率的变化原位随着时间的推移发生脱氯。分析PCB转换(有氧和厌氧)微生物群落和脱氯潜在揭示空间异质性假定的PCB phylotypes转换和脱氯的活动。一些土壤样品抑制PCB脱氯在活跃的沉积物从巴尔的摩港表明金属或有机cocontaminants可能导致观察到的异质性原位脱氯。生物强化多氯联苯污染的土壤样本从4.6到265 ppm, PCB脱氯细菌的纯培养Dehalobium chlorocoerciaDF-1也产生了不同的结果和重要的风化多氯联苯脱氯中观察到一个位置。土著的检测PCB dehalorespiring活动结合公认的脱氯的检测土壤中细菌和联苯加双氧酶基因聚合表明土壤中多氯联苯的潜在存在完全矿化。然而,在沉积物相比,微生物的不同的分布,多氯联苯,和抑制cocontaminants是发展的一个重大的挑战原位微生物处理PCB土壤的影响。
1。介绍
多氯联苯是持久性有机污染物在环境中仍然存在,尽管1976年美国禁止生产(1]。在此之前,商业的多氯联苯混合物(在美国贸易名称Aroclor)是用于各种工业应用如高压变压器、绝缘材料、液压液体(2,3]。多氯联苯与高亲和力疏水吸附在土壤颗粒和生物体内积累脂质引起hepato免疫毒性,人类致癌作用,影响内分泌器官和生殖(4,5和动物6]。删除网站的多氯联苯的影响,因此,是几十年的监管重点(7]。
多氯联苯污染的土壤可以找到全球工业活动的结果(8]。然而,大型异构性问题在污染物浓度和微生物种群被观察到,当多氯联苯和其他污染物的总浓度进行评估宏观和微尺度(9,10]。在某些情况下,非均质性的原因是由于污染的来源等有机污染物从一个铝厂,那里有一个减少污染物梯度离厂(11]。即使在情况下没有一个特定的源,土壤的物理和环境条件参与形成的土壤总量多氯联苯导致异质性的空间分布影响微生物活动(12,13]。尽管土壤物理异构性问题,之前的研究已经表明,这种变化不是一个关键因素为土壤微生物的组成社区(14]。先前的报道表明,风化多氯联苯污染的网站是顽固的微生物脱氯(15)由于隔绝的PCB分子在土壤颗粒的孔隙16]。多氯联苯的解吸取决于分区之间的PCB分子孔隙水和相关有机物分子的扩散。有人建议,形成强大的债券之间的PCB分子和土壤颗粒可能会导致解吸电阻(16]。
完整的微生物降解多氯联苯需要广泛的厌氧还原脱氯氯化同系物其次是后续有氧的乳沟更广泛的氯化联苯环和矿化的副产品(17,18]。几个内厌氧细菌Chloroflexi已确认,包括PCB脱氯活动Dehalococcoides ethanogenes,(19),Dehalococcoidessp。CBDB1 [20.),Dehalobium chlorocoerciaDF-1,细菌o-17 [21],phylotypes SF-1和DH-1022]。相比之下,有氧PCB退化等许多细菌物种可以执行的伯克xenovorans应变LB400 [23),红球菌属sp.应变RHA1 [24),和细菌利用联苯是分布式环境中无所不在地25]。联苯2,3-dioxygenases被认为是PCB的氧化途径降解的关键酶,bphA1可以降低特定PCB副产品(26)和bphC extradiol元劈理(27]。在土壤环境中,生物强化降解菌与有氧PCB已成功应用(28,29日),而厌氧生物强化此前只显示成功连续厌氧颗粒污泥和沉积物和土壤的混合物(30.]。
在这项研究中,空间分布的假定的有氧和厌氧细菌参与PCB转换研究第一次PCB-contaminated土壤。土著厌氧脱氯作用潜力映射空间整个网站使用固定网格建立之前的抽样事件。此外,与PCB脱氯微生物厌氧生物强化的效果评估。
2。材料和方法
2.1。细菌培养的生物强化
Dehalobium chlorocoerciaDF-1孤立从查尔斯顿港的沉积物被保持在实验室望见之前(31日]。d . chlorocoerciadechlorinates双侧面帕拉或元的位置。
2.2。样品收集
样本收集Mechanicsburg astorm排水沟渠的爸爸从源头在40°13′46.16”38.51 N, 76°59′”W大约730米的下游40°14′06.60”32.50 N, 76°59′”w .开放的排水沟,收集雨水径流的海军支持活动基地及周边军事基地外的特性,扩展了大约2.4公里从起源到融合Trindle Spring运行。不同级别的多氯联苯污染的样品收集与60厘米,5厘米(OD)岩心取样器从上30厘米的土壤。总共19收集土壤样本(图1)和厌氧储存在密封的玻璃瓶在黑暗中在4°C和加工1 - 3周后。
2.3。多氯联苯的提取和分析从土壤样品和缩影
多氯联苯在样品的总浓度以牺牲样品如前所述[32]。短暂,样本提取之前,上覆水被卸载从土壤中分离,剩下的样本与无水硫酸钠混合。以下的代理人PCB-14, pcb - 65和pcb - 166,上覆水样本在己烷动摇,而固体样品提取声波降解法在25毫升1:1丙酮:己烷六分钟后环保局3550 b方法。提取被汇集和溶剂交换进行更换和己烷溶剂。PCB清理方法是基于EPA SW846 3660 b(活化铜治疗),和3630 c(硅胶治疗)。清理后获得的体积稀释根据质量保证协议,并分析了PCB同系物使用安捷伦6890气相色谱仪配备microelectron捕获检测器。
2.4。微生物活性测定
微生物脱氯活动分析是用来确定潜在的脱氯活动土著微生物群落的土壤样本如前所述[33]。短暂,10毫升low-sulfate矿物F-medium [34)制备了厌氧和同类2,3,4,5,6-CB (AccuStandard, CT)添加到50 ppm的最终浓度丙酮(10μL添加)。一式三份的文化土壤注射4.0 g(湿重)。消极的控制由高压灭菌法两次20分钟在121°C,接种后三天前添加PCB。文化是在黑暗中孵化30°C和1毫升次级样本收集的PCB分析厌氧手套箱后0,52岁,75年,105年,130年,163年,200天。
抑制脱氯的活性评估修改上述活动分析。沉积物从巴尔的摩港(2 g)证实了脱氯活动与测试混合土样(2 g) E-Cl介质和分析PCB脱氯。采样后PCB分析0,50岁,75年,100年,150年,214天。
2.5。DNA提取
DNA提取(一式三份),0.75 g的土壤转移到无菌微型离心机管包含大约1 g的0.1毫米氧化锆/硅珠(BioSpec产品,Inc . OK)紧随其后的200年μL 1 x TE缓冲,150μL磷酸盐缓冲剂的pH值8.0(0.12米)和150年μL 1 x TS-SDS缓冲区。手工样品和缓冲涨跌互现摇珠打30岁之前使用FastPrep120速度“4.5”(Q-Biogene, CA)。核酸提取和纯化进行了使用苯酚/ chloroform-based协议前面描述的(35]。
2.6。假定的PCB脱氯细菌检测和枚举
枚举的假定的脱氯在土壤样品进行了细菌由竞争性PCR试验如前所述(一式三份33)使用348 f - 884 r基因引物组16 s rRNA。确认潜在的PCR抑制剂没有coextracted,所有样本测试与通用并行16 s rRNA基因引物组341 f / 907 r (36,37]。所有样本网站显示阳性结果与显示设置的通用引物分析检测中假定的脱氯phylotypes丰度大于的检出限基因拷贝μl−1。枚举16 s rRNA的基因副本cPCR试验的规范化的干重含量土壤样本。一16 s rRNA基因复制细胞基因组序列的基础上Dehalococcoides ethenogenes(38]和CBDB1 [39]。DNA提取效率测试通过提取不同数量的均质土壤和测量DNA浓度在280 nm分光光度计。结果显示线性萃取效率范围从0 - 4 g土壤干wt(数据没有显示)。
2.7。检测潜在的有氧降解菌PCB
假定的PCB有氧降解细菌检测到功能基因的PCR扩增良性前列腺增生一个和良性前列腺增生C,对PCB编码转换酶联苯加双氧酶和2,3-dihydroxybiphenyl 2-dioxygenase分别。检测bphA进行引物组bphA40-F / bphA50-R [26),而检测bphC进行引物组P42D-F / P43U-R [27]。PCR是在50岁μL反应卷使用以下GeneAmp试剂(应用生物系统公司,培育城市,CA): 10毫米Tris-HCl, 75毫米氯化钾,每个核苷酸在混合的0.2毫米,1.5毫米MgCl2,2.5 AmpliTaq DNA聚合酶的单位,每个引物的50点,1μL的DNA模板,和34.5μ无核酸酶的水。放大的bphA片段进行如下(40周期):变性为60年代在45°C,引物退火在31-49°C为3分钟,在72°C 4分钟伸长,最后一个步骤在4°C。放大的bphC片段(35周期),下列条件:应用变性在95°C 30年代,60年代引物退火在35°C, 72°C伸长3分钟,最后在72°C扩展步骤10分钟,在4°C和最后一个步骤。PCR产品正确的长度经用1.5%的琼脂糖凝胶电泳。伯克xenovoransLB400 [23)是用于PCR协议的验证良性前列腺增生一个和良性前列腺增生在PCR扩增C和积极的控制。
2.8。生物强化的缩影
总共4 g的土壤(湿重)接种到一式10毫升的厌氧准备矿物介质(41)在25毫升厌氧菌管密封在N2有限公司2用聚四氟乙烯隔膜(80:20)。没有添加除了电子给体介质中的组件(0.0125% w / v半胱氨酸)和残余氢(v / v)≤5%存在于厌氧手套箱用于接种的气氛和取样的缩影。d . chlorocoerciaDF-1增长到大约107细胞每毫升与PCE,清除与N2/公司2去除残留的PCE和氯乙产品可能导致脱氯的“启动”活动。2毫升的文化被接种到土壤微观。Nonbioaugmented控制包括介质和土壤含有没有DF-1土著微生物。控件包含介质为非生物活动,包含土著微生物的土壤,和DF-1被连续的高压灭菌消毒1小时天0,2和4。
2.9。微生物群落分析
社区分析变性高效液相色谱(DHPLC)使用一波3500 HT系统(Transgenomic,奥马哈,NE)和16 s rRNA基因引物348 f / 884 r如前所述33]。16 s rRNA基因片段分析了20μL注入量和分数在96孔板的收集(Biorad大力神,CA)。分数是干使用莎凡特SpeedVac系统(热电子公司,沃尔瑟姆,MA)溶解在15紧随其后μL nuclease-free水。每个DHPLC分数排序5′和3′方向与250点的引物348 f或884 r,分别在5% DMSO减少潜在的二级结构影响使用BigDye终结者v3.1(应用生物系统公司,培育城市,CA)设备/制造商的指令和ABI 3130 XL自动化毛细管测序DNA定序器(应用生物系统公司,CA)如前所述33]。提交的16 s rRNA基因序列和基因序列从NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)被编译和使用自动对齐核酸对准器BioEdit序列比对的编辑器。总共有13个包含大约530个核苷酸序列明确一致和用于计算树的邻居加入和惠誉方法在PHYLIP软件(使用默认设置http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)。引导分析(1000复制)进行使用PHYLIP包。
2.10。核苷酸加入数字
16 s rRNA序列的基因库加入数字摘要JF412634-JF412646报道。
3所示。结果
3.1。土壤样品的物理和化学特性
19地点收集土壤样本中心的雨水排水沟侧翼银行的床上,在每个增量距离入口约365 m下游除了五个地点之间的365和730 m下游从入口(图1)。从银行采集土壤样本都是潮湿的,而干燥和潮湿的土壤样本收集从沟里的中心。土壤没有收集到沟里的中心在进口,因为只有在基岩顶界面上有1 - 2厘米的土壤由于沉重的雨水侵蚀事件,但这与距离入口层深度增加。土壤样本收集超过365下游被淹没在水取样的时候。19采样点总PCB浓度范围从2.3 -265 ppm平均为32.8 ppm (±58.9 ppm),(表1)。东银行最高浓度检测最近的入口(Meb2),而最低浓度检测在约旦河西岸Meb11取样位置。氯原子的平均数量在每个站点范围从6.36 - -6.61,平均为6.50(±0.053),这是类似于平均6.4观察Aroclor 1260(表1)。PCB同系物的分布类似于之前的研究A1260 A1260,据报道是唯一Aroclor发现在这个网站42]。在一些样品,更高浓度的四氯化同系物观察(表1)。tetrachlorinated同系物的高位发现并没有与任何已知的氯化coelute non-PCB化合物包括杀虫剂和硫磺表明他们可能多氯联苯。研究结果表明,原位多氯联苯脱氯作用发生在某种程度上在这些样品。
3.2。土著微生物群落的特征
细菌被发现在18 19样品使用通用16 s rRNA细菌引物(表2)。相比之下,假定的厌氧脱氯和假定的有氧降解细菌中发现只有10样本使用特定的引物脱氯Chloroflexi和bphA/bphC基因,分别(表2)。在七个地点,假定的有氧和无氧PCB转化细菌被发现在相同的样本。假定的厌氧细菌脱氯的数量范围从5·1035·106脱氯细菌g−1土壤,而下面的数字在几个地方枚举的检测极限,但发现存在。假定的有氧降解细菌的数量不确定系统种类繁多的细菌。
假定的脱氯的人口DHPLC了细菌在16 s rRNA的三个样本基因副本最丰富(Meb6、Meb7 Meb8)相比,序列已知的细菌在PCB脱氯Chloroflexi组(图2)。五的13个确定phylotypes分组紧密合作的进化枝中Dehalococcoidessp.和剩下的八个phylotypes分组在更广泛的o-17 / DF-1Chloroflexi组。没有趋势观察样品的位置和确定phylotypes,因为从三个位置位于phylotypes整个系统发育树。这个观察表明土著人口phylotypes异构整个网站。
3.3。脱氯土著社区活动
土著脱氯作用潜力的土壤样本中检测使用2,3,4,5,6-CB代孕,这是充满了氯联苯环。活动中检测出六个(表19个样品3)。脱氯率最高(6.93±5.33·10−3摩尔% 2、3、4、5、6-CB×天−1)以Meb16和最低(0.93±1.70·10−3摩尔% 2、3、4、5、6-CB×天−1在Meb17)。观察产品的脱氯2,3,4,5,6-CB主要是2,3,4,5-CB / 2, 3, 5, 6-CB,但2,3,6-CB, 2, 6-CB Meb10样品中检测到。剩下的13个样品没有显示任何脱氯活动后200天的孵化cPCR尽管公认的脱氯检测细菌的消极的一些样品。
3.4。土著污染物对经济活动的影响
没有检测到脱氯活动在一些假定的脱氯phylotypes尽管检测样品的进一步检查,以确定高浓度的多氯联苯或其他污染物抑制活动。土壤活性样品混合沉积物从巴尔的摩港biocatalytically活跃,医学博士,转换2,3,4,5,6-CB 2, 4, 6-CB通过还原脱氯作用两种元的位置。所有测试样品包括沉积物从巴尔的摩港,迟滞期不到50天,终端高原范围6 - 46摩尔% 2,3,4,5,6-CB(表4)。从7 - 12·10脱氯率不同−3摩尔% 2、3、4、5、6-CB一天−1,最活跃的网站约25%活动比仅在巴尔的摩港沉积物。收集土壤样本(Meb7)最远的远离排水沟的入口,有公认的脱氯细菌的数量最多,有高含水量比其余的样品。混合样品的脱氯率都高于或水平活动分析(表中所观察到的类似3)。在所有样品测试,脱氯的最终产品是2,4,6-CB,黑洞活动的特点,而不是tetrachlorinated同类产品主要发现在本土沟缩影,表明土著BH脱氯活动占主导地位。一个统计学评价(学生的t以及, )表明,显著抑制被发现只有样品Meb6和Meb18(脱氯高原)和Meb17(脱氯率和高原)。
3.5。生物强化的效果
生物强化细菌纯培养的PCB脱氯DF-1测试与土壤微观从三个位置包含约5 ppm (Meb10), 73 ppm (Meb20),和265 ppm (Meb2)总饱经风霜的多氯联苯。这些位置选择不同浓度的基础上多氯联苯。只有双侧面的具体脱氯氯原子,这种生物可以很容易区分单侧面和unflanked脱氯的氯原子的土著人群。控制与土著人群没有DF-1和热压处理过的控件显示没有明显的脱氯。在bioaugmented缩影,重要的观察脱氯Meb10 (5 ppm),(表5)。除了DF-1,高纯度的土著文化PCB脱氯微生物从MEB10富含2,3,4,5,6-PCB也用于bioaugment Meb2,但发现脱氯作用无显著影响。评估变化的相同器官分布表明,DF-1活跃于Meb10(图3),显著减少七- octachlorinated同族体和利乐,pentachlorinated副产品显著增加。显著降低的副产品是45 33 22′′′6 (pcb - 175), 22′33 55′′66′/ 33 22′′44 44′′5′6/233 (PCB-202/171/156), 22′33 455′′(pcb - 172), 22′344 55′′(pcb - 180), 22′′33 44 44′′′5/233 56 (PCB-170/190)、55和344年22′′′′6/22 33 44 56′′′(PCB-203/196)。所有副产品dechlorinated远远超过控制包含两个检查仪元和帕拉定位同系物除了pcb - 175和- 171只包含检查仪元定位氯和pcb - 202不包含任何检查仪元或帕拉定位氯。然而,后者同类coeluted pcb - 156(50%和-50%),其中包含两个检查仪元和帕拉定位氯。在样品Meb20 Meb2含有更高浓度的PCB,生物强化与DF-1没有任何明显的影响(数据没有显示)。
4所示。讨论
细菌的有氧能力PCB退化被发现在土壤环境中无所不在地和几个已经被分离出来并标识,属于属等假单胞菌,洋葱,Ralstonia,无色菌,Comamonas,芽孢杆菌和红球菌属(25,44]。虽然厌氧脱氯活性在土壤中发现了基于活动的方法在几个加拿大的军事设施,如Saglek拉布拉多(45),决议岛,努30.),安大略省和奥尔巴尼堡(46),厌氧PCB脱氯从土壤细菌尚未确定之前。这是第一个研究结合在PCB影响土壤微生物群落分析和基于活动的技术。活跃的细菌脱氯的存在是一个重要的顺序退化过程的第一步,需要减少大量氯化联苯同系物减少氯化副产品可以受到微生物的有氧环裂2,3,3,4-dioxygenase活动,随后可以被其他有氧微生物矿化。
排水沟的土壤检测在这项研究中,PCB污染主要源于A1260污染(42]。四氯化同系物的存在非典型Aroclor 1260结合识别的假定的PCB电路板脱氯的脱氯phylotypes和检测活动建议原位脱氯作用发生在这个网站。确定的13 phylotypes集群内的脱氯Chloroflexi集团内的Dehalococcoides进化枝(47- - - - - -49]在更广泛的Chloroflexi进化枝,包括其他确认PCB脱氯细菌等Dehalobium chlorocoerciaDF-1和应变o-17-group [50]。在前两个报告在PCB污染土壤细菌群落,细菌密切相关变形菌门,Holophage-Acidobacterium门,放线菌,Plantomycetales和噬纤维菌目被确定(51,52]。有趣的是,优势种包括属洋葱和Variovorax在一起Sphingomonas物种,Rhodophila globiformis小组成员,Acidobacterium capsulatum,耗氧降解多种有机污染物包括多氯联苯。然而,厌氧细菌脱氯和任何相关phylotypes脱氯Chloroflexi被确定。
当前的研究之前,PCB脱氯细菌只有在沉积物被确认。因此,假定的厌氧脱氯检测细菌和还原脱氯的活动检查土壤样本表明,微生物多氯联苯dehalorespiration也发生在土壤中。假定的有氧降解菌PCB也发现在排水沟的几个地方,这表明自然衰减的多氯联苯可能发生在土壤连续厌氧脱氯有氧降解紧随其后。然而,大型空间异质性与电路板相关的无氧和有氧phylotypes转换生物修复的可能是一个障碍。类似的异质性观测报告对土壤重金属污染的研究(9和多环芳烃11]。在第一项研究中,发现样本收集1厘米距离内可以有一个10000倍的不同代谢潜力和金属浓度不符合代谢潜力(9]。在另一份报告,微尺度异构性问题中多环芳烃污染土壤是由砂和粉砂的粒径分数,这影响了多环芳烃浓度和可用性(11]。这之间的行为符合观察细菌和粘土矿物污染的土壤中多氯联苯(12]。这里,它发现土壤聚合物被称为“泥窝”住细菌创造一个小环境,这将限制PCB可用性和构成一个碳的主要碳源有限的环境。这些观察宏观和微尺度的空间异质性与观测相一致的空间变异性的细菌参与土壤中PCB转换在当前的研究中。
假定的脱氯细菌的数量是2至5数量级低土壤与沉积物相比,在大约108细菌/ g沉积物已报告(33]。脱氯率较低的土壤与沉积物表明整体脱氯作用潜力降低。缺乏相关性脱氯细菌的数量和土壤样品的脱氯率可能是由于局部环境条件。例如,大多数的土壤样本抽样时湿润但不被淹没在水中沉积物样品。在研究模拟疏浚底泥与300 ppm A1248飙升,据报道,脱氯活动时降低含水量减少,导致滞后的脱氯A1248 [53]。退化等污染物在土壤中石油烃的研究还表明,土壤中水分含量影响降解率(54]。
可能减少土壤中水分含量样品的结果可能会暴露在氧气负面影响厌氧脱氯。在产甲烷颗粒的研究能够A1254脱氯,暴露在氧气没有显著影响脱氯活动(55]。在六个月内,80%的初始浓度的A1254 dechlorinated在样品暴露在氧气中一个星期。这种快速的脱氯的原因可能是在microniches生物膜的形成,保持厌氧尽管表面的颗粒接触氧气。Microniches土壤会导致时空异质性等参数氧气、pH值、氧化还原、营养以及多氯联苯(12,54]。因此,另一个因素影响了空间变化的脱氯率土壤样品中可以观察到异构含水率影响生物膜的形成和支持社区的厌氧microniches脱氯的细菌。
成功的生物强化风化Aroclor 1242土壤中富集培养从哈德逊河之前已经观察到的56]。在报告中,元脱氯19周后观察孵化的氯含量平均降低0.7个氯联苯。另一份报告,评估顺序的影响好氧处理从Saglek A1260受污染的土壤,拉布拉多,加拿大,45)发起的脱氯浓缩,显示氯含量平均下降1.2个氯联苯一起重大的同族体转变三个月后的厌氧生物强化45]。在当前的研究中,生物强化A1260污染土壤的纯培养d . chlororcoercia导致了20周后只有0.4个氯联苯。正如预期的那样,脱氯的双重夹击元- - -帕拉定位观察氯原子,但至少有一个产品是观察到的不可能是由于DF-1活动形成的,这表明d . chlororcoercia可能刺激议的脱氯氯的土著人口脱氯,可能由于启动土著人群的中间体产品。bioagumentation后脱氯的刺激活动d . chlororcoercia据报道之前(57]。相对较低的土壤中脱氯率形式Meb10和缺乏增强脱氯的两个其他bioaugmented网站可能已被其他污染物引起的抑制等金属和/或其他有机污染物(58]。
在这项研究中,细菌参与PCB转换的空间分布研究1260年Aroclor受污染的土壤含有重金属和有机cocontaminants。结果表明,厌氧细菌PCB dehalorespiring在场和主动。检测的基因编码联苯加双氧酶基因表明存在潜在的自然衰减连续厌氧dehalorespiration和有氧降解。尽管最近的一项研究证明了潜力原位生物强化(PCB影响沉积物的治疗57),固有的空间异质性土壤在当前的研究中有着深远的影响的能力转换多氯联苯作为bioaugmented样本显示的只有一个积极的影响。有效的策略原位PCB-impacted土壤的生物修复可能需要额外的补救治疗如洪水前土壤生物强化提供相应的含水量,添加碳源来创建一个充分减少dehalorespiration环境,和降水可能抑制重金属或并发的或连续的生物修复与生物催化剂专门针对潜在抑制有机混合污染物的暴露。结果说明与发展相关的一些挑战原位PCB影响土壤生物修复策略。
确认
这项工作是支持海军研究办公室的一部分,美国国防部,格兰特n000014投资者- 03 - 1 - 0035苗圃和格兰特n000014 H.D.May - 03 - 1 - 0034;美国国防部、战略环境研究和发展项目的项目编号er - 1502和er - 1492投资者苗圃除了帐面价值的研究经费从菲利普斯Kjellerup口腔健康照顾DHPLC分析方法的发展。作者感谢安装修复项目经理杰弗里·a·亨宁对他的支持和帮助来获取样本和网站信息。