文摘
土壤细菌表现出短期群落结构的变化,提供的人为干扰。在这项研究中,微生物生物量碳(MBC),潜在mineralizable氮(中性粒细胞),社区层面生理分析(CLPP)和文化相关的DGGE指纹(CD DGGE) 16 s rRNA基因被用于比较微生物群落在有机农场和牧场土壤受到不同农艺治疗。相关性分析显示MBC之间的重要关系,中性粒细胞和数据来源于微生物群落分析。所有措施分离土壤类型,但不同的能力在土壤类型区分治疗。MBC,总体而言,中性粒细胞,CLPP肥料和粪肥修正案反应最敏感,而CD DGGE解决不同的豆类作物和无机受精。结果支持假设可耕种的土壤细菌是响应总微生物群落的一部分,敏感农艺扰动和适合进一步的研究旨在土壤群落结构与功能。
1。介绍
微生物发挥重要作用在有机物质分解、养分循环和植物生产力1,2]。参数,将不同的微生物种群集成到单个措施,如微生物生物量碳(MBC)和潜在mineralizable氮(中性粒细胞),历史已经证明是有用的土壤质量和广泛采用的措施(3,4]。微生物生物量C包含一个小不稳定的土壤总有机碳对土壤肥力变化响应积极,支持土壤聚合,并且可以与环境因素如气候、土壤水分,质地和有机质质量5]。潜在mineralizable氮土壤提供了一个索引的nitrogen-supplying能力和与其他化学和物理指标呈正相关土壤质量的4]。
各种措施在微生物群落的功能和结构多样性已经被提议作为适当改变土壤质量指标(3,6]。社区范围内土壤功能多样性的生理分析(CLPP)措施描述的相对利用一套碳基质。基层生理分析是一种文化浓缩的方法,主要特征并选择对于快速发展的生物可能不同于占主导地位的细菌在土壤接种物7,8];因此,CLPP数据有时是质疑的生态意义9,10]。然而,众多研究表明,CLPP适当回应各种农艺扰动(11- - - - - -18]。
开发了几个方法描述微生物结构多样性依赖核酸提取其次是基因扩增和社区指纹19,20.]。指纹识别技术不能解决总物种丰富度,只有轮廓的一小部分总细菌的多样性取决于每个人的解决方法(21,22]。当前范式的州文化无关的分子方法提供更好地表征土壤细菌群落,从理论上包括小说,数值丰富,但difficult-to-culture团体等Acidobacteria和Verrucomicrobia(23- - - - - -26]。然而,另一种假说表明指纹容易可耕种的细菌可能是人为扰动响应更快,因为他们经常表现出快速增长和生产大量的生物质(27]。最近,我们调查了一盘洗方法构建文化相关的变性梯度凝胶电泳(DGGE)光盘档案的16 s rRNA基因(28]。我们报道了CD DGGE分析不同的分数不捕获使用文化无关的土壤细菌群落DGGE。此外,CD DGGE凝胶显示清晰的条带模式足够的复杂性和可变性研究微生物群落的差异。本文的目标是:(1)检查CD DGGE指纹牧场的响应性和有机农场土壤暴露在不同的生育制度和(2)探索潜在的CD DGGE概要文件之间的关系和MBC,中性粒细胞,CLPP。
2。材料和方法
2.1。描述字段的网站
西弗吉尼亚大学(西弗吉尼亚大学)研究有机农场位于Monongalia县西维吉尼亚州,美国N,W)。在农场土壤Dormont和格恩西岛淤泥这种(细肥沃的混合,superactive,湿度适中的,Oxyaquic Hapludalfs) (29日]。市场花园有一个完全随机设计有四个情节(每治疗(4.9×7.6米)30.]。治疗包括生育输入(堆肥和绿肥)和年度轮作植物四个家庭(豆科、茄科、葫芦科、菊科)。高投入的土地收到堆肥牛粪(堆肥1:1牛粪和落叶应用于22.4毫克基于湿重)和绿肥由大约等量黑麦(Secale cereale)和野豌豆(野豌豆属摘要)应用于大约10毫克和耕作土壤种植前1 - 3天。低投入的情节只有绿肥应用如上所述。治疗应用于情节在4月底和5月初。堆肥的细节分析、土壤肥力和作物产量在这些情节曾被所在报道(30.]。
西弗吉尼亚大学Reedsville实验农场坐落在普雷斯顿县,西维吉尼亚州,美国N,W)。在农场土壤中映射-吉尔宾(fine-loamy、混合、半活性介子的象征性的Hapludults)和沃顿商学院(fine-loamy、混合、介子的Aquic Hapludults)土系列(29日]。在过去的十年里,这个实验牧场已经用石灰处理保持pH值6.5和受精前后两个级别的无机肥料投入,也就是说,高生育率(P 134公斤和K 390公斤)或低生育率(P 67公斤和K 195公斤)。主要的牧场草果园草(Dactylis glomerata),肯塔基蓝草(Poa pratensis)和草地羊茅(羊茅属其余)点缀着白车轴草(三叶草被)和红三叶草(三叶草pratense)。豆类的比例平均为36%和10%的高收入和低生育率情节,分别为(31日]。
2.2。土壤采样
西弗吉尼亚大学有机研究农业综合(12芯),表层土壤样品(15厘米深度×2.5厘米直径)收集6月和8月的高收入和低投入的阴谋已经种植了bean (菜豆),豌豆(Pisum一),和西红柿(Lycopersicon esculentum)和辣椒(甜椒)。十土芯(×2厘米直径16厘米深度)收集每个情节~ 1.5米间隔沿两个横断面作物行之间的中点。土壤样本的,放置在聚乙烯袋,运输在冰上的实验室,已筛(< 2毫米),冷藏在4°C。
Reedsville实验农场,防护实验建立了次要情节相邻的低生育率高,牧场上网站6月和修订肥料处理。每个情节都分为象限(1 m×1米),被随机分配接受粪便补丁或保持作为一个未经处理的控制。肥料补丁(直径25厘米,5厘米高度)捏造从新鲜粪便收集相同的字段。从每个治疗五个复制象限在天采样0,21日网站建立后40,63年和123年。0天,只有non-manured(控制)土壤取样。四到五所使用的样本进行分析,根据分析的类型。十二个土壤核心样本(15厘米深度×2.5厘米直径)收集从每个象限。核心样本胀大,放置在聚乙烯袋,运输在冰上的实验室,已筛(< 2毫米),冷藏在4°C。
2.3。微生物生物量碳和潜在Mineralizable氮
从潮湿的土壤微生物生物量碳提取(水孔隙度80%)根据伊斯兰教的方法和威尔(32]。土壤全碳提取测量使用Dohrmann dc - 190 TOC分析仪(罗斯蒙特分析Inc .,加州圣克拉拉,美国)。中性粒细胞决心根据基尼(描述的方法33]。氨在每个样品测量使用Lachat流动注射分析仪(美国科罗拉多州拉夫兰,哈希公司)使用酚盐的方法。
2.4。社区层面生理概要
土壤微生物群落的能力利用多种碳源是评估使用社区生理分析最初由花环和工厂开发34]。无菌华林搅拌机是用来使均匀(1分钟,最大速度,3 x间歇冷却在冰上)20克的土壤180毫升Winogradsky盐溶液(WSS) [35]。匀浆稀释(10−3)和用于接种(100μL良好−1)生物测井生态板微型板块(美国加州生物测井公司,海沃德)。每个板包含31个人碳基质的一式三份,加3井缺乏碳源控制。微型板块是孵化25°C 5天。利用碳源的监控通过测量吸光度在590海里。读数是每24小时使用一个自动板读者(SpectraMAX 340 pc,分子器件、加州森尼维尔市,美国)。吸光度值late-log阶段的增长曲线(63小时)用于计算多样性指数和主成分中描述的部分2。6。
2.5。文化相关的变性梯度凝胶电泳
这个过程的详细描述提出了Edenborn和Sexstone28]。短暂,20克(干重)复合土壤样本的每个情节被置于无菌华林高速搅拌机和动摇一分钟(3 x间歇冷却在冰上)无菌WSS的180毫升。混合悬浮液被稀释(10−2在无菌WSS), 100年μL是镀上的四个复制琼脂板(最终稀释= 10−3)和耗氧孵化两周25°C。培养细胞从四个复制R2A顺序洗盘子用WSS(4毫升)和无菌一次性接种环。由此产生的细胞悬浮液涡和冷冻(−20°C)。DNA提取整除的解冻细胞悬液(1.8毫升)使用该款微生物DNA提取工具包(美国加州该款实验室,卡尔斯巴德)。变量的V3区域16 s rRNA基因从域真细菌放大使用PRBA338F底漆和PRUN518R底漆如前所述[28]。复合PCR产品(~ 150 ng)加载到聚丙烯酰胺凝胶(8%)和40% (16.8 g尿素;16毫升甲酰胺/ 100 mL)到60% (25.2 g尿素;24 mL甲酰胺/ 100 mL)变性梯度和电泳14 - 16小时50 V和60°C使用DCode普遍突变检测系统(BioRad)。这种凝胶是由银染色根据可视化Caetano-Anolles的协议和Gresshoff [36]。发达凝胶扫描使用惠普ScanJet 7400 c(美国惠普公司(Hewlett - Packard Co .),加州Palo Alto) 600 dpi的分辨率和保存在未压缩的TIFF格式进行进一步分析。
在草场土壤,时态的变化CD DGGE指纹后测定肥料的应用拍草场土壤处理的情节。肥料(0),应用程序之前五个复制收集土壤样本从高,低生育情节和可耕种的细菌群落特征作为肥料拍分解。额外的样品收集在天21日40和63。
2.6。数据分析
差异(的)和MBC有机农场牧场(PAS)土壤测试使用一个方差分析(方差分析)2×3因子设计(因素:高、低输入()或低生育率的高位(PAS);因子B: time-crop组合(的)或time-manure修正案组合(PAS))。中性粒细胞在有机农场土壤相比,使用一个2×2的阶乘(因子a:高位低投入;因子B: time-crop组合)。草场土壤,同样的析因设计用于MBC用于中性粒细胞。图基HSD测试被用于post-ANOVA成对比较。
总好显色(TWCD)生物测井计算生态板作为吸光度值的总和确定后63小时的潜伏期。平均颜色发展(AWCD)计算的意思是对于那些31吸光度值。底物多样性(H)计算,在那里总微生物活动的比例在一个特定的碳源。基质丰富(S)的总数计算井吸光度值大于0.25。基质均匀度()计算(年代)。数据归一化每个基质吸光度值除以AWCD [34]。稳健的主成分分析(PCA)是规范化数据的协方差矩阵使用α= 0。
DGGE分析了凝胶使用数量一个凝胶分析软件(美国加州BioRad,大力神)。乐队是由设置的分析背景减法15岁使用滚动磁盘档案评估和比较方法和生成强度峰值大小、形状和位置。乐队是选择手动的极限强度大于0.05。相似度矩阵计算与索伦森指数基于山峰的存在/缺失。分析相似(ANOSIM)被用来确定DGGE条带配置文件之间的显著差异。在ANOSIM,R大于0的值表明对象(DGGE概要文件)比群体内部不同群体之间,以及P值表示的意义(37]。增强非度量多维标度(nmd)是用于纵DGGE数据(37,38]。nmd的能力提供了一个良好的表现相似的数据在二维空间评估基于克鲁斯卡压力值。压力值< 0.15表明,任命情节提出了有用的CD DGGE表示数据(37]。
多个和简单相关性分析被用来评估主成分之间的关联,nmd轴分数,MBC,中性粒细胞的数据。微生物生物量碳和中性粒细胞被选为关联,因为他们被认为是广泛的土壤质量指标,相对容易测量和解释,并与土壤养分循环等功能,分解有机修正案,骨料的物理稳定,土壤生产力,和N供应潜力39]。
方差分析(方差分析)和关联分析使用SAS (SAS研究所Inc .卡里,NC)。主成分分析(PCA)、ANOSIM和nmd进行使用R包素食(40]。
3所示。结果
3.1。微生物生物量碳和潜在Mineralizable氮
在目前的研究中,水平的MBC是十倍相比,草地土壤有机农场(表1)。在这两个系统,修正案粪肥和堆肥在不同的时间导致MBC的显著差异。有机农场土壤微生物生物量碳含量有显著影响的输入(,)和time-crop组合(,),没有交互。高投入的MBC情节(6月)显著不同的治疗除了高投入的土地种植豆类(8月)(表1)。在牧场,MBC是影响肥料修正案和时间(,),但不是肥料修正案(,)。的交互作用不显著(,)。MBC明显高于今年5月,9月和MBC的最大金额是阴谋与肥料(表被修改1)。明确的统计差异无机肥料应用程序没有显示;然而,低水平的MBC通常被观察到在低收入和高出生率情节相比,5月和9月。
草场土壤平均包含四倍比有机农场土壤中性粒细胞(表1)。在有机农业土壤,在中性粒细胞显著差异被发现由于输入(,),但无论是time-crop组合(,),也不是这两个因素之间的相互作用是重要的(,)。个人意味着相比时,没有发现差异在不同土壤有机农场(表之间的中性粒细胞1)。在牧场,化肥输入(,)和time-manure修正案(,)被发现没有任何交互(中性粒细胞产生重大影响,)。潜在mineralizable氮显著高于在情节与肥料与化肥输入(表1)。
3.2。社区层面生理概要
香农多样性指数介于3.26 - -3.35和3.27 - -3.29之间;财富值介于28 - 30之间,28 - 29日;均匀度在0.975 - -0.982之间,-0.977和0.975有机农场和牧场土壤,分别。没有显著差异()功能多样性指数基于土壤类型或农艺治疗。
任命CLPP数据使用主成分分析明确区分从其他土壤低投入的有机农场的土壤。我们首先进行PCA在31日底物识别最强烈的加载,noncollinear基质。10这些底物被用于随后的PCA (41]。这些基质精氨酸,D-cellobiose,环糊精,i-erythritol, 2-hydroybenzoic酸,D-lactose, L-phenylalanine,苯乙胺,苏氨酸,D-xylose。任命的这些数据呈现在图1在不同的集群形成的低投入的有机农场土壤可以可视化。在这一分析,75%的方差占了前三个主成分。第一主成分是最强烈的利用率与L-phenylalanine (−0.94), D-lactose(−0.68),和苏氨酸(−0.61)。主成分2最强烈与2-hydroxybenzoic酸(0.87),和主成分3最强烈与苯乙胺(0.95)和精氨酸(0.69)。
3.3。文化相关的变性梯度凝胶电泳
CD DGGE的16 s rDNA显示明显差异可耕种的细菌社区在有机农场和牧场土壤(图2(一个))。在两种土壤类型可耕种的细菌群落高度不同(ANOSIMS;,)。配合使用nmd的数据表明,豆科作物(的)和化肥(PAS)有更多的影响比有机质可耕种的土壤细菌群落结构的修正案(堆肥或粪便)(图2 (b))。
(一)
(b)
在每个采样时间,PCR产品从三个复制块每治疗组合来创建一个复合概要文件。显著差异被发现之间的高收入和低生育率的情节在0天(ANOSIMS;,)。非度量多维标度分析这些数据呈现在图3(一个)。随着时间的推移有显著差异在细菌社区(ANOSIMS;,),但没有观察到显著差异由于治疗(,)。任命的数据还显示不同的集群基于采样时间(图3 (b))。
(一)
(b)
在6月和8月,土壤收集从三个复制块每治疗有机农场被用于CD DGGE分析。没有明显差异在CD DGGE概要文件从6月份的不同治疗(ANOSIMS;,);然而,8月观察显著差异(,)。细菌社区从番茄和胡椒情节(高和低生育率)收集6月和8月都聚集在一起(图4(一))。相比之下,社区从土壤,种植豆类集群分开的土壤种植的西红柿和辣椒和对方(图4 (b))。克鲁斯卡所有分析应力值< 0.15。
(一)
(b)
3.4。MBC之间的相关性,中性粒细胞、CLPP和CD DGGE
多重相关性分析被用来探索潜在的主成分得分之间的关系从CLPP的PCA分析数据(图1)和其他测量变量。重大CLPP主成分之间的相关性观察,MBC (,)和中性粒细胞(,)。当有机农场和牧场样本分别进行了分析,改进的关系(,MBC)和中性粒细胞从两个系统。多个CLPP主成分(图之间的相关性1)和轴分数nmd的CD DGGE有机农场的数据样本在2004年8月(图4 (b))也非常重要(维度1:,;维度2:,)。多个相关分析不是牧场上执行数据因为样品CD DGGE和CLPP收集在不同的采样日期。简单的相关性进行农艺系统使用轴分数nmd的CD DGGE数据和MBC和中性粒细胞数据。在两种土壤系统,DGGE轴之间存在显著的相关性被发现分数和MBC(图5DGGE轴之间),但不是分数和中性粒细胞(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
理想的土壤质量指标是反映生态系统过程和集成物理、化学和生物学性质的土壤。他们也对环境干扰和敏感是实用、经济、能满足用户的品味42]。微生物群落结构的潜在使用作为土壤质量的指标(3];但是,联系生态系统过程和土壤状况并不总是很明显的方式可以很容易地集成到预测模型(43]。探索土壤中微生物群落的组成往往取决于计算和检查参数来自多元模型和施工配合的情节。这种方法通常不提供更容易解释的指标量化和比较的土壤微生物多样性。因此,我们试图从多元相关派生参数分析更简单的措施的土壤变化和确定如果提供短期的信息概要文件的可耕种的土壤细菌群落土壤质量的变化特征不使用传统的微生物土壤质量指标。
有机农场和多年生牧草代表对比研究,获得常规土壤改良剂和过去十年工厂管理。长期土壤特性的变化表明,全面改善土壤质量在两个站点30.,31日,44];然而,短期影响特定的农艺治疗更难以解决。在这项研究中,我们探索的响应性可耕种的土壤细菌社区管理和其潜在的关系通常采用措施的土壤扰动(MBC,中性粒细胞,CLPP)。可耕种的细菌敏感metal-contaminated环境的变化和早期指标(27,45]。
我们测试的假设快速增长的可耕种的细菌群落,所反映的CD DGGE概要,对短期动态变化的农业系统和敏感,这些反应可以与其他微生物措施的土壤状况。之间明显的差异观察CD DGGE指纹的16 s rRNA基因两个土壤类型。然而,CD DGGE概要文件不一致敏感网站或治疗的差异。相反,我们发现CD DGGE测量土壤的差异,修改与无机肥料和/或裁剪豆类、MBC,中性粒细胞,CLPP更适应增加的粪肥和堆肥土壤。很可能我们还在草场土壤肥料效应涉及豆类的效果。在过去的十年中,在Reedsville实验牧场,WVa,一直受到平等的放牧压力和动物粪便沉积,但收到了两个不同水平的磷,钾,钙修正案(44]。高磷治疗已被证明有利于牧场的持久性豆类,如红色和白色的三叶草,在这些土壤(46]。Girvan et al。17]假设土壤类型和豆类作物最重要的因素控制在农业土壤细菌群落的结构。额外的研究支持观察,豆类和氮的可用性会影响细菌社区(47,48]。常规施肥与无机磷酸盐也被证实可以提高独立生存的固氮细菌的多样性和活性与有机修正案(49]。
我们发现之间的正相关性CLPP主成分得分和MBC和nmd轴分数和MBC在两个系统。以前的研究也发现了可耕种的微生物群落的结构和功能之间的相关性和物理化学和营养参数45],CLPP数据、总N通量和土壤呼吸(50- - - - - -52)和有机质含量、pH值和钠(53]。虽然相关性并不意味着因果关系,相关关系表明这些变量以类似的方式应对环境干扰50),提供了基础探索潜在的机制,可能链接结构和功能。例如,CLPP采用微生物增长潜在重要的碳基板,我们观察到显著的CD DGGE和CLPP之间的相关性。探索使用PCA CLPP数据分析表明,细菌利用L-phenylalanine等芳香基质和2-hydroxybenzoic可能代表使用CD DGGE有用的生理组织的进一步探索。Langenheder et al。54)表明,细菌群落结构可能与狭窄等功能退化semilabile碳化合物,而不是广泛的功能,如呼吸和生物质生产。如果这是准确的,那么描述可耕种的细菌群落与特定的生理功能或狭隘的偏好可能提高我们的能力区分土壤受人为扰动的影响。最近,里兹(55)认为,可耕种的社区没有效用在当代微生物生态学,不能与土壤肥力。我们的研究结果并不支持这一结论。相反,我们同意尼科尔斯(56],微生物培养是一种重现前沿,可以提供信息不能直接观测单从文化无关和测序工作。尽管细菌生长在不同类型的固体媒体本质上是有选择性的,复杂的土壤细菌社区分割成可定义的能力生理子集孤立使用各种媒体和孵化条件应被视为一个潜在的CD DGGE技术力量,因为选择的生理组织可能最敏感和对环境变化的反应。它仅仅是不足以目录基因了解环境因素控制群落结构的变化。自然选择作用于表型和生理特征往往与一个以上的基因,并受多种外部因素。微生物分类成有意义的官能团和描述的生理和生态这些团体可能会使社区内冗余数据更易于管理和相关(43]。
5。结论
有机农场和牧场代表系统对比土壤类型、土地利用和生育制度。在这项研究中,我们使用MBC,中性粒细胞,CLPP, CD DGGE的16 s rRNA基因比较微生物群落的函数农艺修正案。MBC之间有显著相关性,中性粒细胞和变量来自土壤社区的功能和遗传多样性分析;然而,每个测量技术表现出不同的应对生育修正案。总的来说,MBC、中性粒细胞和CLPP最适应增加的粪肥和堆肥土壤;然而,只有CD DGGE透露明确的土壤的差异,与无机肥料和/或修改裁剪和豆类。因此,不同措施的土壤中微生物群落结构不提供冗余信息质量分析,和可耕种的细菌社区可以提供有用的指标选择农艺扰动。
可培养细菌的少数民族地位并不排除这种可能性,这些社区是有用的促进我们了解微生物群落与环境的过程。培养技术CD DGGE和CLPP有潜力提供关键洞察链接结构和功能多样性的机制,探索评估生理和生态功能组内冗余,并推进我们的了解微生物多样性导致土壤质量。
确认
作者感谢乔治·塞德尔博士的援助与统计分析。这项工作是支持由美国农业部和西弗吉尼亚大学戴维斯大学的农业、林业、和消费者科学通过舱口下资金拨款法案。