文摘

确定coelomocytes基因毒性,Pheretima peguana蚯蚓被暴露在滤纸研究镉(Cd)和铅(Pb) 48 h,在浓度小于信用证₁₀cd: 0.09, 0.19, 0.38, 0.75和1.50μg厘米⁻²;铅:1.65,3.29,6.58,13.16和26.32μg厘米⁻²。乳糜泻在0.75μg厘米⁻²在微核测试(检测染色体畸变),显著增加()微核和双核细胞被观察到,在彗星试验(检测DNA单链断裂),尾部DNA百分比显著增加。铅是有毒对DNA,用最小的影响更少但是双核被Pb在3.29显著增加μg厘米⁻²。这项研究表明,Cd更敏锐地比铅有毒和亚致死的基因毒性p . peguana。镉引起染色体畸变和DNA单链断裂的45%信用证₁₀浓度。铅,相比之下,没有引起DNA损伤但胞质分裂缺陷引起的。

1。介绍

蚯蚓是土壤有机质的主要分解器,因此,援助在改善土壤质量和肥力。蚯蚓是土壤动物区系的生物量的主要组件,提供10 - 200 g m⁻²(1]。因为他们的生态重要性,蚯蚓现在采用作为指示生物的潜在影响的评估土壤生物化学物质。

全球农业操作,有越来越多的担忧普遍由化学物质和重金属土壤污染。镉(Cd)和铅(Pb)是两个更多的有毒重金属释放到土壤的工业流程。他们特别关注的,因为他们没有生物功能但有毒生物,构成了对人类和环境健康风险。在受污染的土壤,蚯蚓都暴露于这些污染物真皮和通过胃肠道吸收土壤。蚯蚓对重金属免疫系统通常是敏感的曝光。蚯蚓的接触化学物质通过皮肤直接影响coelomocytes路线,因此,对蚯蚓的健康产生重大影响。因此,监测蚯蚓免疫能力可以被视为一个更敏感和预警生态系统健康的生物标志物。

无机铅被归为一组活动花絮致癌物质,这是一个可能的人类致癌物(2]。Cd被归为一组我人类致癌物3和动物致癌物质4]。此外,Cd干扰DNA修复,从而导致突变(5),最终致癌作用(6]。因此,DNA损伤评估是毒性测试的一个重要方面。蚯蚓coelomocytes蚯蚓免疫中发挥重要作用[7),因此经常被用于评估基因毒性。

彗星试验已经作为一个敏感的工具来测量各种生物体的DNA损伤(8- - - - - -10),而微核测试,一个细胞遗传学技术,已经被用于检测染色体畸变和核异常如binuclei和micronuclei-these已经形成的细胞毒性和遗传毒理学指标,分别为(11,12]。

为了更好地理解Cd和Pb蚯蚓毒性Pheretima peguana,本研究旨在确定最低Cd和铅浓度会导致基因毒性通过皮肤的接触途径,通过测量免疫能力反映在染色体畸变和coelomocytes DNA损伤。coelomocyte频率的微核和双核细胞被用来评估染色体畸变和抑制胞质分裂,分别。尾部DNA百分比和DNA彗星尾巴长度测量的试验来评估DNA单链断裂。研究试图证实,彗星试验和微核测试工具,可用于基因毒性的评估Cd和Pb生态毒性风险的比较。

2。材料和方法

2.1。蚯蚓

Pheretima peguana蚯蚓是来自当地的经销商在曼谷,泰国。蠕虫是保持土壤在实验室使用股票(50%肥沃的表层土,30%动物粪便堆肥的叶子和20%)28±1°C,湿度65%,12 h灯:12 h黑暗的光周期。西瓜被添加每周补充土壤股票。成年个体(300 - 600 mg)与高度发达的环带被用于实验。实验前,股票的蠕虫被移除土壤,用水清洗,涂抹在滤纸,蒙在鼓里的28±1°C 24小时允许净化肠道的内容。

2.2。化学物质

氯化镉(CdCl₂)和硝酸铅(Pb(没有₃)₂](西格玛奥德里奇化工有限公司)被稀释在重蒸馏的水达到所需的浓度。所有试剂均为分析纯,准备Milli-Q年级水。绘画纸。1滤纸是放置在平板玻璃容器(2×9厘米)和湿3毫升每个Cd或Pb的解决方案或蒸馏水(控制)。

2.3。急性毒性研究

Cd和Pb对蚯蚓的急性毒性评估在滤纸接触测试使用五个浓度的金属(n每个浓度= 20蚯蚓)选择基于初步研究。最后的重金属浓度每平方厘米的滤纸实验中使用的是Cd: 4.70, 5.85, 7.05, 8.23, 9.40和10.58μg厘米⁻²和铅:32.90,37.60,42.30,47.00,51.70和56.40μg厘米⁻²。所有的实验都是在黑暗中进行48小时的28±1°C。死亡率百分比确定在24小时和48小时;蠕虫被认为死时没有回应前地区的联系。结果治疗组相比,控制和分析用概率单位分析计算48小时LC₁₀和信用证₅₀乳糜泻和Pb。

2.4。亚致死的毒性研究

在亚致死的毒性研究中,蚯蚓(n每个浓度= 5)暴露了48小时Cd和铅浓度小于48小时LC₁₀cd: 0.09, 0.19, 0.38, 0.75, 1.50μg厘米⁻²;铅:1.65,3.29,6.58,13.16,26.32μg厘米⁻²滤纸。蒸馏水是用作控制。48小时后,虫子从每个浓度从滤纸被移除,在蒸馏水清洗,涂抹在纸巾上。幸存的蚯蚓的数量和他们的身体重量记录。三个蠕虫暴露在每个金属浓度被用来收集coelomocytes如下所述。

2.5。收获Coelomocytes

体腔液含有coelomocytes从体腔获得了挤压法Eyambe et al。13]。短暂,蚯蚓在3毫升生理盐水冲洗挤压中包含5%的酒精,71.2毫米氯化钠,EGTA 5毫米,50.4毫米愈创木酚甘油基醚在培养皿中,与pH值调整到7.3和1.0 M氢氧化钠。挤压细胞转移到冰冷的Ca^{2 +}免费的地龙平衡盐溶液(磅)包含71.5毫米氯化钠,氯化钾4.8毫米,1.1毫米MgSO₄ 7小时₂啊,0.4毫米KH₂阿宝₄,0.3毫米Na₂HPO₄,4.2毫米NaHCO₃和pH值调整到7.3和1.0 M氢氧化钠(14]。

2.6。Coelomocyte形态学和细胞生存能力

Coelomocyte形态在显微镜下检查。细胞数在一个血球计和细胞浓度调整到10⁵细胞毫升⁻¹。细胞生存能力是决定利用台盼蓝排斥试验,混合后相同体积的coelomocyte悬架和0.5% (w / v)台盼蓝(σ)的解决方案。细胞生存能力都超过95%。

2.7。微核测试

一个整除的10μL在每个金属浓度从每个蚯蚓体腔液涂抹在玻璃幻灯片,使用每个浓度三个幻灯片。流体干燥时,coelomocytes与一个固定methanolic微分染色细胞固定剂解决方案组件(赖特快速染色)。共有3000个小coelomocytes从三个单独的幻灯片每张幻灯片(1000细胞)浓度中使用复合显微镜(奥林巴斯,CH 30) 1000 x放大确定微核和双核的频率。剩下的体腔液用于彗星试验。

2.8。彗星试验

检测coelomocyte DNA损伤,碱性溶解碱性单细胞凝胶电泳进行紧随其后。三个微凝胶的幻灯片准备每个金属浓度的协议辛格et al。8)和修改的s . a . Reinecke和a·j·Reinecke [10]。在昏暗的灯光下进行了所有步骤在4°C,以防止额外的DNA损伤。一个20 -整除μ与75年L细胞悬液混合μL 0.5% (w / v在PBS, pH值7.3)低熔点的琼脂糖(LMA)在40°C,并覆盖在微观滑动与100年预镀μL正常的琼脂糖融化,立即关闭盖玻片。琼脂糖被允许巩固保持幻灯片的冰袋1分钟。封面的眼镜被移除,0.5%低熔点的琼脂糖(40毫米Tris-HCl准备,pH值10.0)分层在幻灯片上,覆盖着玻璃。幻灯片1分钟然后转移到冰袋。眼镜被移除和幻灯片保存在高盐裂解缓冲(2.5 M氯化钠,100毫米EDTA, 10毫米三基地,1% Triton-X, pH值10.0)期间15±1小时在黑暗中在4°C细胞蛋白质和解放受损的DNA。裂解幻灯片被保存在一个包含碱性电泳缓冲水平电泳槽(300毫米氢氧化钠,1毫米EDTA, pH > 13) 20分钟允许解除DNA和表达DNA单链断裂和碱不稳定的站点。接下来,电泳进行了30分钟的12 V在4°C和300 mA。幻灯片被中和,0.4米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.5)三次每隔5分钟。

幻灯片沾染了100人μL (20μ克毫升⁻¹溴化乙锭与去离子水5分钟,洗去多余的染色。幻灯片是尼康eclipse 80我荧光显微镜下检查过滤块UV-2A(激发过滤器510 - 560 nm,二向色镜575海里,发射590海里)。彗星记录使用数码相机的图像(尼康DXM 1200 c)和分析软件卢西亚(实验室通用计算机图像分析仪)。至少100不重叠的彗星每张幻灯片都被随机400 x放大和得分的彗星参数,即尾部DNA (TD) %(表示为荧光强度的百分比)和DNA尾长度(TL)(距离核中心的彗星尾巴)。

2.9。统计分析

在亚致死的研究中,结果的平均值和标准误差表示为意味着从三个蚯蚓。显著差异的结果确定不同的治疗组用单向方差分析和图基的多重比较。正常失败时,克鲁斯卡尔沃利斯H进行测试。

3所示。结果

3.1。急性毒性试验

总48小时控制复制的蚯蚓死亡率< 10%,这符合经合组织测试的有效性的标准协议。显著的毒性作用和死亡的观察与测试重金属浓度测试浓度最高和最显著的:10.58μg厘米⁻²乳糜泻和56.40μg厘米⁻²对Pb(图1)。48小时的信用证₁₀和信用证₅₀Cd的值分别为1.65和6.09μg厘米⁻²分别(图1(一))和Pb 26.64和43.43μg厘米⁻²(图1(b))。因此,Cd是敏锐地更比铅的毒性p . peguana。

3.2。微核测试

在每个浓度的双核细胞的频率高于微核,与控制。双核的频率和微核coelomocytes在Cd的浓度明显高于0.75μg厘米⁻²以上与控制(图2(一个))。因此,Cd引起胞质分裂失败和染色体畸变的形式的双核和微核,分别在水平略低于50%的48小时LC₁₀。

也有显著增加的双核以上coelomocytes铅浓度为3.29μg厘米⁻²,这是大约12.5%的Pb 48小时LC₁₀蚯蚓。Cd相比,Pb没有显著影响微核形成即使在浓度接近LC₁₀(图2 (b))。

在信用证₁₀Cd的频率,Pb-induced双核是类似的:9.67 (Cd)和10.67 (Pb)每1000 coelomocytes细胞。然而,在信用证₁₀,Cd-induced微核频率为4.67每1000 coelomocytes几乎是三倍观察了Pb (1.67)。

3.3。彗星试验

均值coelomocyte尾部DNA百分比和一定程度上的DNA尾长度逐渐增加,并增加Cd浓度(数字3(一个)和3 (b))。镉在0.75μg厘米⁻²滤纸浓度以上,尾部DNA百分比coelomocytes显著增加((图)与控制3(一个))。在最高的Cd浓度(1.50μg厘米⁻²,略低于信用证₁₀浓度),有显著增加()DNA尾长与控制(图3 (b))。

没有显著差异在尾部DNA %(图3 (b))和DNA尾长度(图3 (d))之间的任何铅治疗组和对照组。

4所示。讨论

LC₁₀和信用证₅₀Cd蚯蚓的15倍和7倍的值低,分别比铅,表明Cd更敏锐地有毒p . peguanaPb。48小时的曝光时间Cd本研究中使用的是足以引起coelomocyte DNA损伤。这是在良好的协议与Fourie et al。15)使用相同的曝光时间,发现组织Cd积累和随后的DNA损伤蚯蚓暴露于Cd略高的浓度在人工水保媒介。然而,Homa et al。16)报道,至少需要3天Cd积累显著的浓度在coelomocytes诱导的应激反应的蛋白质Eisenia fetida暴露于1.32μg厘米⁻²Cd(锌、铜、铅)4种接触测试。

更大的Cd与铅的毒性可能是由于不同的生物利用度和/或吸收和/或划分两种金属的蚯蚓。这是支持的研究Nahmani et al。17和马18]。李等人。19)显示Eisenia fetida,大约80%的细胞Cd在细胞膜的胞质,只有20%。这与Pb, 50%的铅是位于细胞膜和胞质少得多。这可能是由于Pb的事实^{2 +}离子半径更大(1.19Å)与Cd^{2 +}(0.97Å),因此更大的扩散的离子进入coelomocytes Cd,而大部分的铅^{2 +}结合到细胞膜运输有限coelomocyte coelomocytes胞质,因此最小的毒性。

在亚致死的48小时研究中,Cd和Pb增加了双核coelomocytes。双核细胞由于缺陷发生在胞质分裂,两个子细胞的过程通常单独的细胞分裂。我们的研究结果表明,Cd浓度(0.75μg厘米⁻²)需要诱导的双核coelomocytes Pb(3.29所需的大约25%μg厘米⁻²)。这一发现同意康德的研究和Lanno [20.)报道,铅是谁稍微coelomocytes有毒和相对良好的耐受性,与Cd相比,由于封存chlorogogue Pb的细胞。Fugere et al。7)报道,铅相对良好的耐受性的蚯蚓coelomocytes而Cd相对有毒coelomocyte可行性和吞噬作用与影响。此外,Homa et al。16)报道,coelomocytes选择性地对某些金属离子敏感是由于微分upregulation金属硫蛋白的这些离子在1.32μg厘米⁻²每个金属的浓度。

甚至导致治疗并不影响微核频率最高26.32 Pb暴露浓度μg厘米⁻²在48小时亚致死的研究。由于微核出现短期响应基因毒性物质(21),他们的表达频率取决于照射剂量比暴露时间(12]。在双核coelomocytes显著增加铅浓度是3.29以上μg厘米⁻²意味着3.29μg厘米⁻²(相当于大约12.5%的48小时LC₁₀值)可以被看作是一个亚致死的Pb剂量。Pb似乎对胞质分裂的影响大于在蚯蚓coelomocytes染色体。

蚯蚓coelomocytes微核显著增加,表明染色体畸变在有丝分裂期间暴露在Cd上为0.75μg厘米⁻²48小时计算,相当于大约50%的信用证₁₀,可以被视为一个亚致死效应,因为在这个实验中没有蚯蚓死亡发生在这个浓度。Cd-induced形成蚯蚓coelomocytes的微核和双核细胞的细胞毒性和基因毒性Cd对哺乳动物的影响(22,23]。基因毒性在48小时LC蚯蚓coelomocytes₁₀可以推断,暴露的蚯蚓甚至略有Cd污染土壤可能导致遗传物质损伤染色体和DNA,蚯蚓和后果,因此,一般的陆地生态系统。暴露于更高的Cd上的浓度,尾部DNA百分比表明长串优惠逐渐增加,也显著大于0.75μg厘米⁻²与控制相比,确认Cd可以引起DNA损伤蚯蚓coelomocytes 48小时的50%信用证₁₀亚致死浓度。尽管26.32 Pb的最高浓度μg厘米⁻²在near-LC₁₀浓度没有任何明显的损伤DNA彗星assay-confirming Pb,与Cd,并非基因毒性甚至在信用证₁₀集中在一个48小时学习。支持这些结果,大多数作者报告,Cd诱发DNA链断裂,姐妹染色单体交换,和染色体畸变在植物、哺乳动物和人类细胞(24- - - - - -26)以相对较低的曝光和远低于48小时LC₁₀浓度。

几个metals-chromium、镍、钴、砷在除了Cd已经证明是致癌人类和实验动物(27]。有几个可能的Cd诱发DNA链断裂机制,包括修复酶的抑制4]。原因之一可能是抑制竞争的Cd与锌离子,这对DNA聚合酶活性是至关重要的。此外,Cd可能干扰中和钙有关的化学过程所涉及的规定DNA复制和修复。斯奈德(28]和Ochi沢[29日]报道的参与活性氧的代DNA单链断裂和Cd-mediated染色体畸变发生在细胞内谷胱甘肽减少。

在这项研究中,DNA损伤p . peguana引起的Cd在0.75μg厘米⁻²浓度低于报道Fourie et al。15)得出结论:L Cd 20毫克的浓度要高得多⁻¹(次致死量)是需要引起DNA损伤Aporrectodea caliginosa,Dendrodrilus rubidus,和Eisenia fetida在一个人工水保介质。毒性较低的Cd浓度作为本研究中观察到的敏感性的反映p . peguanacoelomocytes Cd,但更有可能是因为蚯蚓的4种测试是饥饿与水保介质。也有可能更异构coelomocyte人口可能存在其他蚯蚓物种,因此这些相对更强的抵抗力p . peguanaDNA损伤。

总之,信用证₁₀和信用证₅₀值的Cdp . peguana蚯蚓是15倍和7倍低,分别比铅,表明Cd比铅的毒性更强。镉是基因毒性和胞质分裂的影响p . peguanacoelomocytes 48小时的45%信用证₁₀浓度。在信用证₁₀DNA浓度没有影响,但在12.5% (3.29μg厘米⁻²)的信用证₁₀浓度,它影响的胞质分裂。

承认

这个项目是由科学的教员,Silpakorn大学Nakorn Pathom,泰国。