堆肥乳酸杆菌:筛选、生产资料和介质组成的影响

文摘

生物表面活性剂生产四乳酸杆菌菌株的筛选。最高的生物表面活性剂的生产(排泄和cell-bound生物表面活性剂)得以实现乳酸菌paracaseissp。paracasei样子,应变与葡萄牙乳制品工厂,减少表面张力为6.4 mN m⁻¹和22.0 mN米⁻¹,分别。生物表面活性剂的生产,这一毒株是评估不同文化下汤的组成部分。不同氮源的使用表明,酵母提取物对细菌生长至关重要,同时为生物表面活性剂合成蛋白胨是至关重要的。生物表面活性剂的生产、蛋白胨和肉类提取物的使用产生了更高的生产标准介质相比,表面张力降低24.5 mN m⁻¹。此外,实验还在一个反应堆进行pH值和温度控制。生物量和生物表面活性剂在生物反应器生产高与实验比较动摇抨击。当前工作中采用的优化过程发现提高生物表面活性剂的生产和打开新的视角的使用l . paracaseissp。paracasei作为一种很有前途的样子biosurfactant-producer。

1。介绍

生物表面活性剂是由微生物合成表面活性的化合物与明显的表面和乳化活动(1,2]。几个属性和生产者有机体生理功能被描述为不同组的生物表面活性剂,包括疏水化合物的溶解度、重金属绑定,细菌发病机理,细胞粘附和聚集,群体感应,生物膜的形成2,3]。

细菌是堆肥微生物的主要群体,虽然他们也由一些酵母和丝状真菌(4]。这些化合物可以通过微生物生长在water-immiscible合成碳氢化合物,以及水溶性化合物如葡萄糖、蔗糖、甘油,或乙醇,可以分泌或仍然附着在细胞壁5]。现有的堆肥中微生物多样性表明他们的生产是一个重要的生存策略,似乎在一个独立的进化,然而并行方式(6,7]。许多研究已经报道乳酸杆菌的潜在biosurfactant-producers [8- - - - - -16]。生物表面活性剂从几个乳酸杆菌都被定性为孤立的多组分混合物,包括蛋白质和多糖(13,14,17,18];在其他情况下,表面活性化合物被确定为糖脂(8,12,15,16]。

与化学表面活性剂相比,这些化合物有几个优势,如低毒性、生物降解性高,在极端温度和pH值和有效性(2,4,5]。此外,生物表面活性剂可以定制,以适应不同的应用程序通过改变生产条件,或通过修改基因参与他们的生物合成5,7]。生物表面活性剂的多样性使得他们一个有吸引力的的化合物用于各种工业和生物技术的应用,如农业、食品生产、化学、化妆品和制药学1- - - - - -5]。

生物表面活性剂的使用代表了另一种和环保选择生物修复技术在污染的环境中碳氢化合物。生物表面活性剂,这增加了疏水不溶性底物的表面积,可以添加到oil-degrading细菌的生物修复过程刺激增长和降低碳氢化合物(提高他们的能力15,19]。

目前,防止生物表面活性剂的广泛使用的主要因素是经济学,和许多策略也已经被开发出来,以降低其生产成本,使发酵与化学合成[竞争20.]。使用廉价的基质农工业的废物,媒介和文化条件优化,开发有效的恢复过程和生产的工程微生物有助于使他们的产品更具有经济吸引力的通过廉价、高效的发展过程(5,20.- - - - - -27]。因此,未来生物表面活性剂的研究应该更加关注生产过程的经济,特别是通过使用替代低成本发酵媒体(20.,28]。

本研究的目的是筛选的乳酸杆菌菌株为原料,生产生物表面活性剂降低表面张力的能力,以确定每个菌株生物表面活性剂的生产资料。此外,最好的biosurfactant-producer,培养基生长和生物表面活性剂生产优化。

2。材料和方法

2.1。菌株培养条件和标准

四个乳酸杆菌菌株进行了这项研究。乳酸菌coryniformisssp。torquens摄影25600年从西班牙获得集合类型的文化(西班牙瓦伦西亚);乳酸菌paracaseissp。paracasei样子,乳杆菌阿,明串珠菌属mesenteroidesA4孤立从葡萄牙乳制品厂。

菌株被存储在汤夫人−80°C(中由DeMan引入Rogosa和夏普29日)的培养乳酸菌物种(OXOID,英国贝辛斯托克))含有15% (v / v)甘油溶液直到使用。只要需要,冷冻股闪亮在琼脂板夫人和孵化一夜之间每个菌株的最适生长温度(31°Cl . mesenteroides为所有其他菌株A4和37°C)进行进一步的培养。股票文化工作保持在4°C 2周。

2.2。增长曲线

菌株培养在摇动烧瓶没有挡板包含100毫升MRS-Lac介质(标准夫人中,葡萄糖被乳糖所取代)。准备亚文化,一个单独的殖民地被用来接种10毫升的每个应变MRS-Lac肉汤。这个preculture孵化一夜之间在最优条件下,和1毫升用于接种第二文化MRS-Lac肉汤(100毫升),增长了72 h,在环境空气31°Cl . mesenteroides为所有其他菌株A4和37°C。在不同时间点采集标本在发酵确定生物质和乳糖浓度,以及分泌生物表面活性剂的生产。MRS-Lac汤的组成是10.0 gL⁻¹蛋白胨、8.0 gL⁻¹肉膏,4.0 gL⁻¹酵母提取物,20.0 gL⁻¹2.0乳糖,gL⁻¹磷酸氢di-potassium 5.0 gL⁻¹醋酸钠3 H₂O;2.0 gL⁻¹tri-ammonium柠檬酸0.2 gL⁻¹硫酸镁7 H₂0.05 O, gL⁻¹硫酸锰4 H₂啊,80和1.0毫升渐变。pH值调整到6.2。

细菌生长决定通过测量光密度在不同的时间间隔在600海里(0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h),和生物量浓度(g L干重⁻¹)确定为每个应变通过校准曲线。乳糖消费决定通过测量文化中的还原糖肉汤上层清液使用DNS方法如米勒所述30.]。

2.3。生物表面活性剂的复苏

生物表面活性剂可以排泄或仍然附着在细胞壁。在最后一种情况下,生物表面活性剂必须从细胞中提取,例如,使用磷酸盐(PBS)。文化上的表面张力测量肉汤了生物表面活性剂的生产中排出的迹象,而表面张力测量的PBS提取给出了关于cell-bound生物表面活性剂的生产。为分泌生物表面活性剂的决心,在不同的时间间隔采集标本的表面活性测定汤浮在表面的文化。

对于cell-bound生物表面活性剂的决心,最后的实验(72 h)细胞被离心收获(5分钟10°C),在软化水冲洗两次,resuspended 20毫升的磷酸盐(KH PBS: 10毫米₂阿宝₄/ K₂HPO₄和150毫米氯化钠pH值调整到7.0)。细菌在室温下了8 h与温和搅拌生物表面活性剂。在提取过程中,在不同的时间间隔采集标本(0.5、2和8 h),细菌被离心分离去除,剩下的上层液体被检测表面活性(11]。

2.4。表面活性测定

文化的表面张力肉汤和PBS提取样本测量使用环方法如前所述[31日]。转K6张力仪克鲁斯(克鲁斯GmbH,汉堡,德国)配备了1.9厘米De Nouy使用白金戒指。表面张力值代表三个独立的平均测量在室温(20°C)执行。

2.5。生物表面活性剂的氮源对生物合成的影响

不同氮源的影响出现在MRS-Lac肉汤(蛋白胨、肉汁和酵母提取物)l . paracaseissp。paracaseiA20增长,生物表面活性剂的生产是由单因素评估设计摇动烧瓶实验。九个不同媒体的设计基于MRS-Lac成分,改变各种氮源的等值铵和保持氮的总量等于原来的媒介。表1总结了不同媒体的构成进行了研究。

增长曲线得到所有上面提到的媒体在发酵。生物质生产、乳糖消费,减少表面张力测定在不同的时间间隔。的cell-bound生物表面活性剂生产决定在每个实验中,如前所述。

2.6。生物表面活性剂生产l . paracaseissp。paracasei在生物反应器的样子

2 l反应堆(布劳恩,Melsungen,德国)配备搅拌,温度,pH值在线测量和控制使用。实验在37°C和120 rpm 1 l工作容积。在发酵的过程中,pH值维持在6.2自动添加6% (v / v)和21% (v / v) ortophosphoric酸铵的解决方案。MRS-Lac肉汤和MRS-Lac乳糖浓度增加(MRS-Lac II-50 gL⁻¹和MRS-Lac iii - 100 gL⁻¹)使用。曝气也研究来推断其效应在生物表面活性剂的生产。生长曲线和cell-bound生物表面活性剂复苏进行如前所述。

3所示。结果与讨论

3.1。筛选的乳酸杆菌生物表面活性剂的生产

在这项研究中,四种乳酸杆菌菌株筛选cell-bound和分泌生物表面活性剂的生产。增长曲线得到的菌株为了建立细胞生长和生物表面活性剂生产之间的关系,从几个不同的模式描述了在各种微生物(4,11]。降低表面张力的文化观察汤对所有菌株72 h后文化,尽管这些变化显著减少从1.4到6.4 mN m⁻¹相比MRS-Lac汤的表面张力(53.0 mN m⁻¹)(图1)。小减少发现表面张力的文化在发酵肉汤上层清液,它可以得出的结论是,这些菌株所分泌的生物表面活性剂在这些条件很低。

对于所有研究菌株,分泌生物表面活性剂的生产被发现生长-,作为生物质生产之间的平行关系可以观察到,乳糖消费,减少文化肉汤表面张力(图1)。从这个生物表面活性剂生产资料,如预期值最低的表面张力得到的最后发酵。l . paracaseissp。paracaseiA20显示最高的分泌生物表面活性剂产量,减少文化肉汤表面张力为6.4 mN m⁻¹。

Velraeds和合作者14)表明,生物表面活性剂释放不同的乳酸杆菌菌株是最大的细胞在平稳增长阶段。罗德里格斯et al。11)观察到生物表面活性剂生产乳酸杆菌主要发生在第一个4小时的文化,当细胞生长几乎是不存在的,底物消耗很低。然而,生物表面活性剂生产仍在发酵,尽管以较慢的速度。

表2编译在PBS提取过程中获得的表面张力值用于恢复cell-bound生物表面活性剂。结果表明,在室温下2 h提取时间足以恢复cell-bound生物表面活性剂。更长的提取时间并不代表一个优势,因为没有进一步显著降低表面张力可以获得。这个观察是按照之前报道的研究为其他乳酸杆菌(11]。因此,从这一刻开始,时间用于提取cell-bound生物表面活性剂成立2 h。l . paracaseissp。paracaseiA20被发现产生最高cell-bound生物表面活性剂的水平,降低表面张力为22.0 mN m⁻¹比PBS(控制)。

研究菌株,cell-bound的水平生物表面活性剂的生产被认为是高于分泌的,就像先前描述为其他乳酸杆菌(11,13,14]。相反,其他微生物(如芽孢杆菌和假单胞菌物种)主要生产生物表面活性剂分泌,分泌到培养基中,导致大幅降低其表面张力(32]。Velraeds和同事(14]研究了15乳酸菌菌株和报告后,表面张力降低PBS提取12.0和29.0 mN米之间⁻¹。同样,罗德里格斯et al。11)获得之间的表面张力降低17.0和21.5 mN m⁻¹使用其他乳酸菌菌株。因此,获得的结果l . paracaseissp。paracaseiA20在当前工作按照之前报道的数据为其他乳酸杆菌。

Busscher和合作者33)建立了一个最低表面张力下降8 mN m⁻¹区分生物表面活性剂生产和非生产的生物。考虑到这个值,没有研究乳酸杆菌菌株可以被视为一个分泌生物表面活性剂生产商。此外,关于cell-bound生物表面活性剂生产、压力l . coryniformisssp。torquens25600年摄影l . mesenteroidesA4也视为nonproducers。聚集在这两个图的结果1和表2,l . paracaseissp。paracaseiA20被发现最高的菌株生物表面活性剂的生产潜力。因此,优化培养基成分对生物量增长和生产生物表面活性剂的菌株进一步追求。

3.2。氮源对生物表面活性剂的生物合成的影响l . paracaseissp。paracaseiA20

如表中所述1,一些媒体被用于研究生物表面活性剂的生产l . paracaseissp。paracasei样子。从这些实验结果如表所示3。第一个可以得出的结论是所使用的铵浓度不代表任何负面影响这一毒株,因为中等我,这对培养基成分是一样的D (MRS-Lac),但补充铵浓度最高的研究(14.2毫升l⁻¹生物质生产),收益率高于中等D,和类似的生物表面活性剂的生产。然而,它被发现,当所有的氮源的等量取代铵(中H),没有增长,可能由于缺少一些必需营养素。因此,至少有一个传统的氮源的存在对经济增长是必要的。

乳酸菌(实验室)是极其挑剔的微生物适应复杂的有机基质。这些细菌不仅需要在能源和碳源碳水化合物还核苷酸、氨基酸、肽、维生素和矿物质的增长,由于缺少各种生物合成途径。例如,实验室不能增长为代价的矿质氮在缺乏外源氨基酸(34),他们的营养需求通常满足在复杂增长媒体的定义和昂贵的化合物如蛋白胨、肉汁、酵母提取物(29日]。

获得的结果与媒体含有两个氮的来源(E、F、G)清楚地表明,酵母提取物是细菌生长的最重要的因素,其次是肉类提取物,而蛋白胨似乎是最不重要的因素。有关的媒体只包含一个氮源(A, B, C)可以得出相同的结论。生物量浓度从0.378到2.805 gL明显不同⁻¹为不同的媒体研究。至于生物表面活性剂的生产,似乎蛋白胨是最重要的组成部分,尽管生物质生产的小小的贡献。最高cell-bound和分泌生物表面活性剂产品是通过媒体获得E和F(它们都含有蛋白胨)。两个媒体大量的生物表面活性剂产生高于中等D,而所有其他媒体导致较低的金额。有趣的是,生物质生产与媒体E和F是低于中等D(表3),尽管生物表面活性剂产量较高。与媒介E,降低表面张力的文化肉汤8.0 mN m⁻¹和24.5 mN m⁻¹在PBS提取,获得了。因此,这种媒介选择用于以下优化研究。

媒体评价,分泌生物表面活性剂的生产l . paracaseissp。paracasei被发现生长-样子,以前MRS-Lac(图描述2)。然而,比较结果为不同的媒体,发现高生物质产量并不总是导致更高的生物表面活性剂产量(表3)。这个观察是依照以前的报告所描述的文学,由于生物质和生物表面活性剂生产之间的关系在很大程度上取决于介质成分、碳和氮源是关键球员生物表面活性剂合成的规定(11,27,35,36]。对于微生物表现出生长-生物表面活性剂的生产,使用不同的碳和氮源能促进增长,而生物表面活性剂的生产。此外,使用不同的基质不仅影响生产生物表面活性剂的量,也会导致产品的合成具有不同成分和性质(7]。例如,在芽孢杆菌circulans生物表面活性剂的生产是生长-;然而,影响使用的碳源生物表面活性剂生产定性和定量,甚至改变了生物表面活性剂抗菌性(37]。类似的效应被描述荧光假单胞菌关于碳和氮源以及C: N比率(35]。

3.3。生物表面活性剂生产反应堆

增长和生物表面活性剂的生产l . paracaseissp。paracaseiA20也使用生物反应器研究为进一步优化过程。在这些实验中,pH值保持恒定的最优值(6.2)通过发酵。pH值是最重要的参数之一,影响细胞生长和新陈代谢。实验室产生大量乳酸,导致明显的pH值降低发酵。在最近的研究中,在摇动烧瓶实验文化肉汤的pH值从6.2下降到值约为3.5。由于这些低pH值、增长和抑制生物表面活性剂的生产。

第一个实验是没有进行曝气使用MRS-Lac作为文化肉汤。24小时的碳源筋疲力尽文化导致细胞死亡。生物量浓度2.1 gL⁻¹和文化肉汤和PBS的表面张力降低3.5 mN m⁻¹和14.5 mN米⁻¹分别得到(表4)。快速乳糖损耗必须由于pH值控制在最佳值,它允许更快的增长而摇动烧瓶实验。因此,为了避免这种效果,乳糖浓度增加到50 gL⁻¹(MRS-Lac II)和100 gL⁻¹(MRS-Lac III)和氮源保持各自的调整比C / N不变。当这些媒体在生物反应器化验,乳糖饥饿没有被观察到,生物量和生物表面活性剂生产高比较MRS-Lac获得的数据(表4)。此外,预期可以观察到生物量和生物表面活性剂在生物反应器生产价值获得高于得到的摇动烧瓶。MRS-Lac三世不产生更好的结果比MRS-Lac二世,可能由于碳源(表的抑制作用4)。鉴于这些结果,MRS-Lac二世被选为最有利的媒介对经济增长和生物表面活性剂在生物反应器生产。

生物表面活性剂的生产在某些酵母刺激当搅拌和曝气率增加(32]。在实验室中,柠檬酸循环或呼吸链不存在;然而这些细菌能够在有氧气存在的由于oxygen-metabolizing酶的活动如超氧化物歧化酶、NADH氧化酶类,NADH氧化酵素。评价曝气的效果显示在细胞生长和生物表面活性剂的生产,另一个试验是进行生物反应器使用MRS-Lac二世作为文化肉汤,但保持20% (v / v)氧浓度。在这种情况下,生物量浓度高于无曝气实验,而生物表面活性剂的生产被发现(表低4)。因此,关于生物表面活性剂生产使用这个压力,比较生物反应器中的所有结果,增长不曝气比与曝气产生更好的结果。

先前的研究表明,MRS-Lac-E是最有利的媒介生物表面活性剂的生产l . paracaseissp。paracaseiA20摇动烧瓶(表3和图2 (e))。因此,为了进一步优化这个媒介,以及之前的结果表明,较高的乳糖浓度导致更高的生物量和生物表面活性剂产量在生物反应器中,几家媒体有不同的乳糖浓度进行了研究使用相同的操作条件下早些时候描述(没有曝气)(表4)。结果表明,增加乳糖浓度进行生物量浓度的增加(从1.243到3.328 gL⁻¹)。此外,正如前面摇动烧瓶中观察到的,使用相同的乳糖浓度(50 gL⁻¹),生物量浓度与MRS-Lac-E-50生物反应器与MRS-Lac低于二世,因此确认酵母提取物是发展的一个重要因素这一毒株。至于生产生物表面活性剂,乳糖浓度进行了更明显的增加cell-bound的合成和分泌生物表面活性剂(表4)。最好的结果是获得中等MRS-Lac-E-50,表面张力降低为7.8 mN m⁻¹文化肉汤,24.7 mN m⁻¹在PBS提取物。

4所示。结论

尽管乳酸杆菌能产生少量生物表面活性剂相比与其他微生物,如枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌,表现出许多营养需求,他们构成了一个有前途的生物表面活性剂的来源,因为这些微生物通常被认为是肝,已经用于许多食品制造业和工业过程。此外,生物表面活性剂的生产产量的增加可以通过培养条件的优化。在这项研究中,从葡萄牙乳制品中分离到一株堆肥的植物,不同氮源对经济增长的效应和生物表面活性剂生产评估。发现酵母提取物对细菌生长的一个重要组成部分,同时对生物表面活性剂生产蛋白胨是最重要的因素。蛋白胨和肉汁导致更高的生物表面活性剂的生产相比,标准的媒介。结果的优化过程,生物表面活性剂生产改善,在烧瓶和反应堆,将使用的可能性l . paracaseissp。paracasei作为一种很有前途的样子biosurfactant-producer。

承认

这项工作是由FCT(葡萄牙)项目的范围BIOSURFA:生物表面活性剂应用微生物粘附抑制医疗设备(PTDC / SAU-BEB / 73498/2006)。

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