文摘

紫杉醇(PTX)是一种广泛使用的化疗药物用于治疗肿瘤。然而,研究表明,它可能导致心脏问题,如心律失常、心肌炎、慢性心肌病,心脏衰竭。因此,有必要研究背后的机制在肿瘤PTX治疗的毒性。在这项研究中,我们最初PTX注入小鼠建立心肌细胞凋亡模型,观察小鼠心肌损害的程度由PTX引起的。在确定小鼠心肌肌酸磷酸激酶的水平(CK)、肌激酶同工酶(水平)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH),我们发现,所有的这些水平显示,老鼠PTX治疗明显增加。肿瘤坏死因子-进一步分析α水平和小君氨基端激酶的表达(物)和bcl - 2论蛋白在心肌组织进行。发现PTX TNF的蛋白质含量增加α伯灵顿,p-JNK和物在心肌组织,但bcl - 2蛋白水平的降低。在老鼠PTX治疗1个月后,我们抑制TNF的表达α物蛋白,降低了紫杉醇对小鼠心肌细胞的凋亡。伯灵顿的蛋白质含量、p-JNK和TNF -α在心肌细胞减少,而有一个相对增加bcl - 2蛋白水平。研究结果表明,抑制NK信号通路与肿瘤坏死因子-α可以减轻PTX对小鼠心肌细胞的影响。

1。介绍

持续改善肿瘤治疗疗效有延长患者生存1]。原发肿瘤治疗方案化疗、靶向治疗、免疫治疗(2,3]。然而,据报道,化疗和靶向药物可以增加心脏损伤的风险4,5]。麦高文et al。6)表示,与许多癌症患者蒽环霉素可能成为明天的心脏病患者。曲妥珠单抗分子靶向药物也是一个最广泛的报道与毒性有关(7,8]。antimicrotubule化疗药物、多西他赛和紫杉醇也能导致毒性(心律失常、窦性心动过缓等。)9,10]。

紫杉醇(PTX)是一个药物提取紫杉施加影响与各种肿瘤。它是最广泛使用的抗肿瘤药物化疗在过去20年,包括头部和颈部恶性肿瘤,肺恶性肿瘤,乳腺恶性肿瘤,子宫内膜恶性肿瘤,宫颈恶性肿瘤、结肠直肠癌。它有各种活动在一些恶性肿瘤(11]。PTX是相对罕见的毒性,但据报道,该药物能引起心脏问题如心肌炎(12)和心脏衰竭(13]。它也降低了患者的心脏功能和生活质量。因此,研究毒性的作用和机制PTX心脏,然后采取适当的措施减少心脏病的发生在肿瘤治疗是很重要的。

据报道,氧化应激,缺血/再灌注,和其他因素可以引起心肌细胞的凋亡14,15),从而导致各种心血管疾病。因此,减少心肌细胞凋亡是治疗心血管疾病最重要的目标之一。c-Jun n端激酶(物)通路的一个子类MAPK增殖蛋白激酶通路,即参与各种生物过程,如细胞周期、生长,细胞凋亡,细胞应激(16]。

一系列的细胞称为MAPK / ERK通路中的蛋白有时也称为Ras-Raf-MEK-ERK通路和传输信号从细胞表面的受体细胞的细胞核内的DNA。在真核生物中,包括酵母和人类,MAPK模块组成的顺序3激活蛋白激酶对一些信号转导途径,控制活动是必不可少的,包括细胞分裂、增殖和死亡(17]。有三个家庭的MAP激酶。这些是erk (extracellular-signal-regulated激酶),物和p38 / SAPKs(压力激发了蛋白激酶)在哺乳动物中18]。物被激活和转移到细胞核,刺激转录因子c-Jun及其磷酸化、促进细胞凋亡、分化(19]。肿瘤坏死因子-α(TNF -α)是一种细胞凋亡和炎症的重要调节器。它促进细胞凋亡被绑定到肿瘤坏死因子受体1 (20.]。有必要进一步研究物信号通路与肿瘤坏死因子-α保护心肌细胞。因此,这项工作的目的是研究肿瘤坏死因子——的影响α和物的心肌细胞信号通路PTX-treated老鼠。

2。材料和方法

2.1。实验动物、试剂

四十健康,干净的老鼠重18 - 22 g之间从广西医科大学动物中心购买。肿瘤坏死因子-α酶联免疫试剂盒购自Biovision(产品编号k1052 - 100)。物,肿瘤坏死因子-αp-JNK, bcl - 2、Bax和β肌动蛋白抗体购自Yubo生物技术有限公司,有限公司合山羊anti-rabbit免疫球蛋白是购自Boaosen生物技术。发射极耦合逻辑颜色开发工具包是购自上海逸生生物技术有限公司有限公司BCA试剂盒和蛋白质提取包从图像科技有限公司购买,胰蛋白酶,二甲亚砜,胎牛血清都购自σ(美国)。DMEM购买从北京Kairuiji生物技术有限公司有限公司

2.2。实验分组和PTX干预

40老鼠分为空白对照组,PTX 50μ50 g / g组,PTX 100μ50 g / g组和PTX 150μ50 g / g组,每组10只老鼠。的PTX 50μ50 g / g组与生理盐水稀释至0.5μ克/μL;因此,实际的剂量使用 。PTX 100μ50 g / g组与生理盐水稀释至1.0μ克/μL;所以,实际的使用剂量是1 。PTX 150μ50 g / g组被稀释到1.5μ克/μL盐水;因此,实际的剂量使用 。这些干预措施是由腹腔内注射每3天3个月。

2.3。检测心肌酶指标和血清TNF -α老鼠的变化

PTX干预3个月后,2毫升的血液被收集到的老鼠和眼球的EP(埃普多夫)管。血后被允许站2 h,在12000转离心10分钟,然后是浮在表面的。肿瘤坏死因子-α使用TNF -水平检测α酶联免疫试剂盒。老鼠牺牲后,打开胸腔很快还可以把血液从心脏。如果采集血液量太小,因为心脏停止了跳动,大血管切开进一步收集。收集血液立即被送往实验室测定心肌酶的水平肌酸磷酸激酶(CK)、肌激酶同工酶(水平)和天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)。

2.4。蛋白质含量的检测物,伯灵顿,p-JNK和bcl - 2在心肌组织

心肌组织解散了里帕裂解缓冲,并通过BCA试剂盒提取总蛋白(西格玛奥德里奇图像技术有限公司,美国)。蛋白质装载量是60μg。蛋白质被sds - page电泳分离,其次是硝化纤维膜转移。硝化纤维膜密封与5%脱脂奶为1.5 h,之后p-JNK(1: 800)、物(1:800),TNF -α(1:800),伯灵顿(1:800),bcl - 2 (1: 800)β肌动蛋白(1:1000)主要抗体都补充说,其次是孵化12 h。然后,一个HRP-labeled山羊anti-mouse二级抗体(1:5000)是补充说,其次是孵化为1.5 h。过敏的发射极耦合逻辑(增强化学发光)液体添加与黑暗的污点反应5分钟。凝胶成像系统被用来获取照片,和ImageJ软件被用来分析每个蛋白质带的强度级别。

2.5。Nano-PCR聚合酶链反应检测

试剂盒试剂用于提取细胞总RNA,当时reverse-transcribed成cDNA使用逆转录工具包。PCR反应体系包括10μL 2×SYBR预混料Taq II, 0.4μ上游引物,0.4的LμL(反向引物,和2μL (cDNA模板,DEPC (diethylpyrocarbonate)水添加到卷到20μl . 0.5μ20米/μL的金纳米粒子添加到上述反应体系。金纳米粒子可以收集水滴在离心管的顶部形成液滴,加速温度传导的速度从顶部覆盖的PCR仪器对温度的反应系统。这提高了PCR反应的灵敏度和检测精度。PCR扩增程序如下:95°C预热1分钟,35周期30年代变性在94°C, 30年代复性60°C, 1分钟在72°C扩展,最后,维护在72°C 5分钟。GAPDH基因作为参考,使用公式计算2的表达水平- - - - - -△△Ct。

2.6。抑制物和TNF -α

老鼠在PTX 50μ50 g / g组,PTX 100μ50 g / g组和PTX 150μ50 g / g组PTX治疗,疗程1个月,紧随其后的是口服物抑制剂JNK-IN-8 (MedChemExpress)和肿瘤坏死因子-α抑制肿瘤坏死因子-α1 (MedChemExpress) 2个月。

2.7。TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

冰冻的心肌组织部分与10%中性甲醛固定与PBS 10分钟,冲洗。部分被放在一个醋酸溶液:乙醇(1:2),5分钟在-20°C的反应,用PBS 10分钟。PBS含有2% H2O2是添加到片,其次是5分钟的反应在室温下,并与PBS洗。两滴dt(末端转移酶)酶反应缓冲区添加并允许3分钟25°C。随后,50μL (TdT)酶反应的解决方案是添加,让反应在37°C,湿度50% 1 h。然后,切片放在染色板洗涤缓冲和停止反应缓冲区,和混合反应了30分钟在37°C。两滴antidigoxin抗体反应应用一滴一滴地,左0.5人力资源在25°C,湿度50%部分后一直与PBS冲洗15分钟。

随后,部分用PBS 20分钟洗净,和新准备轻拍(3、3 0.05% - - - - - -diaminobenzidine)解决方案是一滴一滴地补充道。颜色是3到6分钟25°C,在蒸馏水洗8分钟,重染甲基绿的10分钟。幻灯片是在蒸馏水30年代后为1 s淹没。然后,幻灯片被取消,这一步是重复20次。这后,载玻片浸30年代后淹没在正丁醇100%,提高了20倍。片被脱水,二甲苯为2分钟3次。安装和干燥后的幻灯片,结果在显微镜下检查。

2.8。统计分析

比较两组之间进行使用统计软件SPSS 21.0和GraphPad棱镜。数据显示为 。的 - - - - - -测试是用于比较两组,而方差分析(方差分析)是用于多组比较。差异具有统计学意义如果被发现 。

3所示。结果

3.1。心肌酶的变化和血清TNF -索引α在老鼠PTX干预

当心肌细胞坏死由于种种原因,他们的酶进入血液,增加血液酶水平(21]。本研究评估造成的损害不同浓度PTX老鼠心肌。通过检测小鼠心肌酶的水平,我们发现,与PTX治疗后,心肌酶CK,水平,AST、LDH的平均表达水平明显增加( ,数据1(一)- - - - - -1 (d))。血清肿瘤坏死因子-α内容也增加了( ,图1 (e))。在比较的结果PTX 50μ50 g / g组心肌酶水平和TNF -α水平的老鼠PTX 100μ50 g / g和150μ50 g / g组增加( )。这些结果表明,PTX会导致不同的小鼠的心肌损伤。

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图1
心肌酶的变化和血清TNF -索引α在老鼠紫杉醇(PTX)干预。(一)肌酸磷酸激酶(CK)。(b)肌肉激酶同工酶(水平)。(c)天冬氨酸转氨酶(AST)。(d)乳酸脱氢酶(LDH)水平。肿瘤坏死因子-α(TNF - (e)α)。 。
3.2。PTX干预后心肌细胞凋亡

与对照组(图的结果2(一个)),PTX组的细胞凋亡增加(数据2 (b)- - - - - -2 (d)绿色荧光点)。相比之下,发现PTX 50μ50 g / g组(图2 (b)),有明显的减少细胞凋亡与PTX干预后100年μ50 g / g和150μ50 g / g ( ,参见图2 (c)和2 (d))。

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图2
心肌细胞凋亡。(一)对照组。(b)紫杉醇(PTX) 50μ50 g / g组。(c) PTX 100μ50 g / g组。(d) PTX 150μ50 g / g组。
3.3。物和TNF -的表达α在心肌组织PTX干预后的老鼠

TNF的表达α、物和bcl - 2论蛋白在心肌细胞也被确定。与对照组的结果相比,水平的物,TNF -α、p-JNK和伯灵顿PTX组增加( )。相比之下,发现PTX 50μ50 g / g组,100年PTX干预μ50 g / g和150μ50 g / g细胞凋亡减少( )。PTX TNF的蛋白质含量增加α物,伯灵顿,p-JNK在心肌细胞中,同时减少蛋白bcl - 2(图的水平3)。

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图3
c-Jun n端激酶的表达(物)和肿瘤坏死因子(TNF -α)在心肌组织中紫杉醇(PTX)干预后的老鼠。(一)物和TNF的表达α蛋白在心肌组织。(b)物和TNF的表达α信使rna在心肌组织中。 。
3.4。抑制物和肿瘤坏死因子的影响α在小鼠心肌PTX干预

在老鼠PTX治疗1个月后,我们抑制TNF的表达α和物。我们发现,而这些发现在老鼠PTX治疗,疗程3个月,抑制肿瘤坏死因子-α和物降低了紫杉醇对小鼠心肌细胞的凋亡的影响。此外,p-JNK的蛋白质含量,伯灵顿,TNF -α在心肌组织细胞减少,而bcl - 2蛋白水平的提高(见图4)。

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(b)
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图4
抑制c-Jun n端激酶的影响(物)和肿瘤坏死因子(TNF -α)在小鼠心肌细胞凋亡在紫杉醇(PTX)干预。(一)伯灵顿和bcl - 2蛋白表达与心肌细胞凋亡有关。(b)伯灵顿和bcl - 2 mRNA的表达与心肌细胞凋亡有关。

4所示。讨论

化疗是抗肿瘤治疗不可缺少的一部分。研究表明一个明显增加患者的心脏功能异常发生率化疗药物(22]。因此,目前迫切需要阐明如何使用化疗药物来减少损害心脏和其他器官。在此背景下,本研究调查了PTX对小鼠心肌细胞的凋亡,打算识别一种减轻细胞凋亡。

在这项研究中,我们首先构建了一个PTX小鼠模型观察小鼠心肌损伤的程度由PTX引起的。通过确定小鼠心肌酶的水平,我们发现心肌CK的平均水平,AST水平,LDH在老鼠PTX治疗增加。与此同时,血清TNF -的中级水平α也明显上升。这表明PTX能破坏老鼠心肌细胞并诱导细胞凋亡。进一步检测TNF -α、物和bcl - 2论蛋白在心肌细胞表明PTX物的蛋白质含量增加,p-JNK, TNF -α,伯灵顿在心肌细胞和bcl - 2蛋白水平的降低。这进一步证实了损害PTX对小鼠心肌细胞的影响,表明PTX可能影响物的蛋白质含量和TNF -α在小鼠的心脏组织。以前的研究已经表明物通路是心肌细胞凋亡密切相关23]。这种途径是MAPK通路的一个分支。当细胞受到刺激时,JNKK2 / MKK7或JNKK1 / MKK4 SEK1调解Thr183和Tyr185的磷酸化,激活物和使它保持酶的活性(24,25]。p-JNK可以促进多种凋亡蛋白的表达和调节细胞凋亡的线粒体水平。紫杉醇被证明能促进物活化,ERK失活,降低基底p38 MAPK活动KB-3人类表皮样癌细胞(26]。由于几个凋亡信号的组合,包括DNA损伤、氧化应激,生长激素的缺乏,导致细胞凋亡和辐射,线粒体蛋白质从内膜释放空间。物有至关重要的作用在修改的行为支持和抗凋亡蛋白中发现线粒体,除了规范核信号导致proapoptotic基因的超表达凋亡基因的差别和/或对这些27,28]。

此外,它可以作用于proapoptotic蛋白bcl - 2家族的伯灵顿诱导细胞色素进入细胞质,从而激活细胞凋亡。肿瘤坏死因子-α激活能激活NF -κB信号,进而导致细胞凋亡29日]。物促进细胞凋亡通过阻断凋亡蛋白如Bcl2和增强的活动proapoptotic蛋白质,尤其是BH3-only蛋白质家族的成员。物被激活在microtubule-damaging agent-induced乳腺癌细胞凋亡,和主动物有牵连的磷酸化Bcl2 Ser70 [30.]。上游事件,导致反应物激活低剂量紫杉醇治疗还有待研究。已经观察到,活性氧(ROS)的形成是一个早期和关键阶段paclitaxel-induced肺癌细胞死亡(31日]。

因此,我们推测,抑制物或TNF的表达α可以减少损害PTX老鼠心肌细胞。在这项研究中,老鼠PTX治疗1个月后,我们抑制TNF的表达α和物的蛋白质。我们发现抑制TNF -α和物可以减少的影响PTX老鼠心肌细胞的凋亡。它可以减少p-JNK,伯灵顿,TNF -α蛋白质含量和增加bcl - 2蛋白的水平。建议的抑制TNF -α和物信号通路可以减少PTX造成小鼠心肌细胞的损害。

5。结论

总之,目前的研究显示明显增加心肌LDH、CK、水平和AST水平老鼠PTX治疗。PTX TNF的蛋白质含量增加α伯灵顿,物,p-JNK心肌细胞而bcl - 2蛋白水平的降低。在老鼠PTX治疗1个月后,我们抑制TNF的表达α和物的蛋白质。这降低了紫杉醇对小鼠心肌细胞的凋亡;的蛋白质含量降低TNF -α、p-JNK和伯灵顿在心肌组织;和bcl - 2蛋白质含量相对增加引起的。总之,抑制肿瘤坏死因子-α和物信号通路可以减少损伤小鼠心肌PTX所致。这个实验在一定程度上揭示了造成的心肌细胞损伤PTX减弱。进一步说,它提供了思想对预防心脏中毒引起的抗肿瘤药物。

数据可用性

数据将被要求作者提供。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

双任和中钢总裁黄天文的贡献同样这项工作,co-first作者。