文摘
在肠杆菌科调查抗生素耐药性的机制。碳青霉烯肠杆菌科细菌隔绝医院从2015年1月至2020年6月被选中。耐药表型试验、药物敏感性试验,结合测试被用来观察药物敏感结果和acrB抗体的效价。最后,对数据进行统计分析。所有菌株对头孢他啶,头孢曲松钠,厄他培南,aztreonam。87.5%的样本对哌拉西林耐药。多点输入序列显示5特拉肺炎克雷伯菌属于4种不同的类型。序列类型的kpn6099和kpn6617是相同的。灵敏度的比较,大肠杆菌J53更敏感,这两种抗生素,最低抑制浓度值分别为0.5和0.25μ分别g / ml。此外,的敏感性大肠杆菌J53 kpn6617碳青霉烯略高于。结果表明,酶联免疫吸附试验效价的acrB 1:40,000抗体,抗体的制备acrB是成功的。Plasmid-mediated删除IMP-1金属-β内酰胺酶绑定外膜蛋白是一种抗生素敏感性的降低的主要原因。
1。研究背景
一旦发生耐药,药物的化疗效果明显降低。耐药性可分为获得耐药性和天然耐药性根据其原因。病原体在自然界,如株细菌,也可能自然阻力。细菌耐药性的特点是治疗传染病的一个主要问题(1]。细菌可以抵抗一定类的抗生素,或多种抗生素具有不同的化学结构2,3]。根据细菌耐药性,它可分为单耐药和多药耐药性4- - - - - -6]。前者指的是某个类细菌抵抗抗生素,这是由一个耐药因子;后者是指细菌抵抗多种抗生素通过染色体和质粒介导的(7,8]。前者并不依赖于抗生素,但细菌的遗传与进化密切相关。后者是基因突变的结果选择压力下,如抗生素,也与耐药质粒的转移和传播有关,转座子和整合子9,10]。
例如,与国外相比,广谱polylactase生产大肠杆菌更耐氨基糖甙类、磺酰胺类和喹诺酮类。大肠杆菌与尿路感染耐药机制十分复杂。大部分的耐药基因存在于质粒,这很容易导致耐药性的传播。这给治疗带来很大的困难。这些致病基因通常编码在移动原生质体和不同菌株之间传播(11]。
一般来说,细菌耐药性主要通过以下机制:灭活酶的生产,导致药物活性的丧失或结构变化;细菌细胞膜的渗透性的变化、药物或消毒剂,洗涤剂,和其他化学物质不能进入细菌;抗菌药物的目标结构或数量发生变化时,无法有效地结合抗菌药物;药物是通过主动流出系统抽出身体,杀死细菌的药物不能达到阈值浓度(12,13]。
抗生素是一类次生代谢物与摘要或其他活动由微生物或高等动植物在生活的过程中,它可以干扰其他活细胞的发育功能。通常,上述机制同时发生,这决定了一些细菌对某些抗生素的耐药性。根据作用机制,主动喷射系统可分为五个总科:ABC绑定盒子总科,主要促进亚科和耐药节细胞分化的家庭。除了这些,其他的能源依赖。细菌射流泵系统主要由运输车,额外的蛋白质,和外膜蛋白质。转运体位于细胞质膜和充当一个泵。额外的蛋白质作为外膜蛋白和转运体之间的一座桥梁。外膜蛋白类似通道蛋白质和位于细胞壁或外膜(14]。这三种蛋白质是不可或缺的维持细菌流出系统的正常功能。细菌也有一个活跃的泵系统,它不仅能分泌出次生代谢产物,而且抗生素(15]。
2。理论基础
2.1。肠杆菌科
肠杆菌科细菌广泛分布有很大的宿主范围。人类、动物和植物寄生或共生,附生植物的,腐生的,,也可以生存在土壤或水,和人类密切相关。肠杆菌科细菌可以cross-infect和医务人员和病人之间传播,以及他们的基因材料(如质粒或转座子)可以从外界获得,导致耐药基因的水平传播,这也进一步导致了广泛耐药细菌的16,17]。近年来,随着的广泛使用β-lactamases (ESBLs)和AmpC酶在肠杆菌科ESBLs可以消除几乎所有头孢菌素除了碳青霉烯,这使得碳青霉烯成为重要的临床药物治疗-细菌感染,和特拉肠杆菌科一年一年地增加(18,19]。AmpC酶可分为三种类型根据其生产模式:诱导高产酶持续高产酶,和持续的低当量的酶。高产酶的合成通常是相关的β内酰胺抗生素。是否存在这种酶β内酰胺抗生素,有一个高水平的AmpC酶。原因是为了防止突变和调节ampD基因的突变,产生缺陷ampD蛋白之一。因为它不形成蛋白质复合体与另一个蛋白质ampr监管,它会导致ampr激活的蛋白质和AmpC酶的表达是有限的。的广泛应用β内酰胺抗生素,尤其是头孢菌素,AmpC酶由革兰氏阴性细菌的数量在增加,尤其是AmpC酶的出现和plasmid-mediated AmpC酶,导致耐药菌株的广泛传播。肠杆菌科的耐碳青霉烯主要是由三个机制:第一,生产的";第二,高收益的损失或向下调节ESBLs或AmpC酶蛋白质绑定气孔,导致对碳青霉烯的敏感性降低;第三,penicillin-binding蛋白质的改变(PBP),碳青霉烯的目标(20.,21]。肺炎克雷伯菌" (KPC)酶生产的"k .肺炎。肠杆菌科细菌之一k .肺炎。k .肺炎st258携带KPC酶,是世界上广为传播,和k .肺炎st11是中国的主要类型(22]。主要的多站点类型(MLST)类型的序列k .肺炎携带KPC酶在中国与国际一致MLST分类、ST131,传播的模式更为复杂和多样化23]。耐药基因位于质粒的共同区域,整合子,转座子,或插入序列,并且可以转移水平,和横向传播在相同或不同的菌株通过耦合、转换、转导,换位24,25]。
KPC不仅可以水解碳青霉烯酶,而且青霉素,头孢菌素,aminoaspergillins [26]。新德里金属内酰胺酶(NDM)是一种常见的",根据Ambler分类属于B型。EDTA一般指乙二胺四乙酸。EDTA是一种有机化合物的化学式是C10H16N2O8。EDTA可以抑制这些酶的水解活性。像KPC酶B类目前不被商业内酰胺酶耐药抑制剂。Imipenemase -金属β内酰胺酶(IMP)酶是一种很常见的B类酶,这是最常见的铜绿假单胞菌。然而,近年来,隔离的小鬼酶在肠杆菌科也在上升。小鬼酶的基因环境往往是复杂和多样化,但它通常存在于整合子,整合子可以捕获其他基因的磁带。整合子与转座子相关联或质粒时,小鬼酶也可以获取其他基因磁带,和稳定的传输中可以看到各种各样的细菌。大肠杆菌是一个正常的殖民细菌在人体内的一个常见的条件致病菌,可引起呼吸道、泌尿系感染和菌血症。目前,大肠杆菌是一个正常的细菌殖民化,也是一种常见的条件致病菌。虽然临床感染的发生率低于k .肺炎,它扮演着一个重要的角色在医院和社区获得性感染。如果我们不注意耐药性研究和及时采取屏蔽措施,一旦它在人群间的传播,后果将是不可想象的。他们可能与流行病学。特别是,E2和E4属于重症监护室(ICU)和有相同的MLST pulsed-field凝胶电泳打字。携带的耐药基因160 kb incfII质粒相结合。两个菌株通过克隆传播,导致感染不同的病人在同一病房(27]。
多级筛选后,突变株T-E5稳定角色和更强的活动。菌株E5和E7来自呼吸道部门和普通外科部门,分别有很高的遗传相关性。医院感染控制是非常重要的在医院里减缓耐药细菌的传播。耐药性的起源,固有耐药性是耐药性并不依赖于抗生素的存在,它有一个更大的遗传和进化关系,和内部耐药性细菌本身的遗传特性稳定,细菌染色体是由DNA,类似细菌的共同特征。获得性耐药是由基因突变引起的或移动的转移抗生素压力阻力因素。迁移因素包括质粒、转座子、整合子(28]。
2.2。抗生素敏感性
抗生素的选择压力下,逐步形成耐药性病原体,传染性病原体产生耐药性。进一步降低灵敏度。更重要的是,由于不合理的使用抗生素,许多病原体有发达的多药耐药性。imipenem和meropenem相比,例如厄他培南可能更敏感的外膜蛋白的变化,更适合表明细菌外膜蛋白的变化。尿路感染是指大量的细菌进入尿道,引起尿路炎症。尿路感染是最常见的一种细菌感染。目前,慢性肾盂肾炎的诊断应该有典型的影像学表现的慢性肾盂肾炎诊断静脉肾盂摄影。尿路感染可以发生在任何年龄。目前,有许多种类的抗生素治疗尿路感染。用于尿路感染的抗生素主要有乳酸内酰胺抗生素和呋喃妥英。 Fluoroquinolones can replace sulfonamides and can be used as the first choice of drugs for urinary tract infection. Due to the rapid increase of drug resistance in vivo and the low resistance rate of other antibiotics, lactam antibiotics are not recommended as the first choice for empirical treatment of urinary tract infection.
在传播的同时,原始的基因可以获得一个新的致病基因;或者以前编码在移动等离子但后插入到染色体突变(29日]。尿路细菌感染是一种常见的传染病,主要包括无症状菌尿、膀胱炎、肾盂肾炎。肾盂肾炎可以危及患者的生命安全。分子类型主要包括多点测序,核糖体打字,聚合酶链反应(PCR)打字。前两种方法是费时又费力,而集群UPEC PCR打字可以快速、准确地。根据PCR打字,大肠杆菌可分为四种类型:一、提单,B2,和D B2型是最常见的类型的尿路感染,其次是D型、A型和提单主要是肠道共生体。CNF-1在海拉细胞的主要生理功能是让海拉细胞广泛多核和圆的,但不能诱导海拉细胞凋亡。这个细胞株没有死于衰老和可分为下去。海拉细胞通常是作为细胞模型大肠杆菌附着力测试(30.]。获得性耐药主要包括电阻引起的基因突变引起的移动因素和抵抗抗生素造成的压力。外膜通透性的改变:减少抗生素进入细菌的数量,减少耐药性的大肠杆菌由于抗生素的摄入量。
AcrAB-TolC外排泵的过度表达是肠杆菌科的多药耐药性的主要机制之一,它主要由周质的融合蛋白肢端,外膜通道蛋白TolC和质子转运AcrB药物。在正常情况下,正常的表达acrabtolc导致的阻力大肠杆菌肠道胆汁盐和其他疏水物质;然而,它的过度会导致广泛的耐药性,包括内酰胺、氟喹诺酮类原料药、四环素、氯霉素、红霉素、新霉素和利福平。如果灭活,系统的灵敏度不同类型的抗生素将会显著增加。过度的铜绿假单胞菌可以显著降低的敏感性大环内酯类、氨基糖甙类和四环素。与前者相比,后者更容易在环境中传播。耐药质粒被广泛发现革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。耐药质粒是由两部分组成:耐药性的决定因素和耐药性的传播因素。这两个部分可以独立存在或作为一个整体,但是没有单独存在时共轭转移。他们是典型的杀菌剂在繁殖季节。
2.3。耐药机制
目前,细菌是已知耐内酰胺抗生素通过以下三种机制:灭活酶的生产。根据布什分子分类分类和“漫步者”,他们被分为四组。的编码基因家族包括CTX-M, OXA SHV,电气/ IBC,等等。金属己内酰胺酶:金属离子活性中心。主要的编码基因IMP和VIM基因家族。除了内酰胺酶抑制剂,没有或只有微弱的抗菌活性。当结合其他内酰胺抗生素耐药,它可以显著提高青霉素类及头孢菌素类抗菌活性对内酰胺酶不稳定的阻力。不同的内酰胺抗生素有不同的粘结强度和数量是,所以不同的内酰胺抗生素有不同的抗菌效果。因此,这些喷射泵的活动可能会影响入侵的因素。
革兰氏阴性细菌一般指细菌革兰氏染色反应的是红色的。在革兰氏染色实验中,首先,为主要增加了结晶紫染色,然后添加碘溶液对比染色。革兰氏阴性细菌,如大肠杆菌,沙门氏菌,铜绿假单胞菌等等,越来越对常用抗生素,部分是因为复杂的膜结构。由外膜和内膜结构,形成胞质空间。有毒物质可以吸收的细胞质和放电直接从身体,从而减少药物分子的数量达到细胞质的目标。革兰氏阴性细菌的外膜能有效地限制了活跃的亲水和疏水分子的渗透,这无疑提供了一个额外的保护因素。同时,多药耐药性革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌都参与了射流泵。射流泵的多个特征转运蛋白导致常见的耐药机制,也就是说,提高抗生素的作用目标突变和其他耐药机制或促进药物的收购的修改。肿瘤抑制基因的突变是相对随机。任何位置的基因,无论任何形式的突变,只要突变导致的基因失去功能,或其功能降低,这可能影响肿瘤的发生。
在大肠杆菌K12的,耐药结核病分化(RND)流出系统包括acracarbtolc acreacrfttolc, acraacrdtolc, mdtamdtb / mdtctolc, yhiuyhiv TolC。大肠杆菌是最常见的一种细菌药物外排泵。一般来说,有超过30种喷射泵。其中,acrabtolc是最重要的喷射系统。Acrabtolc系统由三部分组成:外膜通道蛋白,膜融合蛋白(MFP)肢端和射流泵输送acrB。肢端,acrB TolC acrabtolc喷射系统中发挥着各自的作用。当aclabtolc的表达式是最低的,它主要是由acrR监管。这个时候,如果acrR不存在,acrbtolc系统是由积极的监管机构监管的马拉;袜可以激活多个抗性基因的编码或操纵子,如aclab TolC, MICF,袜和其他基因激活,可以显著提高的耐药性大肠杆菌。不同于马拉和袜,抢大分子量和存在于高浓度在正常情况下,它可以确保它可以完全穿透目标启动子和调节许多基因包括marRAB。MDR是不寻常的,因为它编码三个不同的转运蛋白。TolC应该用作药物的外膜单元流出系统依赖于MFP,不管endomembrane蛋白质的类型大肠杆菌。与此同时,贝尔的存在并不是一个必要条件,以确保完整的活动贝尔超表达的完整的细菌。射流系统包括外膜蛋白,额外的蛋白质,和内部和外部的转运蛋白。转运蛋白位于细胞质中作为泵,连续放电药品、洗涤剂、染料、和其他基质。在临床应用中,大多数射流泵的抗药细菌属于RND家庭。类似于氟喹诺酮类原料药的阻力因素,大量的革兰氏阴性杆菌被发现。药物RND-MFP外膜因子(OMF)外排泵系统可以适应大量的不相关的化学分子,如阳离子抗菌肽、脂肪酸、胆盐,和钠高丝氨酸内酯。碳青霉烯治疗ESBLs生产则成为了他们的首选大肠杆菌。
3所示。实验
3.1。研究对象
肠杆菌科孤立从医院从2015年1月至2020年6月被选中。
3.2。实验计划
碳青霉烯耐药菌株的敏感性测试和鉴定:肠杆菌科的敏感性对碳青霉烯检测采用的方法,和特拉菌株被VITEK筛选和识别®2。
抗性表型测试:检测表型、修改测试,IPM EDTA双盘协作测试,IPM + EDTA复合盘测试,ESBLs确认测试,AmpC酶表型测试,和无菌试验:粗酶提取Mueller-Hinton琼脂板上被播种,在一夜之间35°C孵化,下一步进行了对于那些没有细菌生长。如果细菌增长,灭菌后可进行后续实验(离心或反复超声)。
MLST:菌株被测序,7家庭基因(rpoB,phoE,地对空导弹,infB,mdh,tonB,pgi)k .肺炎放大了PCR和测序,与数据库相比较,并分析了序列类型的菌株。
药物敏感性测试:基线测试纸是用来测试原始菌株的药物敏感性和随后的共轭转移联合测试。操作步骤如下:细菌是悬浮在18 - 24小时的孵化器,无菌环板是精心挑选,地面和细菌悬液在生理盐水均匀,和浊度调整到0.5。使用无菌棉,细菌悬液浸在致密涂层板,和盈余细菌液体旋转棉花擦洗,细菌悬液是挤压的试管内壁。标记后的琼脂板“十字架”,把它均匀的三倍。每个密封涂层后,板旋转60°为下一个致密的涂层,确保均匀分布的细菌进行测试。最后,沿着画一条线在板的边缘。打开板覆盖,在室温下干燥,并粘贴在15分钟内基线测试纸。使用无菌镊子基线测试纸粘在一起,并使用无菌镊子把无毒的基线测试纸在一起,把最低抑制浓度(MIC)值在琼脂表面,在纸上和挤出泡沫。在大量的药物敏感性测试,需要消毒镊子。在粘纸不能动。 Incubation record results: the drug sensitive plate was incubated in 35°C incubator for 16–18 hours. MIC values of various drugs were read according to the size of inhibition zone, and the results were recorded.
结合测试:"基因检测的可转让性结合测试。大肠杆菌J53 (大肠杆菌J53)是对叠氮化钠,是一个受体菌株。供体和受体细菌的单一的殖民地加入1毫升Luria-Bertani介质,分别。4小时后摇孵化35°C。解决方案是基于捐赠者的比率:收件人细菌在35°C = 1:2和孵化4小时。
具体步骤的酶联免疫吸附试验(ELISA)如下:包被抗原R1081-1-2 96板,密封胶解决方案,与抗体孵化;洗碗后,添加第二个与过氧化物酶抗体标记;添加tetramethylbenzidine磷酸盐缓冲剂和过氧化氢,反应终止的解决方案是硫酸。产品的吸光度检测在450海里。
3.3。实验结果
根据数据的统计分析,如图1和表1所有菌株对头孢他啶,头孢曲松钠,厄他培南,aztreonam。87.5%的14株耐哌拉西林。药物敏感性测试的结果表明,所有菌株都耐头孢他啶,头孢曲松钠,厄他培南,atranan。
根据统计分析的数据,如图2和表2MLST显示5特拉k .肺炎和4种不同的类型。序列类型的kpn6099和kpn6617是相同的。
根据统计分析,如图3,kpn6617抵抗β-lactamases和碳青霉烯,但对环丙沙星敏感,多粘菌素,tigecycline。的敏感性大肠杆菌J53 aztreonam和tigecycline高于kpn6617。大肠杆菌J53更敏感,这两种抗生素,MIC值分别为0.5和0.25μ分别g / ml。此外,的敏感性大肠杆菌J53 kpn6617碳青霉烯略高于。
根据统计分析的数据,如图4和表3,电脑是一个积极的控制和数控是负的控制。判断标准是稀释值对应于OD450值大于两倍的数控,抗体效价超过0.25。因此,抗体的ELISA效价1:40,000,acrB抗体成功做好准备。
3.4。分析和讨论
肠杆菌科,如大肠杆菌,克雷伯氏菌和肠杆菌科细菌正常的殖民和常见的机会性病原体。的电阻大肠杆菌受精卵meropenem较高,这可能是由于在受精卵更耐药基因的副本。Kpc-2, IMPl-4和ndm - 1耐多药甚至全部耐药,对碳青霉烯耐药,但对广谱内酰胺敏感。哌拉西林的麦克风和哌拉西林/ tazobactam IMP4生产转移受精卵是非常低的,而atrananine很低。EDTA可以显著减少碳青霉烯的麦克风,这与金属己内酰胺酶的特点是一致的。主动流出导致耐药性:微生物耐药性的药物流出是一个重要的机制,由药物外排泵完成(主动流出系统)。更准确地说,鼻中隔黏膜下切除术后R家族有四个膜运输区域:/ QAC (沙门氏菌),qacE (克雷伯氏菌天然气生产基因),埃姆雷(大肠杆菌)。这个家庭有低聚物的功能的一些蛋白质。研发系列通常用作三个喷射系统的结合,它比飞机系统直接进入边缘等离子体。大肠杆菌肢端,acrB tolcemra。TolC、MEXA mexb OprM三喷射系统,acrB和mexb RND转运蛋白,肢端和MEXA MFPs TolC和OprM OMFs。其中,MF, RND家庭使用电化学氢离子跨膜梯度作为驱动力,ABC家庭使用ATP作为能量来源。LmrA (Lactococcus lactis和同行沙门氏菌)转运蛋白的伴侣的家庭。规范是这个家庭的一部分。规范相关活动流出的Na+。排毒解毒过程系统可能是一种细胞外的过程。耐药的大肠杆菌可以是固有的或通过基因突变和基因转移。
因为ESBLs产生细菌耐药性有多个,它们通常由质粒介导。从一个细菌耐药性可以转移到另一个,甚至不同菌株之间。ESBLs的流行的危险因素有:应用动脉导管或中央静脉导管插入术,近期手术,尤其是急性腹部手术、胃和十二指肠插管、停留时间,特别是在ICU病房,出生体重低于正常,使用抗生素,先前的家庭护理、疾病严重程度、插管、和辅助呼吸。产ESBL菌通常是抵抗多种抗生素,包括第三代头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖甙类。喹诺酮耐药基因通常是位于染色体。喹诺酮类耐药基因和ESBLs编码基因可以位于同一转移质粒。同时,经常ESBLs产生细菌的质粒携带氯霉素,磺胺类药、四环素、和氨基糖苷类抗性基因。产ESBLs细菌的耐药性相关质粒携带多个耐药基因,ESBLs基因型,固有的细菌的耐药机制。它严重影响临床抗感染治疗通过染色体变化或耐药质粒、转座子的转移。
4所示。结论
(1)Kpn6617抵抗β-lactamases和碳青霉烯,但对环丙沙星敏感,多粘菌素,tigecycline。的敏感性大肠杆菌J53 aztreonam和tigecycline高于kpn6617。(2)Plasmid-mediated删除IMP-1金属-β内酰胺酶绑定外膜蛋白是一种抗生素敏感性的降低的主要原因。(3)外膜孔蛋白的损失也是一个常见的细菌耐药性的机制。与单一抗生素疗法相比,联合治疗多种抗生素有更明显的效果,可以延缓抗药性的产生。
数据可用性
数据支持本文的研究可从通讯作者或第一作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由北京中医药管理局,总体规划项目北京中医药科技发展基金项目,jj - 2020 - 74,临床研究的“变暖肺和消除血瘀公式在改善患者咳痰困难老年人卧床不起神性的肺炎”。