文摘
背景。透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是一种恶性肿瘤发病率和死亡率高。作为Nudix水解酶家族的一员,Nudix(核苷diphosphate-linked一半X)类型主题1 (NUDT1)与癌症的发生和发展密切相关。我们的研究旨在探索在ccRCC NUDT1的作用及其与免疫的关系渗透。方法。NUDT1表达矩阵和相应的临床信息获得癌症基因组图谱(TCGA)数据库。的表达差异NUDT1 ccRCC及其与临床特征的关系进行了使用R软件。kaplan meier (km)分析、单变量Cox回归分析、多变量Cox回归,接受者操作特征(ROC)曲线,计算图表是用来评估患者的生存及预后。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)是用来探索差异基因的功能在低收入或高表达组NUDT1。TCGA数据集和肿瘤免疫评估资源(计时器)数据库被用来探索NUDT1和免疫渗透之间的关系。最后,TCGA数据集用于基因集富集分析(GSEA)。结果。NUDT1不仅是过表达与临床病理的特性(ccRCC也显著相关 )。km生存分析显示,调节NUDT1密切相关的减少总生存期(OS)和无进展生存(PFS) ccRCC病人。多变量Cox回归显示,NUDT1是一个独立的预后指标(HR = 1.437, 95% CI: 1.065—-1.939, )。ROC曲线表明,NUDT1一定精度预测ccRCC病人的结果。此外,共有150 coexpressed基因和1886个差异表达基因(度)。去/ KEGG GSEA结果表明,NUDT1及其度参与的几种途径。NUDT1表达呈正相关,浸润程度的调节性T细胞亚群),CD8+T细胞,滤泡辅助T细胞和M0巨噬细胞。此外,NUDT1呈正相关免疫检查点,如PD-1 LAG3, CTLA4,和CD70 ccRCC。结论。NUDT1预后起着关键作用,免疫细胞的渗透ccRCC病人,表明其潜力作为预后的生物标志物和治疗的目标。
1。介绍
肾细胞癌(RCC)是第三个泌尿癌症,占所有癌症的3%女性和5%男性,全世界约有400000例(1]。透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是最常见的病理类型的碾压混凝土,占超过70%的成人患者(2,3]。ccRCC不是容易受到化疗;目前抗肿瘤治疗方案主要包括部分或彻底切除,局部消融,靶向治疗,免疫治疗(4,5]。大约25%的-30% ccRCC病人转移性疾病之间的最初的表示和肾切除术后局部复发的疾病(20%和40%6]。虽然癌症发生和发展的机制进行了广泛的研究,考虑到ccRCC发病率和死亡率高,有必要探索分子签名与ccRCC患者的预后价值。
Nudix(核苷diphosphate-linked一半X)类型的主题1 (NUDT1),也被称为杂种狗人同族体1 (MTH1),由NUDT1基因编码的一种酶,这种酶在人类7]。据报道,NUDT1在各种癌症,包括膀胱肿瘤、乳腺癌、结肠癌、和肾脏(8,9]。NUDT1过度可能对癌细胞有一系列的保护作用的水解8-oxo-dGTP或其他氧化核苷酸由内源性活性氧升高(ROS)或治疗导致活性氧,导致恶性表型,预后不良,耐药性的癌症患者(10]。一项研究表明,过度的NUDT1密切相关病人的病历和临床病理的特点在口腔鳞状细胞癌(11]。此外,在肿瘤组织高表达的NUDT1将导致更糟糕的总生存期(OS)和无进展生存(PFS)的结直肠癌患者12]。
本研究旨在调查NUDT1的表达之间的关系和碾压混凝土的临床病理特征和预后。此外,我们还探讨了机制的NUDT1 ccRCC及其与免疫的关系渗透。
2。材料和方法
2.1。数据源
RNA-seq ccRCC样本的统计数据和相应的临床特征信息和相邻的肿瘤样本从官方网站获得的癌症基因组图谱(TCGA) (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)。入选标准设定如下:(1)患者诊断为ccRCC;(2)患者完整的mRNA数据和临床信息。根据入选标准,我们的研究排除了任何样本数据缺失或不足的年级,TNM阶段,远处转移、淋巴结转移。RNA序列数据整理和转换成”的象征。txt”数据进行后续分析。以来的所有数据在这个研究是公开的,没有必要的伦理委员会批准。
2.2。NUDT1基因表达分析
肿瘤免疫评估资源(时间)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一个综合资源系统分析免疫浸润跨不同癌症类型,其中包括10897个样本TCGA的32个癌症数据库(13]。我们首先分析了NUDT1 Pan-cancer通过基因的表达水平模块。随后,TCGA-Kidney透明细胞癌(KIRC)队列进行了分析通过使用R软件limma包探索的表达差异NUDT1 ccRCC组和对照组之间,以及ccRCC样本之间的表达差异和邻近组织的配对样本。此外,我们也评估NUDT1表达式的基础上在ccRCC样本TCGA多个临床病理的特性。箱线图使用疾病状态变量画NUDT1计算微分表达式,最后,R软件ggpubr包用于可视化结果。
3所示。RNA提取和定量实时PCR
切除组织立即被存储在液氮中。总RNA提取使用试剂盒试剂(热费希尔科学、美国)的10个肿瘤和paracarcinoma正常配对样本。互补脱氧核糖核酸库获得使用Servicebio®RT合成第一链cDNA工具包(Servicebio,武汉,中国)。执行中存在使用SYBR绿色qPCR大师混合(Servicebio,武汉,中国)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被设置为基因量化内部控制。每一个基因的表达水平检测至少三次。以下引物被使用:GAPDH向前5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′和反向5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′;NUDT1向前5′-CAGATCGTGTTTGAGTTCGTGG-3′和反向5′-AAGCAGGAGTGGAAACCAGTAG-3′。相对量化计算 。
3.1。预后分析
kaplan meier (km)生存分析之间的关系进行分析的表达NUDT1生存的日子ccRCC病人。NUDT1 mRNA的表达水平ccRCC被分类为低或高表达组中值显示值。我们使用survminer R包分析操作系统和PFS ccRCC低收入或高表达组。接受者操作特征(ROC)曲线是用来评估km生存分析的准确性。单变量Cox回归和多变量Cox回归用来评估ccRCC患者的独立预后因素。诺模图是用来预测患者的生存。最后,我们使用校准曲线对诺模图的预测能力进行评估。
3.2。基因Coexpressed和差异表达基因分析
R软件被用来屏幕NUDT1的coexpressed基因集相关系数的平方|R2| > 0.6, 作为筛选条件。顶级的基因被R软件可视化circlize包。差异表达基因(度)被分为低收入和高表达组根据NUDT1的表达和| logFC | > 1,错误发现率(罗斯福)< 0.05被认为是重要度,调节或下调100强度被pheatmap可视化包R软件。基因本体论()函数和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路富集分析度是由R软件clusterProfiler包,和视觉分析的数据是由ggplot2软件包。
3.3。免疫相关分析
基于TCGA-KIRC队列,我们探索免疫浸润NUDT1和癌症之间的关系在mRNA水平。CIBERSORT,纽曼等人开发的一种分析工具。14),可以量化浸润免疫细胞分数基于标准化的基因表达谱。我们计算22免疫细胞亚型的免疫渗透分数CIBERSORT算法探索NUDT1之间的相关性和免疫细胞的渗透。然后,我们分析了在ccRCC NUDT1和免疫分子检查点之间的相关性。最后,我们验证了我们的分析通过定时器的“相关性”模块的数据库。
3.4。基因集富集分析
GSEA是一个计算方法,确定之前定义的一组基因已经整合和重要的生物统计的差异两个州(15]。深入理解NUDT1的功能,我们执行GSEA NUDT1的高和低表达的数据集使用R clusterProfiler包”。“使用GSEA,我们分析了术语和KEGG途径调查可能的NUDT1生物功能。相关基因通路选择根据罗斯福< 0.25和截断标准 ,和五个相关功能基因组是可视化。
3.5。统计分析
R (v.4.2.0)被用来执行统计分析。ccRCC NUDT1对预后的影响的评估使用km和Cox回归分析。ROC曲线是用来评估km生存分析的准确性。斯皮尔曼的分析被用来探索NUDT1表达之间的相关性和免疫细胞渗透水平。所有P价值观是双尾, 被认为是具有统计学意义。的强度P值定义如下: , ,和 。
4所示。结果
4.1。的表达NUDT1调节肿瘤样本
我们第一次评估NUDT1表达Pan-cancer数据从数据库定时器;结果表明,NUDT1的表达是调节在18个肿瘤,包括BCLA BRCA,胆固醇,COAD,光电子能谱,HNSC, KICH, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, LUSC,马,阅读,SKCM, STAD THCA, UCEC(图1(一))。此外,分析TCGA-KIRC队列显示NUDT1 ccRCC样本中高度表达与正常样本( ,图1 (b))。在配对标本,NUDT1 ccRCC组的表达显著高于邻近正常组织( ,图1 (c))。最后,NUDT1表达式ccRCC组织之间的差异及其邻近正常组织被存在验证( ,图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4.2。NUDT1 ccRCC的临床特征密切相关
为了进一步探索之间的关系的表达NUDT1 ccRCC的临床病理学特征,我们提取和整理从TCGA-KIRC组患者的临床病理学特征(表1);性别、年龄、年级、临床阶段,和T阶段,包括N阶段,和M阶段。结果表明,除了年龄(图2(一个)),调节NUDT1表达与性别相关显著(图2 (b)),年级(图2 (c)(图),临床阶段2 (d)(图)和T阶段2 (e)(图),N阶段2 (f)(图),和M阶段2 (g))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4.3。高NUDT1表达式与在ccRCC不良预后相关
我们进一步评估的价值NUDT1 ccRCC患者的预后;km生存分析显示,操作系统在高NUDT1表达式组短于NUDT1低表达组(图3(一个))。同时,NUDT1是负相关的表达与患者的PFS ccRCC(图3 (b))。如图3 (c)ROC曲线表明,曲线下的面积(AUC)对应于1,3,5年是0.671,0.650,和0.616,分别。一般来说,一个AUC从0.6到0.9被认为是可靠的。
(一)
(b)
(c)
然后我们用Cox回归分析评估ccRCC生存的独立预后因素。单变量分析的相关使用Cox回归显示,NUDT1 ccRCC患者的预后显著相关(HR = 1.908, 95%置信区间CI: 1.477 - -2.465, ,图4(一),补充1)。此外,年龄、年级和舞台也明显影响患者的预后。我们注册的重要因素单变量Cox回归分析多变量Cox回归分析;结果表明,NUDT1仍是一个独立的预后因子(HR = 1.437, 95%置信区间CI: 1.065 - -1.939, ,图4 (b)、表2)。最后,我们构建了计算图表包含NUDT1和临床特征来预测患者的生存ccRCC(图4 (c))。诺模图,我们可以计算出总分根据每个临床特点的分数,和更高的总分被认为是糟糕的病人的预后。操作系统校准图表1、3和5年表明列线图的预测效果是令人满意的(图4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4.4。分析基因Coexpressed和度ccRCC NUDT1
我们分析了NUDT1 mRNA的表达数据文件与NUDT1探索coexpressed基因。根据我们的预设标准,我们发现150年与NUDT1 coexpressed基因(补充2)。如圆环图(图所示5(一个)),NUDT1表达水平的表达呈正相关,BCL2L12, POLR2J, PPP1R14B, SNRPD2 PSMG3, POP7。相反,NUDT1表达水平是负相关的表达LIFR, PRKAA2, WDFY3 MYO6, FBXO3。然后我们进行微分表达式分析NUDT1找到度高和低表达组NUDT1。1886度了,我们使用的热图形象化的前100个基因显著调节或表达下调(补充3,图5 (b))。根据表达式的热图,我们直观地观察到度的上半部分是在高表达组和低度是在低表达组的一部分。
(一)
(b)
随后,我们执行这些度函数和KEGG通路富集分析。根据筛选标准,有171个生物过程(GO-BP), 29日电池组件(GO-CC), 65个分子功能(GO-MF)和13 KEGG(图6(一),补充4和5)。去功能注释表明度主要富集在体液免疫应答,免疫球蛋白复杂,受体配体活动(数据6 (b)和6 (c))。KEGG路径分析表明,这些基因在中的刺激神经组织的互动,丰富cytokine-cytokine受体相互作用,蛋白质消化吸收途径(数字6 (d)和6 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4.5。NUDT1表达与免疫渗透和免疫检查点
相关研究已经证明,肿瘤浸润淋巴细胞OS和前哨淋巴结状态的独立预测因子在癌症患者(16,17]。因此,我们试图探索的表达是否NUDT1 ccRCC免疫细胞浸润有关。我们分析了22个免疫细胞亚型的表达差异在高和低表达组NUDT1(图7(一),补充6)。值得注意的是,NUDT1积极表达,明显与调节性T细胞的浸润水平(亚),CD8+T细胞,滤泡辅助T细胞和M0巨噬细胞,但消极与M1巨噬细胞的浸润程度,M2巨噬细胞,肥大细胞,休息休息CD4记忆+T细胞,单核细胞在ccRCC(图7 (b)- - - - - -7 (j))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
我们下一个探索NUDT1表达水平和免疫之间的关系通过TCGA-KIRC检查点队列。结果如图所示8(一个),(补充7)。NUDT1表达水平与免疫检查站如PD-1呈正相关,LAG3, CTLA4, CD70, LGALS9, TMIGD2和小鼠。LAG3,到目前为止,PD-1 CTLA4,和CD70一直被认为是免疫检查点强烈相关的免疫疗法,我们验证了NUDT1的表达水平之间的相关性和这四个免疫检查点通过定时器数据库。结果表明,NUDT1仍与PD-1呈正相关(软木= 0.236, ),LAG3(软木= 0.269, ),CTLA4(软木= 0.106, ),和CD70(软木= 0.269, )(图8 (b))。我们的研究结果表明,检查点相关免疫抑制剂的治疗可能有助于改善患者的预后NUDT1高表达组。
(一)
(b)
4.6。基因集富集分析
为了进一步认识NUDT1的势函数,我们使用GSEA调查的潜在信号通路NUDT1可能影响ccRCC进展。在去分析,我们发现,一些相关的几种生物过程和细胞成分主要是丰富NUDT1的高表达组(图9(一个))。补体的激活、体液免疫反应或体液免疫反应介导循环immunoglobin,角质化,包括免疫球蛋白复杂。KEGG富集分析表明,一些metabolic-related途径明显丰富低表达组,如propanoate新陈代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环(三羧酸(TCA)周期),和赖氨酸退化(图9 (b)、表3)。有趣的是,我们还发现,与嗅觉相关的通路转导明显丰富高表达组。
(一)
(b)
5。讨论
碾压混凝土是一种最常出现类型的泌尿癌症和近年来,其发病率持续增加(18]。最常见的组织学类型的碾压混凝土是透明细胞型(70% - -90%),其次是乳头状(10% - -15%)和chromophobe信用社(3% - -5%)2]。目前,部分或肾脏切除术仍是主要治疗早期ccRCC [19]。癌症研究的深化、靶向治疗和免疫治疗治疗ccRCC脱颖而出,尤其是作为一个当前和新兴的一线治疗转移性ccRCC [20.]。应用免疫疗法的基础在ccRCC ccRCC的肿瘤微环境(时差)广泛的免疫渗透的特点,高度血管化和纤维化与其他实体肿瘤(21]。尽管ccRCC的诊断和治疗策略有明显改善在过去的几十年中,针对这一事实早期ccRCC的临床症状不明显,而先进ccRCC常常伴有远处转移,和患者的预后ccRCC依然贫穷(22,23]。基因表达异常可能参与肿瘤发生和与患者的预后相关(24]。因此,新生物标志物的探索有利于早期筛查、诊断和治疗ccRCC。
作为Nudix水解酶家族的一员,NUDT1长8924个基点,位于染色体7 GRCh38(2242222 - 2251145年。人类基因组p7-build) [25]。发现NUDT1首先引起致癌作用的兴趣调查人员由于其角色在维持基因组稳定,通常妥协在癌症发展。NUDT1能够水解氧化核苷酸和国家结核控制规划,比如8-oxo-dGTP 2-OH-dATP,一磷酸形式和防止并入细胞核和线粒体DNA,从而限制了ROS-induced细胞损伤(26,27]。它表明NUDT1扮演不可或缺的角色在幸存的癌症细胞的氧化应激。然而,NUDT1可能不会总是不可或缺的癌症细胞在氧化条件下生存。一些研究人员发现,NUDT1不足在某些癌症细胞系由小RNA干扰或基因组编辑不会导致任何不利影响这些细胞(28,29日]。因此,更多的研究是必要的探索NUDT1如何影响肿瘤形成的发生和发展。
在我们目前的研究中,我们探索的表达NUDT1作为ccRCC预后的生物标志物。我们系统地分析了NUDT1 ccRCC患者的预后意义。先前的研究表明,NUDT1表达与临床病理的相关性特性,血管侵犯程度,操作系统,和无病生存期(DFS)在肝细胞癌(HCC)患者(30.]。我们使用TCGA ccRCC病人获得数据来评估NUDT1的预后价值。我们的研究表明,的表达NUDT1 ccRCC的预后有关。ccRCC NUDT1显著调节的表达,与不良临床病理的特性,比如性别、T台,N阶段,阶段,临床分期,病理等级。km曲线揭示高NUDT1表达水平与短操作系统和PFS ccRCC患者。Cox比例风险回归模型表明NUDT1表达ccRCC的肿瘤细胞是一个独立的预后指标。coexpression分析中,我们发现一些基因与NUDT1表达呈正相关,如BCL2L12 POLR2J, PPP1R14B, SNRPD2 PSMG3, POP7。BCL2L12 antiapoptosis因素,发现和克隆2001年BCL2家族中的一员。BCL2L12 mRNA表达的预后意义已经评估了在多种癌症类型(31日,32]。BCL2L12发生过程中起着重要的作用,中和效应半胱天冬酶活动的下游线粒体功能障碍和apoptosome活动抑制细胞凋亡(33]。POLR2J是人类的亚基核RNA聚合酶II (34]。通过生物信息学分析,王等人发现,POLR2J DNA修复基因,可能与预后不良相关葡萄膜黑色素瘤(嗯)患者(35]。一项研究表明,PPP1R14B神经胶质瘤中高度表达,导致坏结果对患者(36]。据报道,SNRPD2在肝细胞癌中与相邻正常组织相比,SNRPD2明显的表达水平与肝细胞癌的病理阶段(37]。伴护蛋白质,PSGM3会影响蛋白质的稳定性通过帮助蛋白酶体的组装。马等人的研究结果表明,之间的交互红孢子虫属phagocytophilum美国物理治疗协会和PSMG3影响蛋白酶体活性和泛素化过程,激活了ubiquitin-proteasome系统(UPS)通路,然后夫妻自噬通路,导致美国物理治疗协会的凋亡效应(38]。最近的一项研究表明,POP7能促进乳腺癌的进展通过调节的稳定性和表达ILF3 mRNA (39]。此外,和KEGG功能富集分析1886度显著相关NUDT1证明相关的度主要是体液免疫应答,免疫球蛋白复杂,受体配体活动。KEGG路径分析表明,度主要是相关中的刺激神经组织的互动,cytokine-cytokine受体相互作用,蛋白质消化吸收途径。
本研究的另一个重要方面是,NUDT1表达式与不同免疫ccRCC渗透水平。我们的研究结果表明,之间有显著的正相关性NUDT1表达水平和渗透的亚细胞水平,CD8+T细胞,滤泡辅助T细胞和M0巨噬细胞。同时,NUDT1是负面的表达水平与M1巨噬细胞的浸润程度,M2巨噬细胞,肥大细胞,休息休息CD4记忆+在ccRCC T细胞和单核细胞。以前的研究已经表明Treg细胞免疫抑制T细胞,可通过抑制CD8抑制抗肿瘤免疫反应+T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞),B细胞和抗原递呈细胞(APC) (40]。在各种癌症,包括黑色素瘤,高层Treg细胞浸润与肿瘤复发、进展、转移(41]。根据我们的分析,upregulation NUDT1 Treg细胞的高表达组可能是一个重要因素导致不良OS ccRCC患者。此外,一些研究表明,免疫渗滤时间的减少,尤其是CD4细胞+T细胞和巨噬细胞M1,可能导致癌症患者的不良预后[42,43]。基于免疫分析的渗透,我们推断出相关的高表达组NUDT1减少渗透的单核细胞和巨噬细胞M1,导致ccRCC患者的不良结果。此外,NUDT1表达之间的相关性和免疫标记涉及角色的检查站NUDT1 ccRCC在调节肿瘤免疫学。这些小说在识别研究取得长足发展的重要作用ccRCC免疫渗透。总的来说,在目前的研究中,我们观察到的超表达NUDT1显然ccRCC患者的不良预后有关。此外,我们发现NUDT1表达了积极的与免疫浸润和免疫检查点。这些结果表明,NUDT1起着至关重要的作用在ccRCC免疫渗透和免疫逃避,在先前的研究尚未报道。
6。结论
NUDT1预后起着关键作用,免疫细胞的渗透ccRCC病人,表明其潜力作为预后的生物标志物和治疗的目标。
缩写
| 碾压混凝土: | 肾细胞癌 |
| ccRCC: | 透明细胞肾细胞癌 |
| NUDT1: | Nudix(核苷diphosphate-linked一半X)类型主题1 |
| 操作系统: | 总生存期 |
| PFS: | 无进展生存 |
| 度: | 差异表达基因 |
| ROC曲线: | 接受者操作特性曲线 |
| AUC: | 曲线下的面积 |
| 走: | 基因本体论 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| GSEA: | 基因集富集分析 |
| 存在: | 定量实时PCR。 |
数据可用性
数据集支持本文的结论包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Yongshuai林写和编辑的手稿。发财张参与本研究的设计和讨论。Yinling金和Quliang中获得数据并进行统计分析。刘胖子谭和晋阳证实所有的原始数据的真实性。挚萍吴回顾和修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
张Yongshuai林和发财的贡献同样这项工作,应该列为co-first作者。
资金
这项工作是支持的科技计划贵州省(没有的基本项目。ZK [2022] 446)。
补充材料
补充1。单变量的多变量Cox回归分析NUDT1和患者预后的临床特点。
补充2。与NUDT1 coexpression基因的列表。
补充3。与NUDT1相关的差异表达基因。
补充4。去浓缩度的分析。
补充5。KEGG浓缩度的分析。
补充6。22免疫细胞亚型之间的相关性和NUDT1表达水平。
补充7。免疫检查点和NUDT1表达水平之间的相关性。