细胞的殖民能力商业化大型多孔肺泡脚手架

文摘

使用填充生物材料或组织工程大骨头implant-coupling生物相容性材料和人类骨髓间充质基质细胞似乎是一种很有前途的方法来治疗批评-大小的骨缺损。然而,细胞播种到到大型多孔支架仍是一个挑战,因为这过程高度依赖于多孔微结构。事实上,细胞可能主要是殖民的外围脚手架,离开它的体积几乎免费的细胞。在这项研究中,我们进行在体外研究分析的能力商业化脚手架在活的有机体内殖民的细胞。我们调查的影响,各种物理参数的播种效率灌注播种协议使用大型制造骨替代品。目前的研究表明,灌注液的速度和初始细胞密度似乎影响播种的结果和对细胞生存能力产生负面影响,而液体灌注的持续时间和流(稳定和脉冲)的性质没有任何影响种子细胞的分数或细胞生存能力。然而,细胞重新分区后播种依然高度异构。

1。介绍

批评-大小的骨缺损,如萎缩性骨不愈合的一部分,需要特定的治疗协议重新启动愈合过程和恢复受伤的骨头的机械连续性[1]。尽管最近的进展,可用的治疗仍不令人满意,因为它们涉及长几个月的固定和多次手术,并不能保证完全康复,并且常常与重要的相关副作用(2- - - - - -4]。防止风险固有的骨移植(施主能级的感染并发症,自体和同种异体排斥),新的合成生物相容性支架开发填补骨缺损和骨重建提供机械支持。目前这些填充材料用于小骨缺损重建。然而,对于大型的植入物,这种支架的细胞殖民仍然具有挑战性的原位,由于缺乏化学因素和既存的细胞通常启动外部细胞的迁移对病变的中心网站(1,5]。在这个配置中,骨重建不能发生在脚手架的体积,导致其逐渐减弱,然后60%的骨折这样的植入物或移植后10年6]。

的可用性可以使支架的生物相容性均匀殖民细胞似乎因此发展的一个关键参数两种治疗协议专门批评-大小的骨骼的效果:(i)填充缺陷与生物相容性材料和(2)的控制在体外植入组织工程的发展,耦合可以使支架的生物相容性和细胞和生化因素,这将被植入病变网站(7]。

1.1。填充生物材料

解决自体和异体的缺点,世界各地的企业都在开发的合成材料,最广泛应用于骨缺损的治疗是钙磷酸盐、硫酸盐、钙和羟磷灰石(8]。这些骨移植替代物可以贴,骨料,或多孔块,提供综合分析脚手架上的新骨生长。他们还可以作为论述的车辆和成骨的物质。

1.2。策划组织植入物

这个替代方法,尽管技术上具有挑战性,将确保缺陷的填充与活组织能够产生所需的生化因素启动愈合过程。

在这一前景,一些研究已经进行了在过去的几年中,提高组织工程的细胞播种和文化osteoarticular植入(cf表1)。他们通常涉及间充质基质细胞和/或细胞的成骨细胞的chondrocytic血统,播种在多孔可以使支架的生物相容性。

尽管这些研究中使用的生物材料的化学成分会有很大不同,两种类型的支架可用等中型支架与孔隙度(高度≤5毫米)≤80%,大的和高度多孔的孔隙度在90%以上。第一类节目的支架volumic殖民差,导致异构组织发展过程中在体外文化阶段(9- - - - - -12]。另一方面,第二种类型的支架似乎更容易殖民但机械性能差13- - - - - -16]。

1.3。本研究的目标

在本文中,我们的目标是分析,由于一个在体外研究中,一个商业化的脚手架的能力在活的有机体内被细胞。使用控制流体流动模拟生理在活的有机体内条件,我们研究一个商业化的大的牙槽骨支架的殖民效率间充质基质细胞,治疗过程中有重要的作用。我们因此模仿在活的有机体内细胞的殖民在体外细胞播种。我们的工作仅限于早期的细胞支架的播种,也就是说体积内的沉积的细胞由于射流刺激。这里的想法是检查灌注条件下如何修改细胞平流与流体之间的竞争和细胞黏附在支架表面。在这个阶段,脚手架微体系结构起着非常重要的作用。下列播种过程,包括细胞迁移是超出了我们的范围分析,因为它往往是引发由于化学引诱物生物分子中添加的播种。

注意,本研究也将给迹象可能优化细胞的体积内的易散发的运输支架进行便捷的立体的播种前培养一个植入。本研究因此限制分析的直接细胞播种指定商业使用脚手架通过不同液体灌注协议。因此,我们的目标是只检查支架体积内的可能性进行细胞由于易散发的流。每个实验,而短(2 - 3小时)的必要性,以确保氧化是没有用的。这项工作将自然的角度改善这个设置分析fluid-stimulated细胞培养支架在更大的时间尺度。事实上,它在培养表明,骨间充质基质细胞可以调节支架和灌注属性(17]。实际上,流体的特殊作用刺激对细胞迁移和扩张(18,19),在细胞转导20.,21),或对最终植入质量(22被投入救灾。

因为我们打算在大型生物材料的实际应用提供可靠的参数在医疗应用程序中,我们选择了一个βtcp CERAVER公司高度多孔支架。这个脚手架已经用于临床骨缺损修复(23]。它应该提供一个完全连接的肺泡细胞结构,可以播种在活的有机体内条件。我们的目标是分析支架微结构影响播种能力,经常在临床应用程序相关的生物分子并不认为在这项研究中。

我们的实验分析了其灵感来自经典的单向灌流播种设备。圆柱形支架设置在一个流室的细胞注入。然后,使用蠕动泵,应用于不同的机械刺激细胞。特别是,我们专注于五参数流体注入细胞的数目N_细胞灌注率V_fl,细胞沉降时间T_p,流体的性质(稳定或脉冲)和灌注时间t_fl。这些参数的影响和相关的机械刺激了细胞在支架的播种种子细胞的数量分析,评估他们的定位支架内,他们的生存能力。

2。材料和方法

2.1。细胞的选择和准备

人类间充质基质细胞(hMSC)获得一个独特的骨髓样品采购的Etablissement法语du唱,友谊医院亨利蒙多(完成、法国),和扩展αMEM (Gibco®,生活技术)补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco,生活技术)和1% penicillin-streptomycin (100 x, Gibco,生活技术)。培养基是改变了每周两次。对于播种测试,与PBS细胞被洗,收获用0.05%胰蛋白酶EDTA (Gibco,生活技术),悬浮在新鲜培养基的密度10⁹细胞/ 600毫升。

2.2。支架

肺泡陶瓷圆柱体(10毫米厚,直径8毫米,100%βtcp,孔隙度75%,孔隙半径~ 400μ半径~ 100 m,连接μ米)被CERAVER公司采购。这些支架已经用于骨缺损的填充。实验前24小时,他们被放置在一个保护硅管(见图1C)和综合在αMEM (Gibco,生活技术)。

2.3。测试协议

测试的当天,支架被放置在一个专门设计的流室的中心,确保流体完全穿过支架以及其主要方向(见图1)。这个室是饱和培养基和连接到一个蠕动泵。

细胞(N_细胞)慢慢注入饱和室上方的支架(见图1针,B)使用0.6毫米(NOELUS,作秀的成分)和被允许沉积物不同T_p。泵被激活,以确保所需的和持续的流体通过支架。注意周围的硅管支架避免任何泄漏室附近的墙壁,迫使流穿过多孔结构。最后,系统被允许休息至少150分钟的时间,以确保种子细胞开始坚持脚手架。自我们的分析仅限于检查支架体积内的可能性进行细胞由于易散发的流动和不遵守移民,每个实验仍然是相当短的必要性,以确保氧化是无用的。

2.4。研究了参数

进行了实验测试不同5物理参数(如表所示2):灌注率V_fl,最初的细胞数量N_细胞,沉降时间T_p,流体的性质(稳定或脉冲)和灌注的距离d_fl= V_fl×t_fl,在那里t_fl是控制灌注的持续时间。当没有指定在一个给定的测试中,参数值设置为参考价值(表中粗体显示)。这些引用值选择根据他们的能力来表示在活的有机体内条件和以前开发的播种协议。

2.5。种子细胞记数

种子细胞的数量是评价适应开发的协议(24]。PBS是慢慢注入下面样品收集的培养基饱和,部分室。示例是用4种不同的解决方案的不断灌注率5.77×10⁻⁴m / s收集种子细胞。首先,PBS灌注了15分钟,其次是0.5%质量I型胶原酶(c - 0130,σ®)30分钟和0.05%胰蛋白酶EDTA 10分钟。最后,PBS再次申请20分钟。细胞包含在每个收集解决方案然后计算使用0.2%台盼蓝解决方案(Milerium VWR)来评估他们的生存能力。

2.6。数据分析

方差分析(方差分析)技术被用来研究的重要性的影响的五个灌注参数表2在细胞生存能力率和种子细胞的数量。请注意,对于每个研究灌注参数,每个实验复制(~ 3 - 5倍)有一个方便的统计表示结果。

2.7。组织学

对于每个灌注情况,样本从流中提取室并通过连续9浴室各种乙醇脱水的解决方案(70%、80%、90%、95%和100%(三次)),用二甲苯两次。然后他们被包含在聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)矩阵和削减他们的主方向每样削减(8)。然后,显微镜观察进行分析细胞内分布的多孔结构。

3所示。结果

3.1。初始细胞数量和性质的流动

第一组测试侧重于最初的细胞数量的影响N_细胞和流的性质播种的结果。在图2,我们比较三种不同初始细胞密度(样本(b)通过(d))提交稳定流体(V_fl= 9.7×10⁻⁴米/秒,T_p= 30分钟,d_fl= 1.8厘米)或者表中描述一个脉冲3。

因此,样品提交的总距离灌注到脉冲流是1.8厘米,平均流体速度V_fl9.7×10⁻⁴m / s。我们也意识到一个静态测试(样品(a))作为比较工具已经在先前发表的一项研究[校准25),使用相同的协议没有激活蠕动泵。

根据图2,这是第一次注意到,80%的注射细胞支架上播种与静态协议,而这个速度低于40%的流体流动时,无论初始细胞密度N_细胞。此外,对样本(a),只有很小一部分的初始细胞收集以下样品。另一方面,当应用控制液体灌注,很大一部分注入细胞穿过整个支架,这是鼓励实现volumic细胞殖民。

播种后细胞生存能力率较低的流体流动时相比静态协议。这与最初的细胞数量增加生存能力下降N_细胞,尽管这一趋势并不显著。此外,结果的变化似乎更重要的是在高初始细胞密度(样本(c)和(d))。这两个值的N_细胞也与缺少一部分播种后的初始细胞测试。我们假设在整个过程中缺失的细胞被破坏,可能因此被视为额外的死细胞位于流体。

最后,改变流动的性质似乎并没有任何对细胞生存的影响率(样本(c)和(d))。因此,另一组实验进行了使用一个稳定的流体流动。在播种的早期阶段,流体的作用似乎因此主要细胞,直到他们穿过支架表面。注意,流动的类型(脉冲)是已知有强大的影响力在以下文化阶段(26]。

3.2。沉降时间

当他们进入流动室,注入的细胞已经经历了各种物理和化学应力(酶的操作、离心操作在室温下,和注射)。我们建议之间的沉降时间注入和液体灌注的开始可以限制这种压力积累,让细胞通过脚手架前休息。测试的结果进行不同参数T_p,保持其他参数的参考价值,展示在表2。

在种子细胞的数量没有变化(图3(一个)(图)和可行性率3 (b))观察。因此,这个参数不影响易散发的播种过程。

3.3。灌注的距离

接下来,我们假设灌注的距离的变化d_fl,通过不同的持续时间t_fl的液体灌注,可强调存在一个最优的灌注时间使得细胞在整个支架没有被收集在下面的液体。此外,通过改变灌注的距离,我们修改的时间机械征集应用于细胞,可引起低可行性率播种后观察到的协议。

结果呈现在图4对应于播种不同灌注距离进行测试d_fl使用两种不同的灌注速度和保持参数N_细胞和T_p引用值(cf。表2)。

没有明显的影响,这个参数可以观察到种子细胞的分数和可行性的考虑范围的灌注速度。这似乎表明,灌注的距离d_fl不会影响播种的结果,可以推测细胞渗透不足支架,将经组织学观察。

3.4。灌注速度

最后,我们进行了一系列的测试不同流体的速度V_fl并保持其他参数的参考价值(cf表2)。这些实验的结果呈现在图5。

种子细胞的分数和细胞生存能力率都降低流体的速度V_fl增加,尽管这一趋势并不显著(主要是由于实验数据的高可变性)。此外,最初的一部分细胞丢失的两个最高的值V_fl。

3.5。组织学观察

播种的组织学分析样品每样例(8片)已经完成对灌注的影响得到定性的信息流动和支架结构在细胞重新分区后,不同播种协议(两个样本/协议)。图6对应的参考案例,大致给出了类似的结果与其他播种条件试验。上面的细胞已经注入上的支架。样品是沾Stevenel蓝色和范Gieson picrofuchsin。使用光学显微镜观察然后进行。

组织学分析表明,灌注状况没有强烈影响多孔结构内的细胞重新分区。这个重新分配由在一个重要的细胞层孔位于上部的脚手架(框如图6)和速降细胞密度低我们进展的脸,宏观领域几乎免费的细胞在支架的底部(箱子F和G图6)。

此外,通过显微镜分析几种多孔样本,我们观察到的重要变化的多孔结构支架(图7),三种不同类型的违规行为:宏观的缺陷(图7 (b))和积累的固体矩阵在脚手架的体积(图7 (c))或沿着它的边缘(红框,图7(一))。

这些违规行为可能产生重大影响的播种的结果,因为他们极大地干扰细胞支架内部的发展。除此之外,它们会导致形成的区域无法进入细胞,并可能强烈影响最后植入物的力学性能。

4所示。讨论

4.1。流的影响播种的结果

根据测试结果,静态协议似乎允许更大比例的注射细胞的播种比动态灌注固定在支架。然而,它已被观察到在先前的研究27,28),当使用一个静态协议时,细胞主要高于样本,留下几乎免费的细胞支架的中心。下面的一小部分初始细胞收集样本倾向于分析证实了这一点。

我们表明,细胞生存能力与灌注水平下降,这表明机械请求应用于细胞导致永久性的损害。因此我们提出不同的不同的物理参数,以确定可能导致的征集等损失。

根据我们的结果,沉降时间T_p、流体征集的类型和灌注的距离d_fl似乎并不负责细胞生存能力低。另一方面,流体速度V_fl似乎有一个负面影响种子细胞的数量和他们的生存能力。这些结果很让人惊讶,考虑到目前的工作中使用的速度被发现在以往的研究没有有害的细胞(29日]。这种差异可能是由于在我们的研究中使用的不同的细胞类型。众所周知,粘附细胞的生存能力与他们的能力,坚持和传播到一个矩阵。在这种情况下,它可能是支架涂分子来源于一种细胞外基质化合物,优化MSC附着力。

4.2。能力弱的细胞穿透骨移植物的体积

似乎很明显,细胞渗透在商业上使用的三维多孔结构牙槽骨移植物仍然有限。对各种灌注参数的调查导致了有限的改进的3 d播种。这表明,当填充骨缺损与这样一个肺泡陶瓷贪污、多孔细胞殖民的体积只有有效地的外围脚手架。因此,当比较细胞殖民与最优机械阻力,使用更少的多孔支架可能会感兴趣的在活的有机体内骨修复应用程序。

这对细胞不能在大型生物材料通过我们的观察结果的核心是一致的与最近发表的研究。事实上,支架与肺泡结构的这种类型的测试通常最多5毫米高(cf表1),支架的细胞渗透很少超过2 - 3毫米。

有可能改善这有限的效率将包括使用生物分子,提高细胞迁移和组织发展。此外,可能使职能化支架提供更多细胞结合位点的研究是另一个有价值的途径。

肺泡结构可能是部分负责这些nonoptimal细胞殖民结果:虽然它提供了一个连接支架孔隙度和足够的力学性能,该结构包括残酷的部分流体域的缩小,导致早期接触细胞和支架之间的墙壁,促进早期细胞粘附。提高细胞渗透在脚手架没有减少它的力学性能,它可能是有趣的优化形状和孔的大小。事实上,(10]表明,使用常规多孔结构导致更均匀的细胞重新分区后播种与肺泡支架相比。此外,使用常规的结构有助于防止机械的重要地方变化请求(特别是和剪切应力)在相关领域,可能导致细胞损害。

最后,多孔域的形状和细胞后的细胞活动都进化播种,在在体外文化阶段。一个优化多孔结构应该考虑这个进化,提高足够的液体灌注在这个发展阶段。

的设置一个在网上研究中占主要的现象控制这些阶段似乎因此有吸引力的解决方案。事实上,它将允许识别结构参数需要优化更快更精确比起单纯的实验方法(29日]。

5。结论

根据目前的研究,评估商业化多孔支架不似乎适合均匀体积细胞殖民。事实上,尽管细胞可以完全通过支架,灌注后的种子细胞率仍低于40%的注射细胞。此外,细胞生存能力迅速降低,即使在灌注速度,已经被证明是无害的细胞在先前的研究28]。此外,组织学观察表明,绝大多数的种子细胞是位于外上的支架(即。,on the first face of the scaffold encountered by the cells), which seems to indicate that the alveolar structure does not promote volumetric penetration into the scaffolds.

这些观察是一致的各种播种的文学研究。事实上,由于播种的局限性,支架具有类似结构很少在深度超过5毫米,远低于临床利益的大小。多孔结构优化促进细胞和化学运输通过支架可能会是一个有前途的方法提高播种和在体外开发满足临床的组织工程骨植入物的大小。

除了进一步实验测试,理解不了这些矛盾的结果,因此它应该有趣的在网上进行研究,揭示了结构关键参数均质细胞促进播种在大型骨支架(30.]。

符号

dfl:	灌注距离:dfl= Vfl×tfl(m)
N细胞:	初始细胞数量(−)
tfl:	时间控制的灌注(s)
Tp:	沉降时间(s)
Vfl:	灌注速度(米/秒)。

缩写

EDTA:	乙二胺四乙酸
的边后卫:	胎牛血清
机会:	羟磷灰石
hMSC:	人类间充质基质细胞
MEM:	最低必要的媒介
PBS:	磷酸缓冲盐
PCL:	聚已酸内酯
PDLLA:	Poly-D, L-lactic酸
计划:	聚乳酸
PMMA:	聚(甲基丙烯酸甲酯)
TCP:	磷酸三钙。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢CERAVER公司(http://www.ceraver.com法国)和EFS Ile请提供支架和间充质基质细胞,分别用于这项研究。Lemonnier和t . Bouderlique还要感谢法国国防部(DGA)和Ministere de l 'Enseignement et de la矫揉造作的资助的博士。

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