文摘

体细胞胚胎发生(SE)和器官形成至关重要的无病和植物基因工程的发展。调查进行治疗的能力包含的组合2,4 - d和激动素诱导SE或器官发生从培养甘薯简历Brondal叶子。10治疗进行评估和治疗有一个专属的组合2,4 - d(0.05, 0.1, 0.2, 0.5或1 mg / L),激动素(0.1或0.5 mg / L)。愈伤组织开始发生在治疗含有更高的激素浓度。2,4 - d激动素比例非常重要( )对愈伤组织生长和扩散的影响。增加2,4 - d激动素比提升丰富的外植体愈伤组织,同时增加激动素2,4 - d比抑制愈伤组织,但鼓励器官形成,特别是拍摄生产(治疗包含0.05 mg / L 2,4 - d和0.5 mg / L激动素)。胚胎发生的愈伤组织形成7周后叶文化治疗包含0.5 mg / L 2, 4 - d和0.1 mg / L激动素。在胚胎发生的愈伤组织,由这种治疗摆脱以前nonembryogenic愈伤组织。通过SE植株产生途径是软弱和不可行,发芽后4周内死亡。相比之下,植株产生在器官形成强,越发强烈,可能是亚文化好几次了。这种差异可能占的简历Brondal胚胎在SE没有暴露于胚胎成熟植株萌发之前启动。成熟阶段会协助胚胎达到生理成熟和所需的干燥程度,都是胚胎植株转换的关键元素。在这个实验中,简历Brondal从叶外植体再生成功实现通过器官发生使用0.05 mg / L 2, 4 - d和0.5 mg / L激动素,试探性的一步发展基于SE再生协议建立了使用0.5 mg / L 2, 4 - d和0.1 mg / L激动素。

1。介绍

红薯(番薯甘薯l .)列为第七后最重要的作物小麦、大米、玉米、马铃薯、大麦、和木薯(1]。块茎植物超低温保存和主要是培养其存储根(2]。全球每年产生的1.28亿吨的红薯,这些是用于人类消费和动物饲料3)或在工业淀粉提取或乙醇生产4]。作物的块茎富含营养,含有丰富的碳水化合物来源(37%)、蛋白质(1.6%)、维生素A、复合维生素B、维生素C、叶酸和磷(0.3%)5]。除了作为营养强化,红薯已经被证明是一个有效的提高农民的粮食安全作物(6]。事实上,小农在津巴布韦取决于甘薯作物来养家糊口,通过销售来获取收入的块茎和葡萄6]。

植物组织培养技术的重要性不能凸显了甘薯传播。组织培养已被用来作为工具来保存种质资源,在无病植物繁殖体的快速生产7,8)和再生协议被用来帮助甘薯的遗传改良9,10]。自1980年代初以来甘薯再生已经公布几个品种,接着通过体细胞胚胎发生(SE)或器官发生途径(11,12]。SE通路是公认的更好的路线植物再生从本质上,它会导致生产更多的再生器官发生途径[相比13,14]。此外,在基因工程实验中,重要的是要避免嵌合植物和任何可能的逃脱的发展(15]。再生通过SE可以帮助实现这一理想状态的再生植株会起源于单个细胞(12]。然而,本身也有缺点,由于长时间的文化需求必要实现体细胞胚胎发生,这可能导致体细胞无性系变异(16]。这里,器官形成有一个优势SE的植株再生通过器官发生不仅长得更快,而且往往是正确的类型(17,18]。

由于再生基因型依赖、甘薯品种一般往往是顽固的再生,因此变得很重要开发再生协议,特别适合当地的甘薯品种。尽管津巴布韦最高收益率甘薯的简历Brondal一直使用器官发生途径再生(19),这将是非常重要的能够再生这个品种通过SE将有利于提高作物通过基因工程。本研究的目的是开发一个体细胞胚胎发生再生津巴布韦甘薯的协议简历Brondal使用叶片作为外植体。十(10)激素治疗由2,4 - d和激动素组合进行评估影响时间愈伤组织发起,愈伤组织生长和增殖,植株再生愈伤组织类型和模式。

2。材料和方法

2.1。种植材料

场种植红薯简历Brondal葡萄来源于Agribiotech (Pvt),哈拉雷,津巴布韦。所有的树叶藤蔓被还有那叶儿落净的藤蔓被切成三个节点部分,4 - 6厘米长。这些节点岩屑然后用肥皂水清洗,除去表面碎片坚持外植体。下一个简历Brondal段被自来水下运行3个小时为了创建一个等渗溶液内的植物部分。洗后阶段,简历Brondal段表面消毒20%次氯酸钠溶液(jik) 15分钟。执行这个过程中层流气流罩(伦敦L.A.H.模型睡)。消毒葡萄树片段然后冲洗三次删除jik消毒无菌蒸馏水。消毒后钳和叶片珠消毒器(steri西蒙•凯勒AG) 350 250oC),钳是用于消毒茎部分进入果酱瓶包含一个基底媒体的棉花和蔗糖的2%。4周后,培养藤蔓植物产生了足够的母亲股票亚文化到纯固体Murashige和斯库(女士)20.媒体与2%蔗糖。的亚文化植物生长被允许进一步的四个星期。在第二轮的亚文化,叶外植体被孤立到培养皿中含有表中列出的10媒体激素治疗1。

表1
治疗数量和相应的2,4 - d女士激动素浓度和比例在媒体用于愈伤组织发起,愈伤组织生长/扩散,从培养的简历和植物再生Brondal叶子。
2.2。培养基制备

叶外植体培养到固体媒体包含规定女士盐营养补充100 mg / L肌醇,2 mg / L甘氨酸,1 mg / L烟酸,1 mg / L吡哆醇、0.2 mg / L硫胺素,30 g蔗糖,10 g / L琼脂。两种生长调节剂2,4 - d和激动素被添加到女士表中相应的治疗方法1。股票的解决方案两种激素是由溶解50毫克激素在少量的0.5 M氢氧化钠激动素和少量的乙醇2,4 - d。激素有溶解时,储备溶液体积长大50毫升,1毫克/毫升股票的解决方案。一旦激素被添加到媒体,女士蒸馏水被添加到启动卷一公升的媒体。接下来,pH值调整pH值5.6 - -5.8使用0.1 M氢氧化钠和盐酸1 M的解决方案。准备的媒体是由高压灭菌法灭菌15分钟121oC然后倒入培养皿(25毫升的媒体到每个)。

整个叶片测量5 - 6毫米之间选择文化媒体激素治疗。一旦叶外植体被放置到培养皿上,然后他们被浸渍稍微帮助扩散的荷尔蒙到叶子之前部分嵌入的媒体中脉面临向下。每个培养皿中有十个叶子和有一个培养皿/治疗/块在三块。这使得300实验单位。实验提出了作为一个随机完全区组设计(RCBD)与10治疗。

2.3。统计分析

获得的数据受到了方差分析所显示Snedecor和科克伦(21]。意味着分离通过使用至少5%显著差异(LSD)。改善数据的常态,转换是由Snedecor建议和科克伦(21]。

3所示。结果

3.1。实验重点1

实验1的重点是激素治疗效果的观察外植体反应所需的时间长度,愈伤组织发起,紧凑的愈伤组织,胚胎发生的文化条件下愈伤组织的形成。

在六天的文化,叶外植体在9个10治疗使用的展出的外观。这个观察,然而,没有治疗6的外植体仍对治疗条件,而是保持鲜绿。在愈伤组织开始,经过治疗1,2,3,4,5小于19天开始从培养愈伤组织的形成(图1)。相比之下,治疗7,8,9,10间平均21天开始从叶片愈伤组织形成的文化(图1)。7周后叶文化、愈伤组织形成的本质在治疗4开始从本质上nonembryogenic胚胎发生的转变。没有这样的愈伤组织转变特点指出了休息治疗,即使在15周的持续观察。在整个时期的文化、治疗6没有产生愈伤组织阶段。


图1
时间(天)开始紧凑/胚胎发生的从培养甘薯愈伤组织形成的履历Brondal叶子。
3.2。实验重点2
3.2.1之上。激素治疗对愈伤组织生长和增殖的影响

研究中使用的所有治疗有能力促进培养的叶片外植体的愈伤组织的形成,除了治疗6。治疗有非常重要的( )直径影响愈伤组织,愈伤组织高度(图2)。对愈伤组织高度,分为五个不同的治疗组,每组显著( )不同于另一个。治疗7、8和10产生愈伤组织的最低高度0.37厘米,0.40厘米,0.39厘米,分别,因此可能会聚集在一起。治疗5(愈伤组织高度为0.62厘米)和9(愈伤组织高度为0.63厘米)也可以聚集在一起,没有明显的( )不同于彼此。治疗2和3没有显著不同的治疗手段1.21厘米和1.22厘米,分别。治疗1和4每下降到每组与治疗1.13厘米和1.59厘米,分别。


图2
影响不同的2,4 - d激动素浓度和比例对愈伤组织生长和增殖(厘米)。

愈伤组织直径的分析显示治疗有非常重要的( )不同于彼此。治疗也可以放入八种不同组与四个组重叠。在愈伤组织直径有关,治疗2和3没有显著不同,在治疗1.76厘米和1.85厘米,分别。治疗1、4和10个每下降到每组治疗手段,1.63厘米,2.1厘米,0.96厘米,分别。治疗8(愈伤组织的直径1.26厘米)和治疗7(愈伤组织的直径1.21厘米)作为个人团体互相重叠出现。同样,治疗5(愈伤组织的直径1.37厘米)和治疗9(愈伤组织的直径1.31厘米)表现为个人团体互相重叠。治疗6被排除在分析没有愈伤组织阶段。的影响不同的2,4 - d激动素浓度的植物再生培养的简历Brondal也不同(图3)。


图3
影响不同的2,4 - d激动素浓度和比例的植物(可行的和不能存活的)再生培养甘薯简历Brondal叶子。
3.3。实验重点3
3.3.1。激素治疗对愈伤组织形态和分类的影响

三个独特的不同愈伤组织(的类型、性质、颜色、形态、和纹理)由下的叶片外植体培养10激素治疗(表使用2)。的愈伤组织在治疗1、2和3表现出相似的特点。这些前三个治疗产生愈伤组织紧凑,半透明的绿色的颜色,nonembryogenic(表2)。治疗5、7、8、9和10也愈伤组织表现出相似的特点。这5个治疗下的愈伤组织是深绿色的颜色,结构紧凑,nonembryogenic。治疗4产生一个完全独特的类型的愈伤组织在自然nonembryogenic前七周的文化。然而,在第七周,这个nonembryogenic的顶部部分愈伤组织开始表现出胚胎发生的愈伤组织特征如图4。愈伤组织在接受治疗4 off-whitish色彩和紧凑的结构。形成鲜明对比的其他治疗方法,治疗6生产没有愈伤组织阶段在整个15周的文化。

表2
效果不同的2,4 - d激动素比率愈伤组织的颜色、形态、和后续分类发达的愈伤组织培养甘薯简历Brondal叶子。

图4
从简历体细胞胚胎发生起始和随后的植株再生Brondal女士离开培养媒体补充0.5 mg / L 2, 4 - d和0.1 mg / L激动素治疗4;(一)10略浸软叶外植体/培养皿。(B)集群的球面不成熟体细胞胚胎。(C)的发展从基底embroyogenic胚柄细胞。(D)在象限4个胚胎的发展阶段(箭头所示)。(E)集群的鱼雷形状的胚胎。(F)拍摄从一个成熟胚发芽。(G)苗木发展,箭头指向新兴叶表现出红色的影子,简历的一个典型特征Brondal叶子。(H)箭头指向顶端分生组织再生的简历Brondal开枪。
3.4。实验重点4
3.4.1。激素治疗对总数的影响植株再生和可行的再生植株的数量

的10个治疗用于诱导植株再生只有两个,处理4和处理6能够鼓励植株发展培养简历Brondal叶外植体(图3)。其余的治疗1、2、3、5、7,8,9,10和治疗未能诱导植物再生(图3)。治疗6平均22植株产生30叶外植体培养相比,治疗4生产在每30 60植株叶外植体培养。所有植株在治疗6被证明是可行的,建立成功当孤立于母亲叶外植体和继续功能独立,亚文化几次(图4)。然而,这并非如此,接受治疗4产生的植株。尽管大量的苗木生产治疗4下,这些被证明是可行的植株未能发展成为功能齐全的植物,例如,完全展开叶或根(图5)。相反,植株再生治疗4开始枯竭三周后萌发在顶端分生组织(开始),尽管一些媒体变化来维持植株。


图5
直接和间接器官发生和随后的植株再生的简历Brondal女士离开培养媒体补充0.05 mg / L 2, 4 - d和0.5 mg / L激动素治疗6;(一)从培养Brondal叶外植体愈伤组织和根发展。(B)和(C)广泛的根的生长没有一个中间愈伤组织阶段媒体补充女士0.05 mg / L 2, 4 - d和0.5 mg / L激动素。(D)两个独立的植株再生从单个叶片外植体(箭头所示)。(E)拍摄的发展。箭头指向的叶片外植体(现在枯竭)拍摄。(F)直接从培养的植株和根新兴叶片外植体。

4所示。讨论

基因型、组织类型和发展阶段的供体植物强有力的决定因素在一个外植体如何回应刺激生长素和细胞因子(22]。在这项研究中,不同的效果2,4 - d激动素比率进行评估,以确定治疗能力从简历诱导体细胞胚胎发生和器官形成Brondal叶组织。每个治疗的影响愈伤组织发起,愈伤组织增殖,与自然产生的愈伤组织和再生能力的芽培养的简历Brondal叶子也被评估。

组织文化条件的响应时间和愈伤组织诱导更早在治疗含有更高浓度的2,4 - d和激动素相比治疗激素水平较低。同样,Sefasiet al。(14]和Sivparsad Gubba [12),在处理甘薯长白猪观察外植体响应之间有很强的正相关关系,愈伤组织,并增加激素浓度。这个观察可能是由于这样的事实,2,4 - d (23)和激动素(24)是强启动子的细胞分裂和扩张和更高水平的媒体这些激素会引起快速反应和愈伤组织培养的外植体。

在实验中,也发现增加了2,4 - d激动素比提升丰富的外植体愈伤组织。这是符合的结果Vahedi et al。25)和拉希德et al。(26藏红花和小麦一起工作,分别。激动素比率降低2,4 - d,然而,导致抑制愈伤组织的形成促进直接器官发生。这也观察他的发现Vahedi et al。(25)发现,随着激动素浓度不断增加相对于2,4 - d水平,藏红花外植体加分路的启动器官形成的愈伤组织阶段。这一趋势也可能被解释成激动素是已知的抑制愈伤组织的形成。

两个形态不同的愈伤组织,胚胎发生的或者nonembryogenic在自然界中,当出现简历Brondal叶子受到不同2,4 - d激动素比率。的简历Brondal时,胚胎发生的愈伤组织只能鼓励2,4 - d激动素水平高,0.5 mg / L 2,4 - d和0.1 mg / L激动素。进一步提高2,4 - d常数激动素不是有益的,因为它往往会阻碍胚胎发生的愈伤组织的形成。事实上,类似的研究结果Sabeti et al。(27)从事西洋参发现高生长素细胞因子水平启发体细胞胚胎发生的愈伤组织的形成。这两项研究也显示,低生长素细胞因子会完全抑制愈伤组织的形成,促进直接器官发生。然而,这个研究结果相反,Das et al。(28发现在处理b . racemosa可以诱导体细胞胚胎激动素2,4 - d水平都是平等的,即使激动素水平两倍2,4 - d。这个组织响应的差异可以归因于这样一个事实,组织应对荷尔蒙通常是特定基因型。

在诱导体细胞胚胎培养的简历Brondal叶子,愈伤组织必须通过nonembryogenic阶段之前实现胚胎发生的状态。虽然这不是一个通常发生在大多数植物物种(12),大家都知道在一些中国和日本甘薯品种。事实上,Karamian Ebrahimzadeh [11)发现这是一个共同特征尤其是拍摄技巧是用来启动文化。Karamian和Ebrahimzadeh11)强调,拍摄技巧在文化首先屈服nonembryogenic愈伤组织之前转换成胚胎发生的愈伤组织。本研究假设,因为简历Brondal愈伤组织不是亚文化但持续保持在原来的培养板,nonembryogenic愈伤组织可以获得的能力转化为胚胎发生的愈伤组织由于消耗原始培养基内激素水平。支持,Karamain和Ebrahimzadeh11)表示,降低了植物生长激素的水平帮助增长恢复preembryogenic细胞,促进可能发展成胚胎。

通过SE植株产生途径证明是软弱,不可行,而死后4周内发芽。尽管植株顶端分生组织可见,两扇外的植株不能发展阶段。缺乏进一步发展可能是由于胚胎是隔绝感应媒体和直接放置到植物恢复媒体没有任何干预的成熟阶段。Mazri等。(29日]表明,对于成功的转化植株,这是必不可少的体细胞胚胎首先经过熟化期使达到生理成熟的胚胎。进一步说,在这种情况下,2,4 - d诱导SE,胚胎成熟期应支持媒体含有活性炭吸收剩余的2,4 - d。生长素的2,4 - d已经发现积极抑制胚胎转换和植株恢复(29日,30.]。SE再生的行为相反,植株再生通过直接器官发生急剧增长强劲,欣然扎根,并可以多次亚文化。之间在行为上的这种差异通过SE和植株再生器官发生可能是直接器官发生、发展中植株也从最初的培养的外植体获得他们的营养叶,一种photomixotrophy [31日),因为叶枯萎而植株蓬勃发展。Yaseen等。(5)也强调,内源碳水化合物池可能扮演了一个重要的角色在一些植物的形态发生。

5。结论

在这项研究中甘薯简历Brondal植株被成功再生使用器官发生和体细胞胚胎发生的路径取决于2,4 - d激动素激素比用于培养基。直接器官发生是通过培养叶外植体在女士媒体包含0.05 mg / L 2, 4 - d和0.5 mg / L激动素虽然SE是由使用0.5 mg / L 2, 4 - d和0.1 mg / L激动素在媒体。总的来说,植株产生在直接器官发生成为完全独立的植物,大力发展强而相比之下植株产生在SE弱和发芽后4周内死亡。

数据可用性

在这项研究中使用的数据可以根据要求提供相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由德国Akademischer交换Dienst(德意志:A / 1395622)国家奖学金第一作者。