交配型基因的特性黄曲霉来自肯尼亚两个地方的人口

摘要

在本研究中，对有性生殖的可能性进行了抽样黄曲霉通过对肯尼亚两个县的交配类型(MAT)基因的分布进行评估，已知交配类型(MAT)基因控制真菌的性特征。采用多重聚合酶链反应(multi - polymerase chain reaction, ma)技术对44株来自Nandi和Makueni县的分离菌株进行基因分型。引物对MAT1-1扩增396碱基对(bp)片段α盒子图案,MAT1-2引物以一个270 bp的高迁移率组蛋白为靶点。的MAT1-2尽管Nandi(75%)的频率高于Makueni(54.17%)，但在两个区域均占主导地位。没有MAT1-1在Nandi和Makueni中，这一比例为15.91%。Makueni菌株扩增两种MAT基因的比例为9.09%，Nandi菌株为11.36%。目前，使用侵略性黄曲霉毒素不产生答:flavus菌株作为生物防治是肯尼亚最有希望的收获前黄曲霉毒素防治策略。然而，我们提出了引入生物防治菌株与自然界中现有的黄曲霉毒素产生菌株杂交的可能性，这可能导致产生答:flavus后代能够产生黄曲霉毒素，同时也是侵略性的殖民者，并可能增加食物中黄曲霉毒素暴露的负担。

1.介绍

曲霉属真菌属子囊菌门和毛菌科．真菌属部分的种Flavi有可能感染玉米、花生、棉花和其他作物的坚果，并可能污染黄曲霉毒素，根据国际癌症研究中心，黄曲霉毒素是第1类致癌物[1，2]．的增长答:flavus通常适宜于37°C的炎热干燥条件，但真菌很容易在25°C和42°C之间生长，甚至在12°C和48°C之间生长。它在如此高的温度下生长的能力有助于它对人类的致病性[2，3.]．

许多真菌有有性繁殖和无性繁殖的潜力。成功的有性繁殖需要有功能和相容的交配类型基因(MAT1-1和MAT1-2基因)。在同居真菌中，当交配类型基因在同一有机体中存在并发挥作用时，即在不同的染色体上或在同一染色体附近时，就有可能实现自交。在异养情况下，一个品系中只有一个交配类型基因，因此被认为是自不育的，需要有一个具有代表相反交配类型功能基因的兼容品系的存在[4，5(Horn等。，2013)．黄曲霉被认为是功能上的异苯二甲酸，并且不常见的菌株包含两个MAT基因。Horn等人[6)报道答:nomius同时包含两种MAT基因的菌株是自不育的，但在功能上是两性的，这意味着它们可以与两者交配MAT1-1和MAT1-2菌株。

自1981年以来，肯尼亚东部地区每年都有黄曲霉毒素中毒的报告，因为食用了受污染的玉米答:flavus和黄曲霉毒素。农业是东非大裂谷和肯尼亚东部的经济支柱，玉米是主要食物，尽管在东非大裂谷还没有黄曲霉毒素病的报告。Makueni是肯尼亚东部报道有黄曲霉中毒史的地区之一[2，7- - - - - -9]．尽管南迪是一个玉米种植区，黄曲霉中毒的病例没有记录，但食道癌病例已被报道[7，8]．在0 - 5岁的幼儿中，Kangethe等人[8]报告说，与南迪相比，Makueni的黄曲霉毒素水平较高。5岁以下儿童通过牛奶接触黄曲霉毒素的比例为4 × 10⁻⁴1 × 10⁻⁴µ在Makueni和Nandi，分别为每天g/kg;哺乳期儿童母乳接触量为6 × 10⁻³1 × 10⁻⁶µ在Makueni和Nandi，分别为每天g/kg。Makueni地区30个月以下儿童尿液中的黄曲霉毒素含量是Nandi地区同龄儿童的1.4倍。

采用生物防治方法是目前降低谷物、落花生和树坚果收获前黄曲霉毒素污染的最有利策略。Non-aflatoxin生产答:flavus被引入到环境中，并与土壤中自然产生的黄曲霉毒素菌株竞争[10]．这项技术正在肯尼亚黄曲霉毒素热点地区进行试验[11- - - - - -13]．然而,答:flavus在土壤特殊条件下，由于具有通过有性重组进行异交的潜力，居群表现出很高的遗传变异。当这种异交发生时，生防菌株可以与黄曲霉产毒菌株的本地种群重组，产生的后代不仅继承非黄曲霉产毒亲本的攻击性，还可以继承产生一种或多种严重真菌毒素的能力，如黄曲霉毒素B1或环吡唑酸(CPA) (Horn等。，2013) (14]．因此，有必要了解引进的生物防治菌株与现有黄曲霉毒素生产的潜力答:flavus在土壤中[14]．本研究的目的是确定紫花苜蓿的MAT基因分布答:flavus根据Nyongesa等人的描述，该菌株最初从Makueni和Nandi的土壤和玉米样品中分离出来[15和Okoth等[16]．这是重要的评估,有两个原因:(1)确定重组领域水平的人口,这是相对于垫基因的比例,和(2)更好地选择一个候选人生物电控制的压力,减少重组与土著居民的机会(17]．

2.材料和方法

2．1．真菌分离物来源

44黄曲霉该研究中使用的分离株最初是从肯尼亚东部(Makueni)和裂谷(Nandi)地区采集的玉米和土壤样本中分离出来的，据记录具有生产黄曲霉毒素的能力[15，16]．培养物保存在肯尼亚内罗毕大学真菌学实验室。

南地位于北纬0°、0°34”和东经34°44”、东经35°25”之间，海拔1300米至2500米。该地区每年的降雨量约为1200-2000毫米，平均气温为20°C。马库埃尼地区海拔1218米，年平均气温24°C，降雨量200 - 1200毫米。由于干旱频繁，降雨不可靠[2，7- - - - - -9]．

2．2．的分子特征曲霉属真菌隔离

2.2.1。DNA的提取

来自肯尼亚东部和裂谷部分地区的真菌分离物，根据Okoth等人2012年的研究，测定了酵母提取物蔗糖(YES)中黄曲霉毒素积累水平[16)和Nyongesaet al。2015年(15)(见表1)，在4°C硅胶珠上保存。在无菌条件下，将2 ~ 3个硅胶珠转移到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上。每一个答:flavus菌株进行重复培养。分离菌株在37°C下培养7天，根据制造商的说明，使用Zymo Research真菌/细菌DNA迷你Prep Kit(表观遗传学，Hatfield，南非)提取DNA。

2．3.分析黄曲霉交配型分离株

以M1F和M1R为引物，通过诊断聚合酶链反应(PCR)建立MAT基因MAT1-1基因M2F和M2RMAT1-2基因(18，19)(见表2)．PCR在20分钟内完成µL反应，包括1µ1 U REDTaq DNA聚合酶(Sigma-Aldrich公司，米兰，意大利)µl REDTaq缓冲液补充1.7µl 22毫米氯化镁₂最终浓度为3.0 mM, 10 mM脱氧核糖核酸三磷酸，0.5%牛血清白蛋白(BSA)， 0.5µM1F、M1R、M2F、M2R 4种引物各取M [18，19]．反应在Mastercycler ep梯度(Bio-Rad, California, USA)下进行，热分布在95°C下为5分钟，随后在95°C下为30秒，在54°C下为60秒，在72°C下为45秒进行40个循环。扩增的DNA在1.5% (w/v)的三乙酸乙二胺四乙酸(EDTA)琼脂糖凝胶中电泳，标记为MAT1-1和MAT1-2使用100 bp的DNA梯子(exACTGene, Fisher Scientific International)作为尺寸标准。

制作浓度为1%的琼脂糖凝胶。将琼脂糖在100°C的锥形烧瓶中煮沸5分钟，待其冷却至55°C和0.3µ摇瓶时加入溴化乙锭L，使凝胶与溴化乙锭混合。将混合物倒入带着梳子的凝胶槽中，让其凝固。分子标记(2µl)加入1孔，DNA (4µL)其他井和安排被注意到。凝胶在80电压下运行45分钟，并在凝胶文档(Bio-Rad, Molecular Imager gel doc™XR-CLASS, Imaging System, California, USA)下查看。

3.结果与讨论

44株分离株中，6株为MAT1-1(数据1，2，3.,5)， 29个菌株发生了突变MAT1-2(数据3.，4和5)， 9个菌株同时扩增两种MAT基因(图1，2，3.，4,5)．数据2，3.，4,5在补充数字中。

在本研究中，抽样答:flavus来自Makueni和Nandi的菌株包括那些至少同时包含MAT基因片段的菌株和那些只包含一个MAT基因的菌株。产生功能性物质的真菌MAT1-1和MAT1-2同一菌体上的基因是自交的，而只有一个MAT基因的则需要亲和MAT1-1或MAT1-2来自两个不同个体的核。Nandi为11.36%，而Makueni的比例较低(9.09%)。在这两个地区,MAT1-2Nandi地区的分离率(75%)高于Makueni地区(54.17%)，但Nandi地区分离率为61.36%。南迪的分离株没有MAT1-1而在马库埃尼，这一比例为15.91%。

菌株间的实验室杂交答:flavus已成功地应用对交型基因诱导两性间的有性重组MAT1-1和MAT1-2隔离(20.- - - - - -22]．在我们的研究中，大多数来自Makueni的分离株是MAT1-1或MAT1-2，表明它们可能是异苯二甲酸。在Makueni的分离株中，有4株含有两种MAT基因的片段(见表)3.)，表明同苯二甲酸存在的可能性。在这一区域，单交配类型的分布几乎是均等的，而且有分离株显示出两个MAT基因的证据，这可能表明在这些分离株取样的地区有活跃的重组发生。5株南迪分离株显示出包含两种MAT基因的证据。在含有MAT基因中的一个或另一个的分离株中，没有MAT1-1分离株鉴定(表3.)．由此我们可以推断，重组的发生速度并不像马库尼那样快。交配试验将允许我们确认或驳斥这些基因座的功能。

根据我们的发现，我们可以推断交配类型分布和黄曲霉毒素爆发之间的相关性。例如，自1981年以来，马库埃尼(交配类型分布较为平等)爆发了黄曲霉毒素疫情，而南迪则没有爆发黄曲霉毒素疫情的报告，南迪的黄曲霉毒素疫情占主导地位MAT1-2基因(7- - - - - -9(Okoth等。，2016）.产毒与非黄曲霉产毒的有性重组答:flavus土壤中的菌株被认为是多样性的主要原因，使一些答:flavus后代可遗传产生黄曲霉毒素的能力[5，14，17，20.，23- - - - - -25]．

目前，生物防治是降低采前黄曲霉毒素污染的最有利技术。策略包括传播非黄曲霉毒素答:flavus菌株孢子，从而大大降低了黄曲霉毒素的水平。黄曲霉毒素和非黄曲霉毒素产生菌在土壤中占有相同的生态位[26]．在我们的研究中，44答:flavus已鉴定的菌株为农业分离菌株[15，16]．MAT基因在Makueni中分布几乎相同，表明有性重组的潜力(见表)3.)．AtoxigenicMAT1-1IVM300566 (0µG /kg)作为生防剂，可与产毒剂进行杂交MAT1-2这两个区域可以促进重组。因此，寻找有毒物质是明智的MAT1-2菌株作为生物防治的候选菌株。埃利希(10]提示在已引进非黄曲霉毒素生防的农业环境中检测基因重组频率是很重要的。根据我们的发现和对该地区的推断，在释放可与当地居民重新结合的肥沃生物防治菌株之前，评估该地区的分布是很重要的。我们还必须验证包含两种MAT基因的菌株的繁殖力，以确定它们是否像Horn等人所做的那样是功能两性的答:nomius［6]．

4.结论

这项研究强调了在生防选择和释放之前，在田间调查交配类型分布的重要性，以最大限度地减少性重组的潜力，同时提高生防菌株的功效。我们的发现表明答:flavus肯尼亚的菌株有可能携带两种MAT基因，尽管我们不确定它们的功能。此外，我们还表明并非所有字段都具有相同的配对类型分布。由于交配类型的分布，Makueni野外种群可能具有较高的遗传和化学型多样性，以及有性重组的潜力。选用自然不育的毒性菌株作为生物防治是比较好的。对于南迪来说，分布不那么多样化，如果MAT1-1+MAT1-2分离株不能自交或异交，然后利用MAT1-2生防菌株是有效的。另一个有用的特征是确保生防菌株缺乏黄曲霉毒素簇基因，因为在重组过程中更难遗传整个簇基因。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者在发表本手稿方面没有利益冲突。

作者的贡献

所有的作者都对手稿从准备到提交阶段做出了贡献。

致谢

这项工作由院长奖助金委员会、内罗毕大学和交换服务(DAAD)国内奖学金方案资助。

补充材料

马库埃尼和南迪黄曲霉的交配类型。（补充材料）

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