细菌的系统发育分析及耐药性研究李斯特菌印尼泗水污染鸡肉

抽象的

本研究的目的是确定系统发育分析和抗生素耐药性李斯特菌污染鸡肉在泗水。从超市，移动供应商和Surabaya的传统市场收集了60个鸡肉样品。选择性培养基用于分离和识别李斯特菌通过切碎25克鸡肉并将其放入灭菌的Erlenmeyer烧瓶中。一些方法用于鉴定程序，例如生物化学和形态试验，抗生素抗性试验，PCR和测序;还通过使用Genetix Mac Ver 8.0与Hlya基因进行了邻近的分析来进行系统发育分析李斯特菌如天堂I (KC808543)、天堂II (AY229462、AY229346、AY229499、AY229404)、天堂III (KJ504139、HQ686043、KJ504116、DQ988349)、天堂IV (EU840690、EF030606)。结果表明单增李斯特菌在泗水，来自超市的鸡肉样本污染率为10%(2/20)，来自流动小贩的鸡肉样本污染率为0/20(0%)，来自传统市场的鸡肉样本污染率为5%(1/20)。在456 bp的片段上可以看到。此外，在苏拉巴亚发现的三个分离物包含在新谱系中，这些谱系被耐老代抗生素，如磺胺甲基唑 - Trimetophlim（SXT）和Amoxyllin Sulbactam（MAS），但它们仍然对新一代抗生素（如Cefotaxime）敏感（CTX）和MEROPENEM（MEM）。

1.介绍

在印度尼西亚，最受欢迎的动物蛋白来源是鸡肉。它便宜、美味，而且容易烹饪;而且，各种各样的菜可以用它来做。2018年，印尼生产了2144013吨肉鸡肉;2016年只增加了1,905,497.28吨，需求每年都在快速增长[1]印度尼西亚最大的肉鸡生产商之一是东爪哇省。收获物在东爪哇省首府泗水收集，也是印尼仅次于雅加达的最大城市，然后被分发到其他城市，并被超市、传统市场和流动摊贩的顾客广泛购买。

随着对鸡肉需求的增加，人们对食源性疾病的担忧也随之增加。导致它的其中一个因素是李斯特菌[2］.这种细菌可以在食物、水、土壤、蔬菜、动物和人类的任何地方找到。此外，它也有很高的可能性感染人类和动物，死亡率很高[3.］.已在美国遇到哈瓜，熏鱼，腌制产品，肉类产品和污染的蔬菜造成的人类局部病单增李斯特菌[4.那5.］.

根据Janzten等人[6.]，Listeria.属被归类为革兰氏阳性细菌，含有6种细菌Listeria.：单核细胞增生性李斯特菌、innocua李斯特菌、seeligeri李斯特菌、welshimeri李斯特菌、ivanovii李斯特菌,李斯特菌grayi。其中之一被称为对人类最致病的单增李斯特菌由4个谱系组成（谱系I、II、III和IV）[7.］.这些细菌可以在1℃-45℃的温度下生长，并且它们可以在冷或冷冻温度下增殖。

在4°C下长时间储存​​的非高菌肉和奶制品等快餐是潜在的来源L.。单核细胞增多症感染。有时,单增李斯特菌也可以在加工食品中找到。单增李斯特菌食品加工后的污染是影响人体健康的重要因素。因此，需要相当多的知识，以便预防单增李斯特菌可以适当地完成环境中的细菌或来自牲畜及其乳制品的食品中的细菌。此外，存在快速准确的检测技术单增李斯特菌在食物中是必需的，使受感染的个体可以立即治疗[8.]罗德里格斯等人[9.]也有报道称，该产品感染率最高单增李斯特菌家禽和牛肉是否存放在冰箱内;烟熏的新鲜肉。人类李斯特菌病由单增李斯特菌是一种间歇性疾病，有轻微到严重的流感症状以及脑膜炎和败血症表现。高危人群是孕妇和免疫缺陷人群。在孕妇中，它可能导致流产、早产和出生缺陷。

在印度尼西亚，食物中毒是由于Listeria.细菌感染，尤指单增李斯特菌的次数比来自的次数少大肠杆菌和沙门氏菌细菌。单增李斯特菌印尼的污染没有像发达国家那样被广泛报道[10］.据报道，在马来西亚，街头小贩出售的各种当地食品都是即食食品。在这类食品中发现病原菌的高发性。在大型超市出售的生食和即食速食产品中也发现了它，尽管人们认为它们的卫生状况较好，但食源性疾病病原体和单增李斯特菌也被确定[11］.

通常情况下,单增李斯特菌易受各种抗生素的影响，尽管已经报告了一些分离株对许多抗生素进行了抗性[12］.一些毒性标记单增李斯特菌如Listeriolysin O（由Hlya基因编码）具有在调节毒力和致病性中的作用[13］.即使在食物中，来自环境的细菌也会导致不同毒力基因的表达，从而导致不同的感染程度[16］.

根据哈索约和安迪尼的说法[10]，印尼国家标准实际上规定，印尼的动物源性食品不应含有Listeria.食品和农业组织（FAO）指南还强调积极主动和基于风险的现代食品安全体系。因此，有必要确定影响人群的疾病和食品中病原体的存在，并制定风险缓解措施[15］.

本研究的目的是鉴定系统发育分析和抗生素抗性单增李斯特菌在泗水，印度尼西亚，特别是氨苄青霉素，氨基氨基·苏酰胺，头孢噻肟，梅洛尼姆和磺酰甲基唑-Trimetopharim，植物牛肉，繁殖，肉鸡农民作为抗生素生长促进剂和印度尼西亚治疗抗生素的治疗酶[16］.

2.材料和方法

2.1.研究设计、研究区域和取样

在泗水大都市城市进行了一项横断面预期研究。从超市，传统市场和移动供应商收集了60种生鸡肉样品作为泗水人的主要肉类供应商，其中包括每个地方的20个样本。使用简单的随机抽样技术，用于从泗水的随机选择的超市，传统市场和移动供应商收集的所有样品。将肉类置于冷链箱中的无菌防漏容器中。将样品被运输到艾尔加兰加大学热带病研究所的热带病诊断中心（TDDC）。

2.2。生物化学和形态学测试

选择性培养基用于分离和识别单增李斯特菌. 将25克鸡肉放入消毒的Erlenmeyer烧瓶中，然后取出225克 添加ml缓冲李斯特菌浓缩液，然后使用旋涡混合器均质2分钟，并在30°C下培养24–28小时[17］.孵育后，用转移环从Erlenmeyer烧瓶中取菌悬液，擦入PALCAM培养基中，37℃孵育24-48小时，进行鉴定。的殖民地单增李斯特菌在绿色的PALCAM琼脂培养基上，培养基被黑色区域包围[17］.阳性标本在37℃下进行24小时血中溶血试验。这是为了观察成形过程β溶血。革兰氏染色处理镜下观察为紫色或紫罗兰色[17］.然后，进行硫化物吲哚运动（SIM）试验以鉴定硫化物，吲哚和在37℃下持续24小时后的细菌运动[17］.进行三重糖铁试验（TSIA）和葡萄糖试验以鉴定葡萄糖，乳糖和蔗糖的发酵[17]甲基红Voges Proskauer（MR-VP）显示粉红色和乙酰甲基甲醇的形成[17］.确认试验（CAMP测试）用于鉴定由于放牧周围过量的溶血区引起的伞状细菌生长金黄色葡萄球菌和红球菌属等[17］.

２．３．抗生素耐药性测试

通过灭菌的棉签捕获制备的纯培养物，并在Muller Hinton琼脂（MHA）的表面上涂抹5分钟。含有抗生素的纸盘在MHA上，纯培养分离25-30nm，然后在35℃下孵育24小时[18］.用游标卡尺根据抑菌直径进行抗生素敏感性试验。所检测的抗生素为氨苄西林、阿莫西林舒巴坦、头孢噻肟、美罗培南和磺胺甲基咪唑-甲氨喋呤，然后使用国家临床实验室标准社区(NCCLS)的抑制带表对结果进行解释[17］.

２．４．李斯特菌用PCR检测

DNA提取单增李斯特菌试剂盒Qiagen. 5μl悬浮液直接作为模板进行hlyA基因片段的CR扩增。20μl PCR反应为12.5μL主混合，0.5μL蒸馏水，0,5μl前进底漆（f），0.5 μl反向底漆（R）和5 μl DNA模板。引物为F: 5 ' -GCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAA-3 '和R: 5 ' -GCA-ACGTATCCTCCAGAGTGATCG-3 ' [19］.PCR条件包括95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，54.6°C退火30秒，72°C延伸1分30秒，最后72°C延伸5分钟。PCR过程共35个周期。5μ将L PCR产物放入2％电泳凝胶中，然后用于100伏的电泳介质60分钟。在电泳后，然后用UV光进行凝胶进行观察。DNA靶碎片的可视化在456bp中显示紫外转亮剂[19］.

2.5.测序和系统发育分析

2.5.1。低熔点琼脂糖法PCR产物纯化结果

获得PCR产物，然后纯化。步骤如下：（1）使用溴化乙锭1mg / ml为L琼脂糖（低熔点琼脂糖）制备2％琼脂糖凝胶;（2）来自PCR的DNA产生约5 μL加入装载缓冲液为1μ湖在施用期间，将混合物倒入其他槽中。电泳后，用紫外光观察结果，具有365nm波长的UV光。然后用切割器切割DNA带（在用UV光束的同时，在切割每个DNA带后，必须始终洗涤切割器）;（3）将与DNA切片混合的琼脂糖凝胶插入2mL微管中;（4）然后通过按照试剂盒中附着的指示，用QIAGEN纯化凝胶中的DNA用试剂Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。

2.5.2. 纯DNA标记

纯化结果用hlyA基因引物进行前序PCR标记。在本步骤中，标记使用了应用生物系统公司的标记二脱氧核苷酸三磷酸染料BigDye Termination Kit V.1.1。前测序PCR的条件为96℃预变性1个循环3分钟，接着是96℃变性10秒，50℃退火5秒，60℃延伸4分钟，共25个循环。

2.5.3。标记DNA降水

前测序PCR的DNA产物通过以下步骤进行沉淀:(1)150-200步μl标记的DNA放入新微管中，加入1/10 × NaAc 3M (pH 5.2)体积的乙醇沉淀15μl和2倍乙醇100%体积300μl、 与旋涡混合器混合，并在-20℃下保持30分钟；（2）在14000℃下进行离心 转速为10分钟；然后小心地丢弃上清液；（3）用550洗涤颗粒 μL 70％乙醇，然后以12,000rpm离心5分钟，仔细丢弃上清液;（4）用真空泵干燥沉淀物10分钟，重新悬浮10 μl的TE pH 8溶液;(5) DNA保存在-20℃，准备进行测序。

2.5.4.核苷酸测序

在使用低熔点琼脂糖纯化DNA并用hlyA引物基因标记后，进行测序程序以获得核苷酸形成。核苷酸序列通过Bigdire Terminator Cycle测序试剂盒、EDTA Hi二甲酰胺和特殊0.5进行测定 应用生物系统公司的ml管和自动测序设备ABI Prism 310基因分析仪。

2.5.5。系统发育分析

从中获得的核苷酸模型图谱单增李斯特菌然后，使用Genetix Mac Ver 8.0对泗水的分离株进行邻居连接分析，并对来自中国的hlyA基因进行系统发育分析单增李斯特菌录制在Genbank：Lineage I（KC808543），谱系II（AY229462，AY229346，AY229499和AY229404），谱系III（KJ504139，HQ686043，KJ504116和DQ988349）和谱系IV（EU840690，EF030606）。

3.结果与讨论

在图中1，普遍存在单增李斯特菌在泗水，来自超市的鸡肉样本污染率为10%(2/20)，来自流动小贩的鸡肉样本污染率为0/20(0%)，来自传统市场的鸡肉样本污染率为5%(1/20)。在456 bp的片段上可以看到。

在图中2根据系统发育分析，与GenBank中记录的4个谱系相比，印度尼西亚泗水共有3个菌株，表现出不同的谱系。

从表1，我们可以看到3个菌株单增李斯特菌从印尼泗水的超市或传统市场收集的鸡肉中发现的污染鸡，对磺胺甲氧苄氨嘧啶(SXT)和阿莫西林舒巴坦(MAS)有耐药性，但对头孢噻肟(CTX)和美罗培南(MEM)仍然敏感。

这项研究与Sugiri等人没有线性。[20]这表明了单增李斯特菌超市中发现的污染约为10％，传统市场在印度尼西亚万隆市的移动供应商是0％。然而，它也与先前的研究一致，报告了这一点单增李斯特菌在鸡肉中发现的患病率在15 - 35%之间，细菌在0-8°C无真空保存的鸡肉中生长良好，在10天内细菌达到10^8.–10^9.细胞/克[8.那18那21］.

氨苄西林、阿莫西林-舒巴坦钠、头孢噻肟、美罗培南和磺胺甲唑-三甲氧嘧啶是印度尼西亚肉鸡养殖场最广泛使用的抗生素药物，用作饲料添加剂和生长促进剂；它们增加了产量，提高了饲料使用效率[16]这与2008-2009年期间由于抗生素耐药性反应导致的呼吸道感染、副伤寒、咽炎、扁桃体炎、水痘、伤寒和结核病在人类病例中的高发病率有关[22］.

鸡肉中抗生素残留超过最大允许限度是一个严重关切的问题。热处理可以降低某些抗生素组的风险，但不能保证肉类中存在的这些抗生素残留物完全降解。一些发达国家，包括丹麦、挪威、瑞典和欧盟，已经限制了以促进生长为目的的抗生素的应用。培训农民监测戒断期，禁止使用抗生素作为预防性治疗，以及采取兽医饲料和药物监管措施，都是减轻与肉鸡生产有关的细菌中出现抗生素耐药性的重要参数[23］.

在泗水流动商贩和传统市场卖鸡肉的人个人卫生很差，因为他们都不戴口罩和手套。Rafikah等人[24]说明所有从事食品加工工作的人员应保持卫生;例如，他们必须穿戴干净的衣服和设备、围裙、帽子、口罩和手套，以尽量减少食品的细菌污染。

尽管超级市场的肉类储存比泗水的传统市场更好、更清洁，但超市的即食食品（RTE）储存和展示条件允许单增李斯特菌即使在冰冻的温度下也能在食物中生长和茁壮成长[25)报道,单增李斯特菌在储藏食品的冰箱中发现，无论是食用食品，很少或没有预热过程，所以它对消费者可能是有害的威胁。的存在单增李斯特菌在传统市场、流动小贩和泗水超市的鸡肉中发现，在生产过程中，从切割到储存，单增李斯特菌发生污染；因此，需要严格的监测和预防程序，以尽量减少污染。

Antunes等人[26和Srinivasan等人[27]解释说单增李斯特菌从家禽肉类和奶制品中分离出的菌株对一种或多种抗生素具有耐药性，这表明动物产品是耐抗生素食源性疾病的潜在载体。李斯特菌自然易受影响β-内酰胺类抗生素，如青霉素、阿莫西林、美罗培南和氨苄西林，或与氨基糖苷（庆大霉素）联合作为人类李斯特菌病的标准疗法[28那29］.β-Actams反对单增李斯特菌抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成[30］.对内酰胺类抗生素过敏的患者可使用磺胺甲恶唑甲氧苄啶[31]然而，Srinivasan等人[27]和尤卡尔等人。[32有报道说这种抗生素对单增李斯特菌从肉类和乳制品中分离出来。

由于抗生素误用而产生的耐药菌株可以在抑制浓度水平上耐受抗生素的影响[33]。在处理不当或管理不善后食用受这种抗药性菌株污染的肉类会增加其在人体内传播的机会[34］.单增李斯特菌可以通过突变将耐药基因转移到人体天然微生物中，质粒调节（可动质粒和可移动性质粒），共轭转座和流出泵[35-38］.这种抗性菌株的存在可以降低用于治疗受感染个体的抗生素的有效性[39］.

Vazquez Boland等人[40]证明分离出的细菌的毒力水平和菌株类型之间存在相关性；临床来源的毒力低于食品来源的毒力。确保单增李斯特菌在原始环境中，鉴定一个主要毒力因子是更好的选择。在各种毒力因子中，LLO（58 hlyA基因编码的kDa溶血素蛋白（kDa-hemolysinprotein，kDa-hemolysinprotein，hlyA基因编码的kDa-hemolysinprotein，kDa-hemolysinprotein，kDa-hemolysinprotein，kDa-hemolysin）是一种主要的毒力因子和致病性标记物Listeria.…的系统发育研究单增李斯特菌这对于提高我们对如何进行的理解至关重要单增李斯特菌由动物或环境通过食物传染给人类。结果表明，在泗水污染鸡肉的所有三个分离株形成了独特的谱系，因为它们没有被包括在先前报道的4个谱系中[7.］.

在本研究中，抗生素耐药性试验结果表明，在印度尼西亚泗水的超市、流动小贩和传统市场中污染鸡肉的3个分离株对一些老一代抗生素如磺胺甲氧胺唑(SXT)和阿莫西林舒巴坦(MAS)具有耐药性，但对新一代抗生素如头孢噻肟(CTX)和美罗培南(MEM)仍敏感。

单药治疗中的梅洛涅姆已被发现激活对抗细胞内单增李斯特菌脑膜炎病例感染的实验研究它的效力是氨苄西林和厄他培南的10倍[41］.美罗培南治疗5小时起抑菌作用，24小时起杀菌作用[42];它可能引发细菌严重的细胞损伤[41］.

头孢噻肟是由头孢菌素衍生而来的杀菌剂;它对革兰氏阳性微生物具有广谱活性，并通过干扰其细胞壁的合成而对大多数革兰氏阴性微生物具有特殊的活性。它被广泛认为是治疗由革兰氏阴性菌引起的新生儿脑膜炎和败血症的首选抗生素单增李斯特菌[43］.头孢噻肟作为新生儿、婴儿和儿童许多感染的一线抗生素已被广泛接受。头孢噻肟使细胞产生IL-2显著增加，TNF-分泌增加α通过外周血单个核细胞;这也表明它可能改变宿主的免疫反应。头孢噻肟是一种安全有效的抗生素，用于治疗脑膜炎细菌感染，其中80%的这些微生物对氨苄西林耐药[43］.

这结果与以前的研究不同，表明Listeria.一般来说，Sp.对所有抗生素仍然敏感[44]这与包括印度尼西亚在内的一些发展中国家的畜牧业和社区不适当使用抗生素的习惯是分不开的。因此，提高对正确使用抗生素的剂量和持续时间重要性的认识应该是政府和社区关注的问题。

4。结论

污染单增李斯特菌在泗水的超市、流动小贩和传统市场的鸡肉中发现了李斯特菌病的潜在分布。此外，发现的3个分离株被视为独特的谱系，并且已经对老一代抗生素如磺胺甲唑-甲氨苄氨唑(SXT)和阿莫西林舒巴坦(MAS)产生耐药性。因此，对潜在食品污染和抗生素敏感性的监测政策单增李斯特菌是必需的，同时还确保有效的抗生素治疗。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明他们在这篇论文的发表上没有利益冲突。

致谢

作者希望感谢印度尼西亚泗水艾朗加大学兽医学院为本研究提供的资金支持。

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