文摘
进行了横断面研究的四个原住民社区哥斯达黎加检测存在和流行巴贝西虫caballi和焦等并调查这些hemoparasites的相关因素。马的一般情况()是评价,血细胞比容和血红蛋白测定血液样本的130匹马,也分析了使用血液涂片,嵌套式聚合酶链反应(PCR),免疫吸附试验(c-ELISA)。马的一般情况()的身体和外套是常规和穷人之间,血红蛋白和血细胞比容平均值较低(19%和10.65 g / dL、职责)。红细胞内含物观察32例(24.6%)的样品。26个样品(20.0%)给了积极的结果b . caballi和60例(46.2%)t .武器装备;10马(7.7%)显示混合感染,由PCR分析。使用c-ELISA,发现90名(69.2%)马抗体b . caballi和115年(88.5%)t .武器装备,而81例(62.3%)显示各种各样的反应。没有相关的因素的存在b . caballi和t .武器装备。这些结果与先前获得的结果在哥斯达黎加中央山谷的马。
1。介绍
马巴贝虫病是一种马感染所产生的巴贝西虫caballi和焦等属于原生动物,分别的巴倍科和Theileriidae家庭Piroplasmida秩序。两个代理可以寄生于动物同时也通过蜱虫(1,2]。
寄生虫导致马巴贝虫病流行在世界大部分地区,包括美国。Seroprevalence 20%至90%报告在拉丁美洲,在那里的流行t .武器装备是比b . caballi,而在北半球地区的更普遍b . caballi比的t .武器装备已被观察到;此外,混合感染被报道接近30% (3- - - - - -6]。
梨形虫病很难诊断在流行地区临床体征是变量而不是特定的(7,8]。t .武器装备被认为是最致病性,能够产生发烧的40°C,淋巴结病,肝肿大,胆红素尿9,10]。
马巴贝虫病的病原体可以在显微镜下观察到通过Giemsa-stained血液涂片;然而,这种方法的缺点是主观的,灵敏度低,主要是在马寄生虫血症较低(< 104感染红细胞/μL) (6,11,12]。间接免疫荧光试验(IFA)和免疫吸附检测(ELISA)所需的血清学测试世界动物卫生组织(OIE)的马被从一个国家到另一个(2]。动物与一个活跃的持续感染或感染将显示抗体滴度高,同时,在马群中,消除剂,抗体将减少,他们不能被发现在六到十个月的时间13]。
聚合酶链反应(PCR)技术b . caballi和t .武器装备是高效的,因为它可以检测到低水平的寄生虫血症,确定感染的物种,也允许持续感染动物的检测和慢性携带者(14- - - - - -17]。然而,实施的时间和成本是两个不方便这一技术的各个方面。
所涉及的不同种类的蜱虫属马巴贝虫病的传播,科学家,矩头蝉属,扇头蜱属,在全国已报告阿尔瓦雷斯et al。18]。直到现在,四个血清学的研究已经开展在哥斯达黎加,检测抗体的存在b . caballi和t .武器装备在马参加集会)[19出口的目的),()[20.从屠宰场),()[21),并从优秀的稳定的马类()从中央山谷22),44.3%到59.0%的患病率b . caballi为47.0%和34.0%t .武器装备是确定。
梨形虫病在土著马在这些社区的情况还没有被研究过,即使这些动物提供生存的来源,它们的主人,和缺乏有效的寄生虫控制3]。相比之下,大多数的马其他地区被主人定期测试和除虫,尤其是当他们被安置在马厩或参加比赛。本研究的目的是确定当前和过去的感染的存在b . caballi和t .武器装备在马的血液样本的土著社区和确定风险因素与这些代理的存在有关。
2。材料和方法
2.1。研究人口类型和引用
一个描述性的横断面观察性研究进行了2011年3月和10月之间Vereh的社区,帕索马科斯,中音Pacuare, Amubre(图1)。前三个社区Cabecar储备,在Chirripo Turrialba(9°41′45.81 - 46.12 9°48′北25′83到51.90°和83°29′21.50西),在Amubre社区Talamanca和属于Bribri组(9°30′北部和西部83°40′)。每个社区都访问一次。
2.2。数据和样品收集
与封闭的答案进行了一项调查关于起源和每一个动物的所有者一般卫生保健的马。然后进行了一般临床检查,血液样本。个体的临床记录临床症状的存在被记录(贫血、虚弱、厌食、恶病质和血红蛋白尿),以及马的身体条件(23)、外套条件和蜱虫的存在。
收集血液样本中所有马工作场所。样本下运输制冷实验室,进行临床分析和血涂片;样品终于储存在−20°C的分子分析。血液样本没有EDTA离心10分钟10000 g和储存在−20°C进行血清学分析。
在每个社区收集的样本总数表所示1。抽取的285个样本中,45%的人选择从每个社区(总共130匹马)。样本选择的基础上方便,也就是说,受影响最严重的是影响最小的(马呈现临床症状或有蜱虫),检测红细胞内含物和PCR和ELISA。
2.3。临床分析和血涂片
血细胞比容值为130个样本测定HETTICH微型离心机(18600克,5分钟);价值决定了达蒙/ IEC比容读者。使用密度计测量血红蛋白。报道正常红细胞容积值和血红蛋白14.9 g / dL±1.3 g / dL (4]。描述的染色染色Akkan et al。9)是这130个样本用于血液涂片;样本中至少有一名intraerythrocyte hemoparasite被认为是积极的。
2.4。提取、聚合酶链反应(PCR)和测序
Promega向导基因组DNA净化设备(美国威斯康辛州麦迪逊)被用来从130份血液样本中提取DNA。嵌套PCR作为描述Battsetseg et al。14]。引物BC48F1 BC48R3用于b . caballi第一PCR和BC48F11 BC48R31第二PCR。第一反应是12.5的混合μL和包含6.5μL梦Taq PCR大师混合2 x (Fermentas), 0.5μ每个引物(100 pmol / LμL), 1μ(1.9 - -2.6 L的DNAμ4.5 g),μL nuclease-free水(Fermentas),放大条件4分钟的初始变性在96°C, 40多次变性周期(94°C 1分钟),调整(56°C 2分钟),扩展(2分钟72°C),最后5分钟的扩展在72°C。第二PCR条件是相同的,除了调整温度是50°C 2分钟,和1μL(第一次PCR用于反应。DNA提取积极的马,由兽医汉诺威大学捐赠的德国,被用作积极控制。Nuclease-free水(Fermentas)作为消极的控制。
引物EMA-5和EMA-6 (PCR)和EMA-7 EMA-8(第二PCR)被用于t .武器装备。第一个PCR反应的混合是一样的PCRb . caballi。条件是10分钟的初始变性在95°C, 40多次变性周期(94°C 1分钟),调整(60°C 1分钟),扩展(72°C 1分钟),最后5分钟的扩展在72°C。第二PCR条件描述的相同。的反应,1μ产品从第一个使用PCR的L。DNA提取积极的马,捐赠的学校大学的兽医、畜牧学圣保罗,巴西,作为一个积极的控制。Nuclease-free水(Fermentas)作为消极的控制。
获得的产品受到电泳(100伏,45分钟)在2%琼脂糖凝胶与GelRed此种。样品显示产品大小为430个基点(b . caballi)和218 bb (t .武器装备)被认为是积极的。
一个血液样本的放大产品给予积极的结果b . caballi和另一个阳性t .武器装备被送到Macrogen、韩国、测序。序列中报告基因与他人相比,使用大型爆炸5.05软件和程序(马里兰州贝塞斯达国家生物技术信息中心,美国)。
2.5。竞争分析(c-ELISA)
130年选中的血清进行了分析与竞争ELISA (VMRD Inc .)、铂尔曼、华盛顿、美国)检测抗体b . caballi和t .武器装备后,建议协议。血清显示百分比的抑制作用大于或等于40%被认为是积极的。
2.6。统计分析
绝对和相对频率分析是进行285匹马的特征出现在四个社区。此外,全球正样本的百分比计算PCR和c-ELISA,以及特定的百分比/土著社区研究。最后与每个原生动物的存在相关联的因素决定使用泊松回归(PCR阳性样本)。统计分析是使用程序占据I / C 13(美国StataCorp)。
3所示。结果
总共有240土著个人来到了四个位置,285匹马。身体状况在84年被发现可怜的定期(29.5%)和112年(39.3%)马;同样,外套条件很穷(39岁,13.7%)或定期(179年62.8%)。社区(表之间没有显著差异是决定1)。
血细胞比容和血红蛋白的平均值分别为19.0%和10.65 g / dL,分别。26(20.0%)和60(46.2%)马在PCR阳性b . caballi和t .武器装备分别;10例(7.7%)显示混合感染。积极的血液样本b . caballi和t .武器装备显示,98.6% (355/360 bp)同源性b . caballibp (JN217099)和99.1% (231/233)t .武器装备分别(AF261824)。红细胞内含物被观察到在马32例(24.6%)。从这些积极的结果,只PCR证实19(59.3%)看作是积极的。98年(75.4%)样品,夹杂物是没有找到,但在PCR分析57例(43.8%)是积极的两个代理之一。
总共有124(95.4%)的130匹马分析c-ELISA有抗体的两个代理:90 (69.2%)b . caballi和115年(88.5%)t .武器装备;其中,81名(62.3%)抗体两个代理。为b . caballi25(19.2%)样本积极使用c-ELISA和PCR和39(30.0%)-在两个测试。50.0%(65)的样品确认为血清反应阳性的,的存在b . caballi不是通过PCR证实,虽然只有一个血清反应阴性的样本使用PCR取得了积极成果。为t .武器装备,53例(40.8%)样品是积极的和8(6.2%)-使用两种技术。47.7%(62)的血清反应阳性的样品的t .武器装备没有使用PCR证实,而7(5.4%)反应PCR阳性血清反应阴性的样本。表2使用PCR显示马发现积极的分布;显著差异只在PCR的观察t .武器装备Alto Pacuare与其他社区。
泊松回归分析,以及逻辑回归分析,来确定流行病学协会与c-ELISA和PCR的结果,分别与任何条件相关的因素研究并不确定。
4所示。讨论
临床检查,调查显示,大多数的马(196/285,68.8%)有一个身体条件定期和穷人之间,这可能是由于低质量的食物消费或缺乏程序治疗寄生虫。业主表示,他们用草喂马。一年前只有12.3%治疗为寄生虫,而其余(87.7%)没有治疗寄生虫。因此它不能排除消化道寄生可能导致厌食症和憔悴,测定(3]。此外,高水平的观察蜱虫感染(99.3%),马从所有的位置。因为蜱虫不仅向量为梨形虫病也消耗血,这可能影响低比容和血红蛋白值在当前研究中发现(8]。
尽管seroprevalenceb . caballi和t .武器装备决心只从130匹马在土著社区,从受影响最严重的选择影响最小,这是更高(69.2%和88.5%,resp)相比,在优秀的稳定的马在哥斯达黎加(19%和38%,分别地。)22]。此外,这些代理之前没有发现我国通过分子技术。在66.2% (PCR确定这些代理的存在b . caballi20.0%,t .武器装备46.2%)的马进行了分析,发现与测序证实。高存在hemoparasites发现马通过PCR分析是一致的在其他拉美国家(数据报告3,4,24),尽管它必须考虑受影响最严重的马是在目前的研究和分析。
一些研究表明的感染率更高b . caballi而不是t .武器装备(5,25)当别人(26发现大seroprevalencet .武器装备比的b .武器装备,这是与以前的结果一致吉梅内斯等。22在优秀的稳定的中央山谷的马我们的国家和我们的发现。实验结果表明,两个特工在土著社区的区域位于流行,表明piroplasm存在马不会引起严重的疾病。在这方面,7.7%的动物混合感染的临床特征还没有检测到不同的动物比简单的感染(1]。风土性在土著社区的存在可能是由于大量的蜱虫,被发现在不断传播的马和piroplasms从被感染的易感动物。这也可能代表一个潜在的风险原住民个人,因为他们中的大多数生活在靠近他们的动物,可能获得babesial代理通过蜱虫(1,27,28]。
马与积极的PCR和ELISA结果代表动物慢性感染。更大比例的马持续感染t .武器装备而不是b . caballi被观察到,这是在协议与其他报告(6,17,29日]。马与积极的PCR - ELISA结果代表动物最近的感染。此外,在这项研究中,更多的动物和早期检测t .武器装备而不是b . caballi感染。最后,只有大约50%的动物抗体,这意味着这些马最近克服感染(29日];不过这应该进一步研究[6]。应特别注意这一事实的存在更大t .武器装备发现在土著社区,因为这个代理被认为是更多的致病和相关babesial感染人类由于其分类亲密焦microti(原巴贝西虫microti),导致大多数人类的临床病例。虽然b . caballi和t .武器装备(命名为b .武器装备)已报告人间病例血清学阳性1,27,28),世界动物卫生组织认为人类巴贝西虫病是一种疾病,并没有得到充分的研究,不能排除和人群的风险(2]。
血涂片显示灵敏度很低(24.6%)检测hemoparasites,尽管他们是一个简单,便宜,而且有用的工具来诊断疾病的领域(2,6]。
获得的结果在不同的社区差异不显著,这可能是由于相似的气候和生态因素,以及本土个人的方式处理他们的动物,非常相似的四个社区(30.,马是影响最严重的事实。不同的性别、种族、年龄或马似乎没有影响感染的机会b . caballi和t .武器装备与结果一致的Kakoma和Mehlhorn31日),但与吉梅内斯等人的结果。22)报道,优秀的稳定的马在中央山谷牧场和三年以上更有可能是血清反应阳性的b . caballi和t .武器装备,分别。重要的影响变量分析在目前的研究团体之间的马与积极的和消极的结果b . caballi和t .武器装备没有观察到。Body and coat condition were not good in most horses; it was also found that they showed low hematocrit and hemoglobin values, and all animals had ticks. Although not treating the horses for parasites is considered to be an important factor in determining the occurrence of equine piroplasmosis, since it favors the presence of ticks that act as vectors of the disease, this did not turn out to be statistically significant either, given that most animals had not been dewormed [2,12]。
5。结论
与确定性诊断感染动物的能力是重要的是能够提供正确的治疗和预防进一步传播hemoparasite易感动物。本研究证明,使用两个诊断技术,一个直接(PCR)和其他间接(c-ELISA),建议分辨动物追求积极或持续感染。建议原住民社区被告知风险的马和居民感染的感染babesial代理的蜱虫,寄生于动物,和积分蜱虫控制应该在的位置提升研究,寻求预防疾病传播马及其传播本土个人之间。
信息披露
初步结果作为第二十一章国民大会的海报兽药、哥斯达黎加,圣何塞2014年11月11 - 13日。
利益冲突
没有利益冲突声明。
承认
作者要感谢Vicerrectoria de Investigacion所,Heredia,哥斯达黎加。