文摘
在2009年,牛结核分枝杆菌在一群60麋鹿(发现感染Cervus elaphus)和50小鹿(Dama Dama美国内布拉斯加州)。在人口群,牛结核病(TB)的患病率是估计~71 - 75%,基于组织病理学和文化的结果。特别是麋鹿,总值病变通常是严重和广泛的。一年前,大多数的麋鹿被单一检测结核病颈试验(SCT),和都是负面的。初始检测后的结核性在这群麋鹿,42个59的麋鹿被SCT测试。的42 SCT-tested麋鹿,28 TB-infected只有3/28的反应在SCT。SCT后,血清样本收集从受感染的麋鹿和小鹿这群尸体剖检和测试三个抗体检测方法包括multiantigen打印免疫测定,cervidTB STAT-PAK,和双路平台VetTB(民进党)。血清检测灵敏度范围从97%到79取决于测试格式和主机物种。在一起,这些发现证明的机会使用血清诊断结核病的快速检测在麋鹿和小鹿。
1。介绍
养殖鹿代表一个重要的替代畜牧业在新西兰的数字超过200万,100万年在中国,500000年在美国,自400000年至100000年在俄罗斯,加拿大(1]。养殖鹿暴露于各种其他牲畜和自由放养的野生动物和牛群和跨国界之间移动。因此,有一个风险增加之间的传播的传染病和养殖鹿、传统的牲畜、和自由放养的野生动物。此外,许多鹿保存在公园、保护区、狩猎和私人财产,动物,和审美的目的。集约管理促进传染性疾病的传播在这些人群。
牛结核分枝杆菌的一员结核分枝杆菌复杂,有一个广泛的宿主范围比其他物种在这个复杂的疾病,传染给人类,这个物种最常分离出结核牛。自由放养,被鹿也涉及的传播牛分枝杆菌牛(2- - - - - -4和人类5- - - - - -8]。牛结核病的传播在俘虏群美国interherd有紧密的联系和越野运动受感染的鹿(3]。从1991年到2003年,牛分枝杆菌中检测出43个俘虏cervid群(9]。1991年俘虏麋鹿(牛结核病爆发Cervus elaphus)鼓励美国政府和cervid行业领袖统一的方法和规则草案(UMR)根除俘虏cervids牛结核病的最初出版于1994年(3),随后在1999年修订。最近(2004 - 2010),牛分枝杆菌已经检测到3俘虏cervid农场在印第安纳州(麋鹿和其他各种鹿物种),4俘虏白尾鹿牛群在密歇根,1在纽约俘虏群(红鹿Cervus elaphus)和小鹿(Dama Dama),1俘虏群内布拉斯加州(本研究)10- - - - - -12]。此外,分子的应变类型牛分枝杆菌隔绝牛在南达科塔州、内布拉斯加、印第安纳州和肯塔基州匹配的主要菌株牛分枝杆菌在美国俘虏cervids,暗示的传播牛分枝杆菌在这些情况下从俘虏cervids牛。因此,结核病在俘虏cervids继续造成重大的健康和监管问题,对俘虏cervid行业以及牲畜生产商。
在美国,养殖鹿主要是由皮肤测试和监控很少通过屠杀的监测。美国计划要求州际运输-皮肤试验,包括自愿群认证程序;然而,一些养殖鹿业主参与了后者。潜在的低参与的原因包括处理设施不足,造成伤害和死亡处理事件,可怜的知觉的所有者在cervids特异性皮肤测试,和减少由于慢性消耗性疾病有关的限制州际运动在美国。cervid生产商,blood-based结核病测试初始监测可能会增加参与。最近的研究证明了新兴的基于抗体的检测化验的潜力用于cervids [13- - - - - -18]。
本报告描述的诊断牛分枝杆菌感染的麋鹿和小鹿农场普遍的疾病。特别是,详细的病史,诊断技术(即标准。,slaughter surveillance, skin test, necropsy, histology, and mycobacterial culture), and emerging serologic methods are provided.
2。材料和方法
2.1。群历史
群由50小鹿和60麋鹿(包括参与这次调查59麋鹿和结核病指数情况下检测到今年1月,2009)。定期测试了麋鹿群SCT结核病群认证程序的要求(19]。小鹿并非由SCT测试主要是由于业主的担忧handling-associated受伤。指示病例被发现后,尽可能多的动物(48小鹿和52麋鹿)进行尸检结核病。采集样本进行组织病理学和文化只从那些有严重病变的动物结核病的暗示。
2.2。单颈皮肤试验(SCT)
SCT应用根据美国农业部根除牛结核病,UMR [3,19]。
2.3。分枝杆菌的分离和鉴定
组织的隔离处理牛分枝杆菌如前所述(20.)使用的组合BACTEC 460辐射系统,BACTEC分枝杆菌生长指示管(MGIT) 960系统(和公司正欲,火花,医学博士,美国),和4管的固体介质。坚实的媒体包括2管7 h11和OADC补充,丙酮酸,牛血清,和细胞溶解羊血(美国国家兽医服务实验室,艾姆斯,IA)和1管每7 h10补充OADC,丙酮酸(美国国家兽医服务实验室,艾姆斯,IA),和Mycobactesel LJ (Becton Dickinson和公司,火花,医学博士,美国)。隔离的牛分枝杆菌通过结合Ziehl-Neelsen抗酸的染色,核酸探针(AccuProbe Gen-Probe,圣地亚哥,美国),和spoligotyping(罗勒属Biosolutions有限公司、海得拉巴,印度)。识别的典型分枝杆菌。是16 s核糖体DNA测序(21)和生化概要文件。序列被确定通过使用一个分枝杆菌物种序列数据库(22]。
2.4。组织病理学
Formalin-fixed组织处理和苏木精和伊红染色。任何肉芽肿病变被沾修改Ziehl-Neelson过程(23]。在最初的动物的群疑似结核病基于组织病理学,PCR是6110,的标识结核分枝杆菌复杂的细菌,进行formalin-fixed,石蜡包埋组织。测试协议遵循先前描述的方法(24]。
2.5。Multiantigen打印免疫测定(MAPIA)
执行MAPIA如前所述,Lyashchenko et al。16,25]。的面板牛分枝杆菌抗原包括ESAT-6、CFP10 MPB59、MPB64 MPB70, MPB83, 16-kDa蛋白(HspX) 38-kDa蛋白(PhoS1 / pst),和Mtb8 (SecE2);三个融合蛋白组成ESAT-6 / CFP10 16-kDa蛋白/ MPB83和F10 (F10由CFP10 secE2, PhoS1 / pst);两个本地抗原,牛分枝杆菌产后抑郁症(B-PPD)和文化滤液(MBCF)。
2.6。CervidTB STAT-PAK测试
的CervidTB STAT-PAK工具包(梅德福Chembio诊断系统公司,纽约,美国)是一个侧流试验用于特定抗体的快速检测结核分枝杆菌复杂的抗原、ESAT-6 CFP10, MPB83 [14,16]。设备包括一个塑料盒包含一条硝化纤维膜浸渍抗原。试验采用蓝色乳胶微粒与ESAT-6涂布,CFP10, MPB83。二十μL血清和3滴样本稀释剂添加顺序对样品垫。结果是在20分钟读视觉。测试的任何强度的存在被认为是一个积极的结果而没有带测试区域被认为是一个负面的结果。
2.7。双路径(民进党)VetTB测试平台
创新民进党技术利用两个硝基条连接在一个“T”形盒内的设备(26]。这允许独立的测试样品和antibody-detecting试剂测定反应区,与上体验过单条格式用于CervidTB STAT-PAK测试。两个重组抗原,MPB83和CFP10 / ESAT-6融合蛋白,固定在测试条作为独立乐队,允许独立检测每个抗原抗体反应。五μL(血清用于试验,并在20分钟读视觉结果。两个测试的任何乐队被记录作为一个积极的结果虽然没有测试带被认为是一个负面的结果。
2.8。测试性能
两个快速测试格式(CervidTB STAT-PAK和民进党VetTB测试)测试性能进行评估。数据提出了%敏感性((TP / TP + FN)×100), %特异性((TN / TN + FP)×100),和%的准确性((TP + TN) / (TP + FP + TN + FN)×100), TP的地方:真阳性,TN:真正的负面,外交政策:假阳性,与FN:假阴性。
3所示。结果与讨论
3.1。病历、皮肤试验和验尸结果
一个时间表提供调查行动和相关动物提供数据表1。指示病例被确定在常规屠杀监测检验(2009年1月30日)当多个肉芽肿内确定了麋鹿的尸体的胸肺和淋巴结源自一个俘虏cervid农场在诺克斯县,内布拉斯加州。美国农业部国家根除牛结核病的一部分计划,组织提交国家兽医服务实验室的组织病理学和文化。组织病理学显示肉芽肿性肺炎和淋巴腺炎与抗酸的细菌。PCR固定组织的识别结核分枝杆菌复杂的DNA在2月12日,2009年牛分枝杆菌随后被孤立的文化。大约10个月前,50/60麋鹿在这群被SCT测试,和所有-包括索引病例。检测后牛分枝杆菌来华的麋鹿,42岁的剩余59麋鹿被SCT测试2月/ 2009年3月;3/42 SCT-positive, 3 SCT积极的麋鹿被安乐死,检查后期(2009年3月31日)。只有42考验SCT由于动物处理和管理问题。所有3麋鹿总值和微观损伤符合肺和胸膜结核;PCR证实结核分枝杆菌复杂的(2009年4月3日);牛分枝杆菌随后被孤立的文化在所有3 SCT-positive麋鹿(2009年5月15日)。小鹿()在这个混合群并非由SCT测试主要是由于处理问题;然而,当他们被混杂牛分枝杆菌来华的麋鹿,他们被认为是TB-exposed。群的发现检疫发起并最终灭绝的麋鹿和小鹿的前提。
大约2个月后牛分枝杆菌中检测出3 SCT-positive麋鹿,影响群内的剩余动物安乐死在农场或在当地屠宰场。尸检完成52的麋鹿,其中39总值病变暗示的结核病,进一步证实了文化和/或组织病理学。大多数的麋鹿在多种组织结核性损伤,肺损伤(,图1 (b))最常见,其次是胸腔淋巴结病变(),胸膜病变(),腹部淋巴结病变(),并在头部淋巴结病变()。总检查,肺结核病变出现1毫米至10厘米炎症群众有一个黄色的液体坏死中心(图1(一))或质量固体表面上减少和频繁的矿化。在48个小鹿,尸体剖检完成后,34小鹿总值病变暗示的结核病,被文化和/或组织病理学证实。大多数的小鹿在多种组织损伤,与胸淋巴结病变是最常见的(),其次是在腹部淋巴结病变(),头部病变淋巴结(),肺部病变()。病变是高度可变的大小,绝大多数总出现脓肿。一般来说,总在麋鹿病变更严重比小鹿。基于组织病理学和/或文化的结果,结核病的发病率约为~ 71 - 75%(小鹿:34/48;麋鹿:40/53,包括索引从1月30日,2009)。
(一)
(b)
显微镜下,结核病与罕见的病变包括肉芽肿或pyogranulomas大量抗酸的细菌(图2)。受感染动物组织学病变非常变量之间动物结核病cervid物种(如前所述27- - - - - -30.]。简单地说,一般有三个亚型的病变在麋鹿和小鹿。第一种病变包括主要包含以巨噬细胞为主的可变大小的焦点,和上皮样细胞,以及低数量的多核巨细胞(Langhans)。淋巴细胞和浆细胞和少量的纤维结缔组织混杂在一起,小淋巴细胞聚集。这些病变通常是多病灶的合并,但缺乏一个中央坏死细胞碎片。第二类型的病变是类似于经典的结节通常观察到牛感染牛分枝杆菌。这些病变的干酪样坏死核心变量包含大量的矿化坏死碎片。边缘的损伤是由巨噬细胞、上皮样细胞,淋巴细胞,浆细胞,和偶尔的多核巨细胞(Langhans)。有经常在最外面的一层薄薄的纤维带的利润率。第三种类型的病变也有一个大型中央坏死区;然而,中央核心包含大量的中性粒细胞和退行性中性粒细胞。中性粒细胞延伸到边缘周围的巨噬细胞,上皮样细胞,淋巴细胞,浆细胞和纤维结缔组织。pyogranulomas肺组织中确定时,相邻的细支气管和肺泡经常充满了蛋白质的液体,中性粒细胞和堕落的中性粒细胞。
牛分枝杆菌被文化孤立病灶在麋鹿34/59和32/50的小鹿。基于文化,结核病的发病率约为58 ~ 64%麋鹿和小鹿。多分枝杆菌分离株恢复从一个麋鹿和两个小鹿;牛分枝杆菌从这三个中恢复过来,m . thermoresistibile也从麋鹿,m . avium复杂的两个小鹿。m . avium从一个小鹿也恢复了吗牛分枝杆菌没有恢复。所有牛分枝杆菌从这个爆发有同样的spoligotype隔离,八进制代码666773677777600。这spoligotype最初出现在一个隔离恢复从一个麋鹿居住在纽约州,1991年以来偶尔重现cervid牛群在美国(Robbe-Austerman和哈里斯,未发表的观察)。
25的39个麋鹿测试- SCT大约3个月前验尸了微观损伤符合结核病和含有抗酸的细菌和/或牛分枝杆菌文化孤立的病变。考虑初始3作为SCT响应被识别,SCT的敏感性在麋鹿在这个群(3/28)出人意料地低。因为所有麋鹿被认为暴露,SCT的特异性是不能确定。
3.2。MAPIA
血清收集来自34个麋鹿(所有前SCT - ~ 3个月)和32小鹿(不是考验SCT)从内布拉斯加州herd-all 66只动物被认为是基于组织病理学的结核性和文化的结果。收集的血清并不是3 SCT-positive麋鹿。广泛的反应性与单牛分枝杆菌抗原(即。,ESAT-6, CFP10, MPB70, and MPB83), fusion proteins (i.e., F10, ESAT-6/CFP10, and the 16-kDa protein/MPB83 fusions), and complex antigens (i.e., B-PPD and MBCF) was detected with sera from elk (Figure3)。较小的频率,但检测反应被认为与Mtb8 MPB64抗原。最小和MPB59没有观察到的反应,16-kDa蛋白质,38-kDa蛋白质。
(一)
(b)
抗体反应通常是更健壮的小鹿在麋鹿(图相比3)。主要抗原识别模式类似麋鹿和小鹿之间,虽然不太频繁的反应ESAT-6和CFP10抗原检测血清的小鹿。MAPIA是积极的在28/34(82%)在31/32(97%)结核性结节状的麋鹿和小鹿。抗原抗体反应的速度以及识别模式发现MAPIA在目前的研究似乎是在协议与以前的报告麋鹿实验感染牛分枝杆菌(14]。
3.3。CervidTB STAT-PAK和民进党VetTB测试
两个快速检测评估测试灵敏度与血清从这群(麋鹿,小鹿;所有66人患有结核病)。此外,血清未感染麋鹿()和小鹿()来自已知TB-free牛群从蚜虫,NVSL牛结核病血清特异性银行评估测试。研究的结果发表在表2(麋鹿)和表3(小鹿)。结果表明高敏感性和特异性的与麋鹿测试格式(se: 79 - 82%, sp: 93 - 98%)和小鹿(se: 91%, sp: 91 99%)。民进党VetTB分析更准确比CervidTB STAT-PAK测试(94 - 97%和91%,分别地。)在这两个cervid物种。这些结果支持血清学诊断的潜力CervidTB STAT-PAK和民进党VetTB测试之前所示数cervid物种(13- - - - - -16]。
3.4。Seroreactivity每个测试的动物个体
一般来说,个别动物的seroreactivity测试格式之间是相似的。与TB-infected麋鹿血清,所有(即3测试。,CervidTB STAT-PAK, DPP VetTB, and MAPIA) were positive with 27/34 samples. All 3 tests were negative for TB-infected elk numbers 5, 14, 20, 22, 25, and 29. The DPP VetTB test was also negative with TB-infected elk number 33. With TB-infected fallow deer sera, all 3 tests were positive with 29/32 samples. CervidTB STAT-PAK and DPP VetTB tests were negative with TB-infected fallow deer numbers 58 and 59 and all three tests were negative with fallow deer number 51. These findings demonstrate high concordance between the serological tests used in the present study. MAPIA band intensities (indicative of levels of antibody reactivity with antigens) were generally greater in elk than those observed in fallow deer (Figure3),可能是由于之前更先进的疾病或注入SCT产后抑郁症的麋鹿。这些结果表明,高流行的牛分枝杆菌感染了这种混合cervid群在2009年初最初发生在麋鹿。麋鹿可能未能产生SCT响应2008年3月(也观察到2月/ 2009年3月),可能将感染给小鹿在夹杂着麋鹿。疾病严重程度较轻和较低的水平牛分枝杆菌特殊抗体支持假设感染前发起的麋鹿群小鹿。然而,疾病进展和发展牛分枝杆菌特殊的反应可能不同,可能值得注意的是,这两个主机之间的物种;因此,目前尚不清楚哪些物种最初被感染。
独特的发现这种情况下报告包括这群不同寻常的高传染性结核病和SCT出人意料的低灵敏度的麋鹿。而纯粹的投机,疾病的高发病率可能是由于一个扩展过程中感染的病变的严重程度。SCT失败的原因可以解释为无力与晚期疾病相关的细胞介导免疫反应或特定的宿主因素。坊间证据支持的潜力优势麋鹿各种细胞内病原体的抗体反应(水域,未发表的史蒂文•奥尔森观察和个人通信)。另一种可能性,尽管不太可能,在麋鹿发生疾病进展非常迅速,发展一段时间后SCT。然而,之前的研究与实验感染结核病cervids不会支持这样一个迅速发展的疾病(14,24,30.]。进一步的研究是必要的”来形容免疫反应的麋鹿和小鹿各种细胞内病原体,特别是牛分枝杆菌。
本研究的局限性包括SCT,并非所有的动物在那里进行评估、尸体剖检,文化,和血清学;收集的样本进行组织学和文化只有动物总损伤;SCT执行3个月前验尸以确定疾病状态;血清学的灵敏度分析确定只有进行动物严重病变。
4所示。结论
呈现调查结果表明(1)异常高发的一个例子(~ 71 - 75%)的感染和严重程度的麋鹿和小鹿群内布拉斯加州,美国(2)出人意料地可怜的敏感性检测结核性SCT的麋鹿在这个群,和(3)机会快速血清学的检测使用牛分枝杆菌感染俘虏麋鹿和小鹿。
确认
作者非常感谢(1)Drs的支持。威廉树桩(美国农业部蚜虫VS-Nebraska)和布莱恩·阿彻(NVSL、蚜虫、农业部、堪萨斯)与样本收集、准备和运输记录;(2)Drs。w·哈奇森(美国农业部食品安全检验局)和玛莎爱尔摩(NVSL、蚜虫、农业部、内布拉斯加)后期考试屠宰工厂和农场,分别;(3)许多其他NVSL、蚜虫、美国农业部,内布拉斯加州农业部,和内布拉斯加州的游戏和公园委员会组织和协助调查;(4)优秀的技术援助与血清学测试的克劳迪娅·奎因。美国农业部是一个平等机会提供者和雇主。提到的贸易名称或商业产品在这个刊物的目的仅仅是为了提供特定的信息,并不意味着美国农业部推荐或认可。