脑内游离血红蛋白测定颅内出血的严重程度取决于抗凝剂的种类:实验数据

抽象

背景和目的。抗凝治疗被广泛用于预防血栓栓塞事件。颅内出血是抗凝治疗的严重并发症，尤其是与华法林。直接口服抗凝剂降低，但不排除颅内出血的危险。这项研究的目的是确定应用抗凝剂，无需额外触发后颅内出血的程度。方法。采用不同抗凝药物(维生素K拮抗剂、肝素、直接凝血酶抑制剂和Xa因子抑制剂)对大鼠进行治疗。用脑实质中游离血红蛋白浓度来评估脑出血。结果。维生素K拮抗剂（华法林和溴鼠灵）在大脑显著上升游离血红蛋白。在直接口服抗凝血剂，凝血酶抑制剂达比加群也显著在大脑中增加的游离血红蛋白，而与Xa因子抑制剂利伐沙班治疗并没有对游离血红蛋白浓度显著的效果。结论。我们的数据表明，脑溢血的严重程度取决于抗凝血类，它更与维生素K拮抗剂明显。

1.简介

抗凝治疗是血栓栓塞事件高危患者的标准护理，最明显的是房颤或静脉血栓栓塞。华法林仍是最常用的处方抗凝药物，近年来直接口服抗凝药物(DOAC)在市场上迅速普及。华法林对血栓栓塞事件提供可靠的保护。然而，这种益处是有代价的，这是由于华法林相关凝血障碍引起的出血。可能与华法林有关的最令人恐惧的出血事件是颅内出血。华法林相关性颅内出血的发生率为1-5%，占所有颅内出血的10-12%。这些病人的死亡率高达50% [1]。DOAC，如直接凝血酶抑制剂（达比加群）和Xa因子抑制剂（利伐沙班和阿哌沙班），减少但不能完全避免颅内出血的危险[2]。

本研究的目的是探讨颅内出血是否与抗凝剂的种类有关。

2.材料和方法

所有实验均按照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南进行，并得到机构动物护理和使用委员会的批准。成年雄性斯普拉格·道利大鼠(180-220克，哈兰实验室，印第安纳波利斯，IN)被随意提供食物和水。动物被随机分配到治疗组。

几类抗凝血剂使用：（1）维生素K拮抗剂：溴鼠灵（BDF）和华法林（二者均来自Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO）;（2）直接凝血酶抑制剂达比加群（Pradaxa，勃林格殷格翰制药公司，里奇菲尔德，CT）;（3）Xa因子拮抗剂利伐沙班（利伐沙班，詹森Pharmaceuticals公司，贝尔泽，比利时）;（4）间接的凝血酶和因子Xa抑制剂肝素（费森尤斯卡比美国Schaumburg，IL的）。The following routes and doses were used for the medications: BDF: oral gavage, single administration 0.4 mg/kg (median lethal dose, LD50) [3.];warfarin per os in drinking water 2 mg/kg/day for 5 days [4];达比加群:口服灌胃，单次给药150 mg/kg (LD50) [5];rivaroxaban: oral gavage, single administration 20 mg/kg (LD50) [6];heparin: subcutaneous single injection 100 KU/kg (LD50, MSD). These doses are based on different pharmacokinetics and pharmacodynamics of these drugs in rats as compared to humans.

5天后进行对于大多数药物（除了进行7天给予华法林）与抗凝血剂治疗。死亡率为记录;存活动物在第5天（华法林7天以实现在凝血酶原时间（PT）期望的增加）处死。

正如我们前面所描述[PT被每天测量在从尾得到的血3.,4,7]。所有大鼠(死于过度抗凝，活鼠)均解剖;进行开颅手术，在正中矢状面取出大脑并切开。左脑分为3个部分:前脑(包括额叶)、后脑(包括顶叶、颞叶和枕叶)和小脑。这3部分大脑被冷冻在- 80°C，以进一步评估游离血红蛋白。

通过脑组织检查和脑实质中游离血红蛋白浓度来评估颅内出血。游离血红蛋白的测定采用Drabkin试剂，该试剂基于修改后的制造商协议。根据校准曲线计算脑组织每克总血红蛋白浓度。

2.1。统计

使用Prism软件（格拉夫派得软件公司，拉霍亚，CA）进行统计分析。（ANOVA）测试，随后postanalysis Tukey多重比较试验组之间的差异通过方差分析进行分析。与差异 被认为具有统计学意义。

3.结果

与BDF和肝素处理导致至少50％的死亡率（第2天为BDF和肝素1天）。与其他抗凝血剂治疗是不是致命的。维生素K拮抗剂治疗导致上述4中PT和SINR的快速增加[3.]。

颅内出血没有严重尸检在任一治疗组中理解。然而，显微镜检查显示，与BDF治疗的动物微观间质性出血，而不是其他抗凝剂（图1(一)- - - - - -1 (c))。

的游离血红蛋白浓度测量的结果显示在图2。与BDF治疗导致大脑的所有三个隔间中游离血红蛋白一个显著上升。另一种维生素K拮抗剂，华法林，导致只有前脑在游离血红蛋白浓度的显著增加。与华法林治疗的游离血红蛋白浓度在后脑动物增加，但没有达到统计学差异显著（图2)。直接使用凝血酶抑制剂达比加群治疗可导致3个脑区游离血红蛋白浓度升高，但仅在前脑和小脑有统计学意义。肝素和Xa因子抑制剂利伐沙班均未显著增加脑内游离血红蛋白(图)2)。

4.讨论

我们的工作是首次描述不同抗凝治疗后自发性脑出血的差异。以往的研究主要集中在不同抗凝剂在实验性(诱导)颅内出血中的作用。

抗凝是一种挽救生命的治疗，它被广泛应用于临床实践。既维生素K拮抗剂和DOAC与具有高死亡率的颅内出血相关联2]。这些颅内出血的数据有关的机制是有争议的。这也不清楚是否这些出血与抗凝过度相关或他们本身抗凝治疗的结果。它已被证明在住院，大多数患者的华法林相关的颅内出血有INR的治疗范围。然而，较高的INR已与死亡率增加患者谁开发颅内出血有关[8]。我们的研究结果支持这些临床观察。在大脑中的游离血红蛋白浓度最显著上升主要出现在与维生素K拮抗剂治疗的动物。当维生素K缺乏相关的抗凝严重（如情况与BDF），在大脑中增加的游离血红蛋白更显著，并在所有脑车厢看到。在另一方面，当抗凝与维生素K拮抗剂是类似于在临床实践（INR增加4-5倍）看到的那样，然后在游离血红蛋白的显著上升仅在所述前脑，而在后大脑或游离血红蛋白小脑增加不显著（图2)。事实上，已经证明华法林相关的患者颅内出血主要是脑实质内的[1]。有趣的是，直接凝血酶抑制剂达比加群不仅使前脑的游离血红蛋白显著增加，而且也使小脑的游离血红蛋白显著增加。另一种DOAC, Xa因子抑制剂，没有增加任何一个脑室的游离血红蛋白浓度，但有增加小脑的游离血红蛋白的趋势(图)2)。

我们的数据得到了先前观察的支持。已有研究表明华法林可显著增加血脑屏障(BBB)通透性[9]和溶栓后继发性出血[10]或胶原酶诱导的颅内出血[11]。有数据利伐沙班不增加出血溶栓后实验缺血性脑卒中的小鼠9];然而，其他研究表明，利伐沙班实质上增加在小鼠中诱导胶原酶颅内出血血肿量[12]。同组报告了类似的结果处理实验动物的达比加群后[13]。另一方面，达比加群并没有显著增加小鼠短暂局灶性脑缺血后的出血性转化[14]或不同鼠类缺血再灌注模型溶栓后继发出血的风险[10]或胶原酶诱导的颅内出血[11]。我们和其他人报告说，华法林和达比加群都引起肾小球出血肾脏[4,15]。

我们研究的局限性包括单次超治疗剂量的抗凝剂和难以比较抗凝的程度。我们使用的LD50剂量之前已经在大鼠身上描述过;这些剂量明显高于人类临床使用的剂量;因此，更详细的研究，将包括这些和其他抗凝剂的剂量反应效应是必要的。

总之，我们的实验数据证实了最近的临床试验结果是DOAC减少但不能完全避免与抗凝治疗相关的颅内出血。间DOAC，因子Xa抑制剂在脑下部自由血红蛋白浓度利伐沙班的结果相比时，直接凝血酶抑制剂达比加群。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究是支持的，部分由美国国立卫生研究院资助U01 NS083457（谢尔盖·布罗德斯基，道格拉斯L.范士丹和以色列鲁宾斯坦）和病理科的启动经费，俄亥俄州立大学（谢尔盖·布罗茨基）。

参考文献

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