CD133作为黑素瘤干细胞潜在标记的抗原：体外和体内研究

摘要

黑素瘤是最危险的皮肤癌类型。癌症干细胞(CSCs)被怀疑是癌症复发和癌症治疗失败的原因。CD133是一种检测黑色素瘤CSCs的潜在标志物。在小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10上进行实验。采用免疫磁细胞分选技术分离CD133+细胞。分离后评价CD133+、CD133-和CD133+/-的增殖和克隆潜能。在C57BL/6J小鼠模型上观察CD133+和CD133-细胞诱导肿瘤的潜能。测试了三种不同的细胞数量(100、1000、10000)。分析肿瘤形态、有丝分裂数和肿瘤坏死面积。平均分离到0.12%的CD133+细胞。 Compared to CD133- and unsorted CD133+/- cells, CD133+ cells were characterized by the higher proliferative and clonogenic potential. These properties were not confirmed在活的有机体内在小鼠模型中，CD133+和CD133-细胞均可诱导肿瘤生长。有丝分裂数、肿瘤坏死面积无统计学差异。同时检测CD133抗原和其他标志物是准确鉴定这些黑色素瘤干细胞的必要条件。

1.介绍

黑素瘤是最危险的皮肤癌类型。每年全球每年诊断大约132000例新的黑素瘤病例[1］．澳大利亚的发病率最高;在欧洲，瑞士和斯堪的纳维亚国家的发病率最高，希腊和罗马尼亚的发病率最低[2，3.］．黑素瘤只占皮肤恶性肿瘤的4%，但在这些癌症类型造成的死亡中，黑素瘤是79%的原因[4］．

在文学中，我们可以找到关于癌症发展的不同理论;其中一个包括癌症干细胞（CSC）的贡献。包括CSCs的假设假设肿瘤质量是高度异源的，包括许多在其分化水平中变化的细胞[5］．CSC可以导致许多不同癌症的发展，进展和无效治疗。直接靶向这种细胞类型的疗法可导致完全肿瘤去除。与建立肿瘤质量的其他细胞相比，CSCs对化疗更具耐化疗，这就是为什么它们可能对癌症复发负责的原因[6，7］．CSC可以被特征标记识别;其中一个是CD133（PROMININ1，AC133），一种存在于许多正常祖细胞和癌细胞的表面上的细胞膜糖蛋白，包括黑素瘤[8- - - - - -10.］．CSC也称为癌症引发细胞，这意味着这些细胞的植入可以导致注射地点的肿瘤发育。CSCS需要适当的环境和干细胞利基，控制其功能，这就是为什么CSCS在注射后通过不同效率产生肿瘤的原因，具体取决于所选的植入地点[11.，12.］．

本研究从小鼠黑色素瘤细胞系(B16-F10)中分离出CD133阳性细胞(CD133+)，并与阴性(CD133-)和异质(CD133+/-)细胞进行形态学和生长特性的比较。此外,在活的有机体内进行小鼠模型的实验以检查表达CD133标记的癌症黑素瘤细胞是否具有与群体相比具有不同该标记物（CD133-）的肿瘤诱导的性质。

2.材料和方法

２.１.B16-F10细胞培养

B16-F10小鼠黑素瘤细胞系购自美国型文化收集（ATCC，Mannassas，VA，USA）。细胞were cultured in the DMEM/Ham’s F12 medium (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, HyClone, Chicago, IL, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA) and antibiotics (penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μ.G / ml，两性统法B 5 μ.G / ML，Sigma-Aldrich，Saint-Louis，Mo，USA），在37°C的标准条件下为5％CO₂和98%的湿度。每2-3天更换一次培养基。使用标准的0.05%胰蛋白酶溶液(Biomed, Lublin，波兰)和0.5 mM的EDTA (POCH, Gliwice，波兰)，当细胞达到70-80%的融合时传代。台盼蓝染色计算细胞数。

2.2。CD133 +黑素瘤细胞的分离

使用CD133 MicroBeads Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)分离出具有潜在CSC表型的细胞。按方案经胰蛋白酶分解、离心，并计算细胞数，300μ.l缓冲液(含PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)， 100μ.FcR阻断试剂100μ.分别加入l的CD133 MicroBeads到最终体积500μ.l（值 细胞）。在每步后，混合细胞悬浮液。在4℃温育30分钟后，向制备的混合物中加入4.5ml缓冲液后。将混合物离心（10分钟，700×G，4℃），并将得到的细胞沉淀重悬于500 μ.l缓冲液(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)。CD133居群分离自平均水平 B16-F10细胞。

使用免疫磁性分选技术分离CD133 +细胞。将细胞施加到置于磁场中的分离柱上。与保留在柱中的珠子连接的阳性细胞，而CD133-细胞通过。最后，从磁场中除去柱，用适量的缓冲液冲洗CD133 +群体。对于进一步的实验，分别检查所有三种群体（CD133 +，CD133-和CD133 +/-异质群体）。

2.3。流式细胞仪

为了确认CD133 +细胞的成功分离，用流式细胞术检查它们的表型。根据制造商的建议，所有三种种群染色了CD133-PE抗体（克隆AC141; Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Bergisch Gladbach，德国）。立即用BD FacScanto II（BD Biosciences，USA）立即分析染色细胞。除了分离的CD133 +细胞外，收集了至少50000个事件，因为少量细胞收集了20000个事件。使用FlowJo V10（Becton，Dickinson和Company，USA）分析了获得的数据。

2.4。实时细胞生长分析

使用X-Celligence系统(Accela, Prague, Czech Republic)进行实时细胞生长分析。细胞以两种不同密度播种在e板16(捷克布拉格Accela)上( 细胞/ cm.²， 细胞/ cm.²)，每种密度分别印在单独的印版上。CD133+和CD133-分别培养5个重复，未分类细胞4个重复;每个盘子上的两个孔只填满作为背景的培养基。细胞在培养箱的标准条件下培养。以细胞增殖为指标。电池指数是由置于e板底部的电极测量的无单位参数。电极测量粘附细胞引起的电子流的阻抗。阻抗会受到细胞数量、大小和形态等参数的影响。每30分钟测量一次。为10天。 Cell growth curves were plotted as a dependence of cell index from the time of culture.

2．5．单独分析

分别分析CD133+、CD133-和未分选细胞(CD133+/-)。每个细胞片段接种在6孔培养板上，每孔含有10、100或1000个细胞。每个实验共6个重复。培养皿在标准条件下孵育6天。培养基换了两次。实验结束后，去除培养基，在每孔中加入0.5%中性红(Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)进行菌落可视化。细胞与染料在37°C孵育10分钟。然后，去除中性红，用PBS冲洗孔。倒置光镜下观察和计算细胞菌落。结果显示为克隆生成指数，该指数由菌落数除以初始种子细胞数得到。 Three colony types were analyzed. Cells can grow in the compact and round colonies (holoclones), loose irregular colonies (paraclones), or can have intermediate features (meroclones) [13.］．

2.6。体内评价CD133 +细胞引发肿瘤的能力

的目的是在活的有机体内实验是根据CD133表面标记物的表达来确定潜在CSCs的肿瘤启动能力。将细胞移植到C57BL/6J小鼠体内，该小鼠是推荐的B16-F10细胞受体。这项研究是在78只平均体重20克、6-8周的雄性小鼠身上进行的。所有实验都得到了波兰地方伦理委员会的批准，许可号为29/2009。

动物被分为6个相等的组(每组13只)。CD133+或CD133- 3种不同数量的细胞( ， ，和 ）悬浮在0.5 ml PBS中，在小切口手术过程中植入腹腔内。随访6周;之后，采用腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg安乐死。腹层沿中线切开。癌症肿瘤被分离，称重(所有从一个病灶分离的肿瘤和一只动物一起称重)，并放入4%磷酸缓冲福尔马林进行进一步的组织病理学分析。材料包埋在石蜡中，切开，并用苏木精和伊红染色。

2.7。有丝分裂号码

有丝分裂指数由两位独立研究者评估。在光镜下用40倍放大率在三个视野下计数核分裂象。对样本进行盲法分析。根据B16-F10 CD133+或CD133-细胞植入后形成的肿瘤数量，至少11个独立测量的平均值显示了结果。对所有肿瘤进行有丝分裂指数检查。

2.8。肿瘤坏死的区域

肿瘤坏死区域由两名独立研究者评估。分析在100倍放大的光学显微镜下进行。对样本进行盲法分析。根据B16-F10 CD133+或CD133-细胞植入后形成的肿瘤数量，结果显示为至少11个独立测量值的平均值(百分比)。所有肿瘤均进行坏死区检查。

2.9。统计分析

通过具有非参数方法的Kołmogorow-smirrow测试计算测试基团之间的统计差（Mann-Whitney试验，用于比较两组和Kruskal-Wallis试验，以比较> 2组）。在IBM SPSS 23.0（SPSS，Cracow，Poland）中分析了数据。意义程度 作为有意义的。

结果

3.1。CD133 + B16-F10细胞的成功分离

磁性激活的细胞分选（Mac）导致获取 CD133 +表型的细胞。这些结果作为8种不同分离的平均值呈现。流式细胞术分析证实了成功的CD133 +细胞分离（图1）.

３．２．细胞形态在被测细胞群之间缺乏差异

在分析的群体（CD133 +，CD133-和CD133 +/-）之间的24,48,72和96小时后，显微镜观察结果显示出B16-F10细胞形态的差异。在48小时后，所有分析的组中细胞生长相同。在四天内，所有文化达到100％汇合（图2（c））.

3.3。与CD133和未侵蚀B16-F10细胞相比，CD133 +的不同增长模式

B16-F10 CD133+、CD133-和CD133+/-细胞以 /厘米²最初表现出统一的对数生长（图2(一个)）.但从第2天开始，CD133-和未分选细胞(CD133+/-)的生长速度略快于CD133+细胞。在试验的第3和第4天，各群体间的细胞生长只有很小的差异。细胞同时达到最大的生长高峰，大约在观察的第6天。密度下的细胞对数生长期差异有统计学意义 /厘米²在CD133 +细胞和CD133和异质CD133 +/-细胞群之间显示（ ）.

采集密度细胞生长的实时分析 /厘米²显示所有测试人群最初都以相同的水平增殖(图2（b））.第2天，CD133+细胞开始快速增殖，第3天达到稳定期(平台期)，而CD133-和未分类的CD133+/-细胞继续呈现对数增长，第5天达到稳定期。CD133+细胞生长速度越快，进入静止期越早，可能由于细胞脱离导致增殖减少。CD133-和未分类的CD133+/-细胞之间的细胞生长没有差异。在对数生长期，以 /厘米²， CD133+细胞与其他测试群体之间的差异有统计学意义( ）.

3.4。B16-F10 CD133 +群体产生更多的殖民数量和全阵容的最高速率形成

根据细胞的表型及其播种密度的克隆源潜力如图所示3.．在表达CD133标记的细胞群中观察到最大数量的菌落。在CD133 +群体中发现了单细胞的最高菌落形成率（88.3％）。CD133 +和CD133-细胞之间存在统计学上显着的差异（ ）.为种子组 在细胞中，显示CD133抗原存在的细胞和其他群体之间产生的菌落数量有统计学意义的差异。克隆原性潜力最低的组为 种子细胞。然而，菌落数之间的差异没有统计学意义（ ）.

除了CD133细胞外，每个细胞群都形成了全克隆形态的菌落，使用最低的细胞数量(10个细胞)播种(图)2（c））.只有1.9％和1.3％的菌落分别是未溺食CD133 +/-细胞培养物和CD133-的核石。CD133 +细胞显示全阵菌落形成的最高速率（2.3％）。发现群体之间的统计学显着差异（ ）.

3.5。CD133 +和CD133-B16-F10细胞之间的肿瘤形成缺乏统计学意义

在植入的小鼠9天后开始出现肺炎肿瘤 细胞，并在12天后植入 细胞。14-17天后，在注射后，肿瘤发育导致15只动物死亡（包括CD133 +组和CD133-组中的7个动物） 注射后，细胞和18只动物（包括CD133 +组中的10个动物和8中的8个） 细胞。20-22天后，肿瘤致死2只小鼠 CD133 +组和2来自 CD133-组。其他动物在6周的随访中幸存下来（表S1）.诱发肿瘤的数量最多的是实验组小鼠 CD133+组有12/13个个体(92%)，CD133-组有10/13个个体(77%)。肿瘤迅速扩大，在植入部位生长，并很快导致动物死亡。在接受治疗的群体中 细胞，肿瘤过程发生在9/13（69％）小鼠中，植入CD133 +群体和7/13（54％），CD133-群体。这些小鼠还显示出最先进的癌症，肾脏，肝脏和隔膜具有许多转移。在另一组中，肿瘤在植入部位的腹膜腔中最常见，转移性病变少得多。植入细胞数量最低的组中发生最低的发病率（ ），CD133+组为7/13 (54%)，CD133-组为5/13(38%)。这些组的肿瘤体积很大，但生长缓慢，不会导致动物的快速死亡。CD133+组肿瘤总数约高出27% (133 vs. 105; ）.在存活率的情况下，大约15％的小鼠完成了CD133-组的后续（ ）.

我们决定把同一组的所有动物放在一起分析，而不考虑存活率，因为较高的死亡率表明疾病的显著进展。此外，对每组的所有动物进行组合，允许接收适当数量的动物进行统计分析。

在组之间比较了发育肿瘤的数量（ ，表格S1）.注射CD133 +细胞在受体生物体中引发了56个肿瘤灶的出现，约22％（ ）多于注射CD133片段后(46个肿瘤病灶)。

肿瘤位于细胞施用部位，在腹膜腔内（在47个受试者中），隔膜（17），肾脏（15），肝（14），精囊（7），肺部（3）。

无论植入细胞的数量如何，对肿瘤引发引发的潜力较高约15％（ ）在表达CD133标记的细胞群中与CD133细胞的群体相比。没有统计学上显着的差异，但在所有群体中观察到类似的趋势。

在图中呈现各组中肿瘤位置的实例4．所有肿瘤都显示出与黑色素累积相关的特征黑色。在植入部位形成的肿瘤，位于肠肠系膜中的肿瘤达到了相当大的尺寸。位于诸如肝脏，肾脏或隔膜等器官区域的肿瘤的尺寸较小，形状（更多椭圆形）。

3.6。不同人群的肿瘤肿块、坏死面积和异常有丝分裂没有差异

肿瘤的平均质量是注射的小鼠组中最高 B16-F10 CD133-细胞和注射后最低 CD133 +细胞。在测试的细胞基团之间没有统计学上显着的差异（ ）.肿瘤质量依赖性对植入细胞数量和表型的图表如图所示5(一个)．CD133-基团的CD133 +和0.78g平均肿瘤质量为0.74g（ ）(图S1）.

组织病理学评估表明，所有测试的肿瘤都是恶性黑色素瘤。肿瘤坏死的区域介于0到90％之间。在注射的小鼠组中观察到分离肿瘤中坏死区域的最高平均值 CD133-细胞和注射的小鼠中最低细胞 和 CD133 -细胞。此外，两组间坏死面积无显著差异( ）.图中显示了植入细胞数和植入细胞数与坏死区域的平均值之间的关系5 (b)．

在所有肿瘤中，发现了众多和异常的动脉段（图5（c）， 图。S2）.在其中的团体中 在细胞移植组中，有丝分裂指数大于5的肿瘤数量最多(见表2)1）.所有研究组之间的差异无统计学意义( ）.

4。讨论

恶性黑色素瘤是最具侵略性的癌症之一，近年来的发病率迅速增加[14.］．黑色素瘤治疗的主要问题之一是肿瘤的侵蚀性和转移的能力[15.］．治疗患者的有限疗效表明，黑色素瘤含有耐受全身治疗的大量细胞。这一概念证明了CSC的存在，可以在癌症复发和转移中发挥重要作用[10.，16.］．CSC概念假设肿瘤可以从一个单一的CSC发展，这就是为什么在治疗期间必须根除所有的CSC。许多研究都在研究一种有效的识别CSC的方法，这在未来可以开辟新的治疗前景[17.］．本研究的目的是试图评估CD133表面标志物的适用性，以便鉴定黑素瘤CSCs。

允许流式细胞术的研制检测表面标记，其又允许CSC搜索和识别。第一次潜在检测到的CSCS之一是CD34 + CD38-髓性白血病细胞[18.］．在实体肿瘤中，首先在乳腺癌中描述为CD44 + CD24−/低谱系的癌症干细胞[19.］．首先被鉴定为造血祖细胞和神经干细胞的标志物，但在许多其他癌症中也存在该标记的存在[20.，21.］．

CSCs占整个黑色素瘤细胞的比例非常小(<1%)，这与本研究的结果(0.12%)一致[21.，22.］．我们使用了来自B16-F10细胞系的CD133 +黑素瘤细胞分离的磁细胞分选。类似的技术已成功用于将相同的细胞群分离，与BLM，MV3和A375（A375）的其他黑素瘤细胞分离23.- - - - - -25.］．在我们的实验中，我们观察到CD133 +细胞和另外两种测试群体之间细胞增殖的差异。当使用更高的细胞密度进行分析时，这种差异特别可见。在其他研究中，表明表达CD133和CD44抗原的细胞在黑素瘤异种移植物中产生血管基层[26.］．2D细胞培养体外迫使不同的增长特征与在活的有机体内由于来自Niche MicroEn环境的干细胞出口引起的条件。对于在平坦表面上生长的细胞，非常重要的是细胞对细胞接触，并且该特征在细胞类型之间不同，这意味着一些细胞系必须以更高的密度接种;否则，可能发生由于缺乏来自相邻小区的信号引起的增殖的抑制。众所周知，表达CD133标记的细胞在分裂和分化过程中丧失它，即即使在另一种分离后将单独接种CD133 +细胞，我们也不能获得更高数量的阳性细胞[27.］．密度越大，CD133+细胞分裂速度越快，分化速度越快，CD133阴性细胞数量越多，阳性细胞数量也就越多(图)2（b））.第一次分裂周期后CD133+细胞密度降低，可恢复异质群和CD133-群中类似的CD133+细胞池，其中阳性细胞出现可能是脱分化的结果。这就是为什么在这种情况下，所有三个测试群体的增长特征是相似的(图2(一个)）.较高密度的CD133 +细胞的速度增长也是由产生广泛增殖和自我更新潜力的表征的全核引起的[28.］．Holoclones表达与干细胞容量相关的存活和自我更新基因[28.］．在我们的研究中进行的克隆检测表明，在所有测试密度中，CD133+组中可见更多的克隆。此外，在密度最低的CD133-种群中，观察到全无性系的缺失(图3（b））.我们的体外实验表明，与未表达该标记的细胞相比，CD133 +黑色素瘤细胞的特征在于不同的性质。基于所得结果，CD133 +黑色素瘤细胞的优点与CD133-和未排序的群体相比，可能表示CD133 +的干细胞性能。表达该标志物的黑色素瘤细胞显示出与CD133-细胞相比，如咖啡酸苯乙烷酯，紫杉醇或FOTEMUSTINE等药物的化学渗透度增加[23.- - - - - -25.］．

作为干细胞标记物的CD133的存在更复杂并且可以在不同的黑色素瘤细胞系之间变化。在Zimmer等人的研究中，分析了9种不同的人黑色素瘤细胞系;CD133 +细胞的百分比在1至90％之间变化，但只有与D10细胞系分离的阳性细胞具有显着高的克隆灭绝潜力[29.］．黑色素瘤干细胞的鉴定可能更加复杂，为了正确的检测，需要分析几种标志物的共表达。从B16-F10细胞系分离的CD133+、CD44+和CD24+细胞具有较高的克隆潜能[30.］．具有这种表型的细胞也不同于形态（在外观上更圆润），而没有表达那些三个标记的细胞是主轴形状的。在我们的研究中，我们没有观察到三种测试群体之间的形态的变化，仅使用CD133抗原分离，这支持用于CSC隔离的多于一个标记的论证是必要的。

我们的研究结果表明，观察到CD133 +人口的性质体外没有确认在活的有机体内．在Monzani等人的研究中，在植入到数量时，只有从人黑色素瘤中分离的CD133 +被隔离的CD133 +与人类的研究中高于1％以上的表达水平相似） 40天后诱发可触及肿瘤。CD133-细胞诱导肿瘤4个月后仍未见[21.］．在另一种研究中，仅在9种不同的黑色素瘤细胞系中进行，仅在植入后表达CD133标记诱导的肿瘤形成以SCID小鼠线[30.］．与我们研究中提出的其他组出现的结果表明，27％的黑素瘤细胞具有肿瘤形成的能力。分析了人黑色素瘤的50种不同的表面标志物，从中选择15（包括CD133）作为潜在的促进原标记。将具有不同标记表达的细胞植入NOD / SCID和NOD / SCID IL2RG - / - 。在第二小鼠菌株的特征在于免疫系统损伤较高，所有植入细胞产生肿瘤生长[31.］．处理CSC检测和鉴定的大多数研究来自异种移植研究，其中人体细胞植入免疫缺陷的动物。由于物种之间的屏障的影响，这些结果的解释可能是困难的，以及环境和免疫互动。在我们的研究中，细胞被植入同源动物，这可能是通过分析的黑素瘤群体的肿瘤产生的原因。与前述研究一起，我们的结果表明，对于黑色素瘤CSC鉴定分析其他标记的共表达。B16-F10具有CD133，CD44和CD24表达的黑色素瘤细胞与其他表型相比产生最快的肿瘤形成，尽管它们植入了5倍小的密度[30.］．可用于鉴定黑色素瘤CSC的其他潜在标记是ABC系列（ABCG2，ABCB5），CD166和Nestin [21.，32.，33.］．有趣的候选也是CD271表面标记物(p75 neutropine) [34.，35.］．在黑色素瘤传播肿瘤细胞（HMB-45 +和CD45-）中也观察到CD133标记的表达。缺乏CD45抗原使得能够区分这些细胞在骨髓中[36.］．

细胞注射的地方也在肿瘤发育中起重要作用。钟等人的研究。表明至少注射 在C57BL / 6小鼠中静脉内或皮下静脉内或皮下的B16-F10细胞是必需的，而在80％病例中腹膜内植入术后只足以形成肿瘤以形成肿瘤[37.］．在我们的研究中，在同一动物模型中进行，腹膜内植入 54%和38%的病例中，CD133+和CD133-细胞分别导致了肿瘤的形成。CD133阴性B16-F10细胞植入后的肿瘤生长可能是由于该细胞群通过积累遗传变化或环境因素和来自受者机体生态位的信号获得干细胞特性的能力[38.，39.］．对黑色素瘤患者切片的meta分析显示，CD133单独并不是识别黑色素瘤CSCs的合适的生物标志物。分析包括299例黑色素瘤患者，采用免疫组化分析[8］．当研究了两个或更多个标记的共表达时，高CD133表达和黑素瘤进展之间的相关性更为显着。

5。结论

在一起，CD133标记的表达促进B16-F10黑色素瘤细胞生长体外．在植入动物模型后，CD133+和CD133-人群都导致了肿瘤的发展。CD133与其他标记物共表达的分析对于正确鉴定黑色素瘤CSCs是必要的。

缩写

CSCS：	癌症干细胞
DMEM / HAM的F12媒体：	Dulbecco的改良鹰媒体
的边后卫:	胎牛血清
MACS：	磁性活性细胞分选。

数据可用性

所有数据都在手稿中呈现。

同意

不适用。

利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

TK参与了调查，数据分析，起草手稿，并给予最终批准。JJ参与了调查，数据分析，并最终批准。AJ参与了调查，数据分析，起草手稿，并给予最终批准。DB参与了调查，起草了手稿，并给予了最终批准。KS参与了调查，起草了手稿，并给予了最终批准。MBu参与了调查，起草了手稿，并给予了最终批准。MBo参与了调查，并给予了最终批准。AM参与了调查，修改了手稿，并最终批准了。GD参与了对稿件的修改并最终批准。TD贡献了概念和设计，数据分析，修改手稿，并给予最终批准。 MP contributed to the concept and design, data analysis, revising the manuscript, and given final approval. All authors have read and approved the final manuscript.

资金

该研究得到了法定活动框架内的研究任务，第296号框架。

补充材料

补充1．图S1。肿瘤性质分布。平均肿瘤肿块、坏死面积和有丝分裂计数用小提琴图表示，以说明其在试验组之间的分布(CD133+ vs. CD133-)。

补充2．图S2。有丝分裂指数的评价。根据植入细胞的表型和数量，光学显微镜，肿瘤瘤中的丝分裂实例（箭头） ．

补充3．表S1。详细的体内肿瘤发生分布取决于CD133标记物的表达和植入细胞的数量。

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