人类多能干细胞文化:现状,挑战,和进步

文摘

在过去的二十年里,人类胚胎干细胞(为)由于其多能性引起了公众的关注和增殖能力,使生产在人体内几乎所有的细胞类型在体外,使他们成为一个优秀的工具来研究人类胚胎发生和疾病,以及药物发现和细胞移植疗法。发现人为多能干细胞(hiPSCs)进一步扩大人类多能干细胞的治疗应用方面(已经)。hPSCs提供一个稳定的和无限的原始细胞来源为下游应用生产合适的细胞和组织。因此,工程这些细胞生长的环境,为稳定和品质管理hPSC维护和生产的关键因素之一是管理这些应用程序的成功。hPSCs维护使用特定的细胞培养组件在一个特定的利基。理想情况下,文化应该是免费的异型生物质组件呈现hPSCs适合治疗应用程序。实质性的努力被确定有效成分,和发展文化条件和协议,在质量上不打折扣的大规模扩张。在本文中,我们讨论不同的媒体,其组件和功能,包括特定需求来维持hPSCs多能和增殖能力。理解文化组件的作用将使适当的条件,促进大规模的发展,质量受控的扩张hPSCs从而增加他们的潜在的应用。

1。介绍

寻求理解早期胚胎发育和分化为成熟细胞类型可以追溯到二十世纪初当重要实验小鼠睾丸畸胎癌的发展描述(1]。未分化细胞的观察,他们由生殖细胞的起源,可以产生各种类型的分化细胞引发了越来越感兴趣的话题。这是紧随其后的推导从小鼠胚胎性癌的细胞(ECC)畸胎癌,这是培养拟胚体(EBs),多功能(2]。观察,即使是单一的ECCs从畸胎癌有能力获得无限增长和引起多种细胞类型的证明个人多能干细胞的存在和打开了一个独特的窗口到哺乳动物早期发育的研究(3]。这一发现的ECCs可能来源于畸胎癌,肿瘤诱导的implantation-stage小鼠胚胎的移植子宫外网站histocompatible主机,启发研究者直接从胚胎本身孤立多能细胞,从而绕过需要生成/获得多能干细胞隔离畸胎癌。随后,在体外多能细胞成功地建立了文化隔离的细胞内细胞团(ICM)的正常胚胎植入前的小鼠胚泡,和“胚胎干细胞(ESC)”一词被创造(4,5),因此从teratocarcinoma-derived多能的ECCs区分它。这些开创性的实验确定的最佳时间点隔离的ESCs多能胚胎,允许适当的培养条件的发展维持ESC额度与无限增殖能力(未分化状态4,6]。进一步发展允许非人灵长类动物的发展[ESC行7)最终导致了突破建立hESC线。

为来自早期囊胚ICM和可以传播和保留其多能性在适当的培养条件(4,6]。这些细胞未分化的形态,表达多能性标记,无限制的扩散,以及潜在的分化成三个胚胎胚芽层,即使经过长时间的文化,同时保持正常核型。这些功能已经从那时起成为已经被定义的特征。为之后,一个重要的发现是诱导多能干细胞的发展(万能)迫使转录因子的表达重组成人体细胞成多能细胞所必需的。这种方法绕过胚胎获得多能干细胞的需要,从而解决hESC带来的伦理问题研究[8]。

hPSCs独特的潜在文化自我更新和产生胚胎中的所有体细胞类型使得他们一个激动人心的候选细胞替代治疗(CRT)在各种退行性疾病和癌症等疾病,以及为理解早期发展和建立提供了无限的可能在体外疾病模型。研究已经证明hPSCs分化成各种细胞类型的能力来源于外胚层,内胚层、中胚层,如心肌细胞、神经元,神经胶细胞,肝细胞,胰岛细胞,软骨细胞,骨细胞,脂肪细胞,内皮细胞。因此,空前的研究指向阐明参与调节多能性和分化的因素。同样的知识可以应用到所有关键发展阶段和理解的机制正常和病理结构。因此它已经广泛的应用在促进药物发现,再生医学、基因治疗。

此外,使用hiPSCs开放自体CRT的可能性,将我们更近一步的希望从基础研究到临床应用干细胞疗法。值得注意的是,hiPSCs分享类似的特征为其在信号传导机制方面,和文化系统hiPSCs类似用于为。

最近的研究表明,“多能性”存在于不同的国家,根据hPSCs的文化条件。其中,两个功能不同的干细胞状态已确定,即“天真”和“影射”,类似于鼠标ICM植入前胚胎囊胚细胞和外胚层层postimplantation胚泡细胞,分别(9- - - - - -12]。传统,hESC行派生和维护多能状态类似于鼠标的待发状态,用鼠标外胚层干细胞(mEpiSCs) [9,11]。同样适用于hiPSC线已经重新编程使用方法首先被高桥et al。8]。由于两个多能性状态的发现,它已经建立了,老鼠为“幼稚”状态,比影射EpiSCs代表一个更早的时间点,在小鼠胚胎发育9- - - - - -11]。因此,一个大的研究机构已经针对优化培养条件为每一个阶段,最近,“幼稚”为其也已由传统的切换为从“影射”状态(13- - - - - -15)或派生新的hESC线路从人类六到八细胞胚胎阶段,使用单纯状态推导本身的生长条件从一开始(15]。尽管hPSCs单纯状态生长条件比待发状态不稳定的条件下,这些导致了增加的理解活动/活动的途径在体外和他们如何可以被补充生长因子和小分子的媒体,因此强调hPSC文化传媒的重要性。

使用hPSCs所有下游应用程序需要建立的协议将允许大规模、具有成本效益的培养细胞,在不影响质量。现在众所周知,文化环境会影响几个参数,这是重要的评价干细胞工程应用领域,如基因修正或选择基因稳定和高度多能人群。研究显示长期hPSCs文化如何引入自发突变或基因异常,这必然影响到纯洁,一致性,效力,hPSCs和功能的能力,他们可以偏见或'远离他们的真正的多能细胞状态(16- - - - - -21]。因此次优hPSC培养条件可以改变他们的身份和与下游差异化协议的兼容性。这可以倾斜导致疾病模型和药物研究也研究和影响最终产品是用于移植治疗。这种改变的可能性hPSC质量和稳定性,引入文化媒体本身,提出了重要的问题关于安全和风险使用这些细胞工程和治疗应用程序(图1)。

由于hPSCs最强大的和有前途的原料细胞工程应用,理解和控制的行为hPSCs通过优化培养基,小分子,生长因子,和微环境,将使识别适当的文化条件推导等下游应用程序特定的细胞类型在CRT,药物发现,人类胚胎发生和疾病机制的研究。本文描述了不同媒体用于维护hPSCs多能性状态,其组件和功能,和进步发展的适当条件促进大规模、质量受控的扩张hPSCs从而增加他们的潜在的应用。

2。hPSCs贴壁培养系统的进化

2.1。传统文化系统

ICM的细胞,一旦分离,需要放置在合适的合适的细胞外基质(ecm)和培养在媒体,可以支持他们的多能性和维持自我更新。传统上,镀blastocyst-derived细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(mef)连续传播mitotically灭活的丝裂霉素C治疗或γ辐照(6]。研究分析了媒体和脱细胞基质成纤维细胞条件与质谱分析表明,这些支线细胞分泌重要的生长因子,ECM组件,和细胞因子在文化媒体,支持hESC增长和扩散,如成纤维细胞生长因子(fgf)、转化生长因子-β(TGFβ),骨形成蛋白(bmp)、苯丙酸诺龙,层粘连蛋白- 511,laminin-binding蛋白vitronectin,硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,纤连蛋白和胶原蛋白22,23]。

然而,有几个因素会影响支线层的性能,从而影响因子的分泌和沉积ECM组件,可以产生负面影响的一致性feeder-based文化。这也限制解释差异的生物学hPSCs由于未定义的支线微环境因素造成的。此外,馈线细胞也可以动物病原体和支原体污染的来源。在这方面,马丁等人表明,大多数动物产品是一个非人类的唾液酸Neu5Gc来源,它被纳入为标准培养条件下,相同的移植会因此诱发免疫反应(24]。使用人类的喂食器因此提出替代mef,为了防止非人组件的使用。而胎儿喂人体组织似乎最支持,如喂食器从人类胎儿肌肉和皮肤(25),胎儿包皮(26),胎肝基质细胞(27),流产胚胎的使用胎儿成纤维细胞提取带来伦理问题。因此,其他几个人类细胞类型测试的能力保持hPSC多能性的文化,包括成人喇叭管的成纤维细胞,骨髓细胞(28),脐带(29日),胎盘细胞(30.,31日),子宫内膜细胞(32]。自发的支线层来自分化成纤维细胞为其本身的另一种方法采取规避捐赠给料机的使用完全细胞从而完全消除外源的病原体污染的风险(33,34]。尽管有这些创新进步,重要的是要意识到支线cell-dependent文化系统的限制,主要是由于lot-to-lot可变性和批次不同文化之间的矛盾,最终使他们不适合治疗应用。

2.2。Feeder-Free文化系统

研究使用不同类型的喂食器,组件的分析它们产生的文化,以及不同的馈线类型之间的比较使我们了解基本维持多能性的机制和途径。充分利用这些细胞的潜力,必须建立文化定义的系统,可以支持大规模代hPSCs及其治疗的衍生品。hPSCs推导以来,一些动物产品曾提供条件适合维持多能性和指引他们走向分化。传统上,hPSCs一直在培养一层mef媒体补充胎儿牛/牛血清(的边后卫或FCS)和动物生长因子。动物组件的使用,然而,提高xeno-contamination和免疫排斥的可能性。因此,这些文化系统呈现hPSCs不适合临床移植。为了满足clinical-grade标准,文化系统完全xeno-free需要开发hPSC质量和数量的前提下。因此,重要的研究一直致力于理解机制,规范多能性。这导致了化学合成xeno-free产品的开发和小分子,让更换所有动物组件在体外,同时保持适合多能干细胞的培养条件。

方法开发feeder-free系统由识别合适的基础培养基,以及合成基质/涂层将代替喂食器提供的定义和未定义的可溶性因子在文化。例如,下巴等人发现了近30蛋白质分泌喂食器来自不同来源,他们证明了能力的六个蛋白质在支持hESC文化(35]。MEF-conditioned媒体的使用和动物ECM蛋白质,特别是基底膜基质™(康宁公司),这是由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞,或层粘连蛋白,据报道,稳定保持为几个段落(36]。此后,几种方法旨在取代MEF-conditioned媒体补充剂或小分子与基底膜基质蛋白质纯化重组ECM (22,37- - - - - -40]。在下面几节中,我们讨论的关键组件feeder-free媒体和他们的角色,了解所需的化学定义媒体的发展。

试图为hPSCs生成定义的媒体,确保批次一致性,得出几个商用feeder-free文化的选择,其中一些xeno-free和一些,也符合cGMP(当前良好生产规范)(表1)。常用的商业媒体包括mTeSR1、TeSR2 TeSR-E8,资源集和NaiveCult(干细胞技术),StemPro,基本8和StemFlex(热费希尔科学),Pluripro(细胞制导系统),PluriSTEM(微孔),StemFit(味之素),和Nutristem(康宁)。等一些媒体TeSR2含有人血清白蛋白(HSA),而最近8和广泛使用的重要媒介,是源自TeSR2,不包含HSA或牛血清白蛋白(BSA)和定义是在第一次被认为是真正的媒体。然而,大多数商用和内部媒体包含昂贵的重组生长因子蛋白,如FGF2 TGF也β/苯丙酸诺龙/节点,以不同浓度的功能,这将在接下来的部分讨论。

3所示。基本hPSC文化媒体组件

3.1。基媒体

DMEM / F12 hPSC中使用的标准基底媒体文化,和12种不同的比较分析基础媒体并没有导致其他基础培养基的识别表现好于DMEM / F12即使在无血清条件下(41]。除了葡萄糖、氨基酸和维生素,组件的DMEM / F12本身,胆固醇,脂肪,胰岛素,转铁蛋白、硒、抗坏血酸,g-aminobutyric酸(GABA),氯化锂(氯化锂),pipecolic酸,和β巯基乙醇(BME)其他组件通常包含在无血清培养基。无血清媒体的另一个组件是L-ascorbic acid-2-phosphate,已包含在媒体作品,因为它增强了hPSC生存和增殖,连同FGF2, Furue等人所示和陈等。38,41]。胆固醇,另一种添加剂,是一种类固醇激素的前体和信号蛋白的一个组成部分,由于它还包括媒体成分(42]。BME通常添加到媒体阻止毒性氧自由基是细胞本身有毒,BSA的存在在媒体抵消BME的任何不利影响。陈等人表明,在缺乏BME BSA hPSC媒体不再是必要的(41]。他们还需要硒在媒体报道支持持续扩张和转铁蛋白来提高生存和克隆效率(41]。硒在媒体文化也很重要,因为它可以保护细胞免受氧化损伤通过优化谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶的活性,除了刺激细胞生长和增殖43]。

3.2。hPSC文化的微环境

一般来说,hPSCs培养在正常大气中的氧气(21%),尽管哺乳动物早期胚胎发展了相对体内缺氧条件,以氧张力[1.5 - -8%44]。而为其可以保持在21%地氧张力,几项研究已经证明,模仿生理氧含量(~ 4%)有利于减少自发分化为(45,46)和已知基因的upregulation支持hPSCs的多能性,表明一些转录程序在hPSCs oxygen-sensitive [47]。相比之下,陈等人报道没有明确的培养为其效益在5%氧张力,对形态、生存,和基因表达,只要7天分裂间隔是维护48]。然而,其他人也报道,低氧张力(2%)增强hESC克隆复苏和自发染色体畸变的频率减少,没有任何重大的改变在多能标记表达式(49]。此外,它也表明,2 - 5%氧张力增加hESC增殖率以及表达NANOG POU5F1,多能性基因的关键(39,50]。最近的一项研究有趣的报道,缺氧的确可能影响细胞命运决定在文化、2%氧气就可以激活表达hESC标记hPSC-derived分化细胞(51]。这些研究表明,尽管hPSCs可以维持在大气氧张力,它可能更有利于降低2 - 5%的相同;然而,影响仍然是有争议的,效果可能不同与不同的文化媒体,分裂间隔,也可能是细胞line-dependent。

文化传媒的理化环境的研究显示,为更好的维护时,基底媒体高葡萄糖浓度(4.5 g / l)和胚胎组织的渗透性模拟自然环境,与320 mOsm获得最佳性能52]。然而,使用340 - 350 mOsm也报告了TeSR1的发展,mTeSR1, E8媒体(39,41,53]。

鉴于pH值的影响,对每一个生物过程和维持体内平衡体内在体外,pH值的变化影响细胞内几种机制和它们的微环境。文化传媒的pH值是一个重要因素参与维护为,成功重组的体细胞hiPSCs, hPSCs和诱导分化。几个细胞特征可以主动或被动的pH值的影响,如运动性、酶活性、细胞周期和细胞凋亡。通过细胞骨架的变化也会影响细胞活性成分(54]。它也表明,重组后,殖民地获得培养基pH值在7.0到7.4时显示一个紧凑的形态,并有很强的碱性磷酸酶活性,而一个细微的变化在pH值7.6 - -7.8菌落形态分散和平板。同样,当hPSCs培养在不同的pH值,观察形态差异在每个pH值,殖民地是更紧凑的pH值6.8,pH值增加到7.8,这些细胞被更多的分散和可以观察到的单个细胞。

3.3。血清替代品hPSC媒体

使用的边后卫/ FCS hESC文化中是一个风险因素,其他研究用人类血清- (HS)包含介质和展示商品的能力有效地维护hESC多能性,自我更新,一个稳定的核型至少30多个通道(25,55]。虽然这提供了一个动物任意选择,它没有解决的问题定义血清成分和lot-to-lot变异,这可能导致可变性hPSC文化对他们维持多能性的能力,自我更新,微分的潜力,和一个稳定的核型。这些使他们不适合下游治疗应用。最早的尝试产生一个代替血清导致专有的发展基因敲除血清替代(KSR) [56),现在商用和用作标准媒体mef hPSCs成长。Amit等人表明,克隆效率为其增加了几折的20% KSR相比血清培养基和血清hPSCs派生的媒体可以很容易地转换到KSR-containing媒体没有任何妥协的自我更新能力或多能性(26]。pluripotency-associated基因的表达谱观察下类似FBS-containing和KSR-containing媒体配方(57]。也表明hPSCs展出增加增长率在KSR-containing媒介相比FBS-containing介质(58]。Rajala等人测试了几种的组合培养基和显示KSR-containing介质是优于商品包含一个59]。其他出版物报道KSR的能力有效地获得hPSC线从而确认KSR的功效及其兼容hPSC媒体(30.,60]。

此外,巨大的努力已经在寻找投资要素在血清血清或更换想出一个简单而定义的文化条件。补充的DMEM / F12 N2和/或B-27,在bFGF等生长因子的存在,证明支持长期自我更新为(22,61年]。与白蛋白替代血清和KSR,特别是HSA和BSA TeSR1 [39]和mTeSR1 [53分别),也被广泛用于hPSC种植。据报道,有趣的是,添加0.1% HSA获救hPSC生存能力的损失造成的胰岛素消耗在suspension-grown hPSCs,从而证明白蛋白的不同方式可以支持hPSC多能性和可行性在文化62年]。另一个血清替代产品,lipid-rich BSA,称为AlbuMAX,被确认为主要活性成分和脂质源KSR [63年]。它是白蛋白的混合物与脂质(如胆固醇、磷脂和triacylglycerides)和自由脂肪酸(亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸)(64年]。结果表明,为其能稳定保持在KSR-deficient媒体补充1% AlbuMAX和N2 / B27,从而实现更多的媒体组合定义(63年]。另一项研究表明补充化学定义媒体(CDM)如E8、AlbuMAX,减少代谢通量的变化通常是诱导在文化在E8等清洁发展机制(65年]。事实上,大多数血清替代品包括白蛋白(如BSA / HSA)、血清中含量最丰富的蛋白质。白蛋白的加入有助于保护细胞表面和稳定其他蛋白质的文化媒体,使之成为一个有益的添加剂在无血清的媒体。然而,这并不是一个绝对要求hPSC媒体,作为商用媒体E8白蛋白(不包括任何41]。在这方面,陈等人,Yasuda等人报道,无血清替代品,胰岛素和转铁蛋白是两个最低要求除了生长因子和蛋白质化合物(41,66年]。此外,白蛋白的纯化血清或文化上层清液(在重组蛋白表达的情况下)可以介绍污染物,由于白蛋白的结合蛋白,高容量离子,化学物质,和病原体,难以摆脱对净化。还需要进一步的研究来阐明这些蛋白质的确切角色和机制在血清替代品维持多能性和自我更新,这样他们就可以被定义和具有成本效益的化合物,这可能使血清替代过时的未来。

4所示。生长因子对hPSC文化

4.1。纤维母细胞生长因子(fgf)

随着KSR,最早确定组件,发现导致干细胞多能性和自我更新是基本成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2),从内部被证明是由人类支线层hESC文化(27,43]。发现FGF2是不可或缺的维持胚胎干细胞的未分化增殖KSR-based媒体(26]。许等人也报告说,FGF2至关重要支持未分化hESC增长血清替代媒体,单独或结合其他生长因子缺乏食或条件的媒体,同时保持类似的形态、表面标记和转录因子表达式,核型,端粒酶活性,分化潜能67年]。feeder-free系统,表明FGF2在一系列浓度(4到100 ng / ml)被要求的多能性维持hPSCs几个段落,相当于条件媒体mef (68年]。FGF2发现刺激分泌的支持性因素mef differentiation-inducing活动下降,而且监管TGF的表达β家庭成员,使他们能够按照hPSCs以自分泌的方式促进自我更新(69年]。互补脱氧核糖核酸微阵列分析为其而制,有区别的人类细胞显示,浓缩FGF2/13 FGFR1、2, 4在已经被70年- - - - - -72年]。另一组验证这确实的实时PCR结果确认FGFR1-4表达为FGFR1是最丰富的(73年),而Eiselleova等人报道,FGF2暗示通过FGFR2[居多74年]。此外,添加FGFR抑制剂SU5402导致快速细胞分化抑制下游蛋白激酶的激活和表达下调OCT3/4,因此建议自分泌FGF信号在hPSC文化的存在73年]。与此一致的是,另一份报告显示,击倒FGF2导致hPSCs快速分化,和未分化表型不能被添加外源性FGF2拯救。相反,外生FGF2的多能性维护程序能够在加强intracrine FGF2信号(74年]。总之,FGF2促进hPSC自我更新和增殖在几个方面未分化状态。FGFR结合并激活增殖蛋白激酶(MAPK)的级联途径,以及phosphatidylinositide 3-kinases pi3激酶/ AKT通路,导致高基底细胞外水平signal-regulated激酶(ERK) 1/2和蛋白激酶B (PKB) / AKT,分别在hPSCs,其中涉及干细胞基因的表达,抑制细胞死亡和凋亡基因(73年- - - - - -75年]。这证实了李等人还显示,增殖蛋白激酶(MEK / ERK和PI3K / AKT信号是FGF通路的下游目标,如图所示,高水平的磷酸化MEK的兵,和PKB / AKT FGF2治疗为(75年]。有趣的是,尽管MEK / ERK和抑制PI3K / AKT单独或共同导致了快速hPSCs失去自我更新能力,只有PI3K / AKT的抑制导致显著减少细胞增殖和细胞凋亡明显增加,因此建议共同和不同的角色这两个通路的下游FGF信号在hPSCs [75年]。在另一项研究中,它也表明,神经营养因子(脑源性神经营养因子,生成3,和生成4)显著提高hESC存活率,这效果是由PI3K途径而不是MEK / ERK通路(76年]。

如前所述,MEK / ERK通路称为hPSCs FGF目标的途径之一。康等人都在第一个报告,FGF信号为诱导激活ERK(细胞外signal-regulated激酶),进而诱导表达c-fos,早期MEK / ERK1/2通路的下游目标(77年]。结果表明,MEK / ERK在为其抑制特定的MEK抑制剂PD98059和U0126,或者通过RNA干扰,迅速引起的损失未分化状态;然而,这并不影响细胞增殖和生存,而抑制PI3K / AKT LY294002诱导显著减少细胞增殖和细胞凋亡增加75年]。这些数据表明,FGF, MEK / ERK通路支持hPSC自我更新与其他途径,如合作PI3K / AKT通路。的生理作用和目标MEK / ERK hPSCs尚未澄清,需要确定。然而,随着双方的共同效应下游血小板源生长因子(PDGF)和FGF, MEK / ERK似乎是至关重要的支持pluripotency-related过程受受体酪氨酸激酶(rtk)。

肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和fgf形成的高亲和性结合复合物,因此包含在媒体控制fgf的活性和稳定性78年]。Furue等人也显示,肝素钠的加入促进了hESC扩散在缺乏FGF2剂量依赖性的方式(38]。肝素诱导的细胞周期蛋白D1的表达,细胞周期的监管机构,并为其迅速的FGF受体磷酸化,在缺乏外源FGF2,表明它帮助hPSCs在稳定从内部产生FGF [38]。另外,肝素也被发现Wnt和FGF信号增强的活动为(79年]。

4.2。其他配体的受体酪氨酸激酶(rtk)

蛋白质组学屏幕MEF-conditioned媒体旨在识别候选增长支持为其文化因素表明,胰岛素样生长因子(IGF),特别是IGFII,是最丰富的80年]。之前的研究已经证实,自体支线层来自自发分化为成纤维母细胞多能为其增长的支持,而这些呈分化为表示FGF受体水平高于未分化为在同一培养皿(34]。在这样的文化条件下,治疗FGF2导致IGFII的释放和转化生长因子β因素从细胞自体馈线随后采取行动未分化为以旁分泌的方式促进自我更新和多潜能(80年]。他们报告说,未分化为表达了IGF1 RTK (IGF1R)受体,当阻塞,为其生存和clonogenicity降低,而周围的馈线细胞表达FGFR1,当阻塞,导致分化。他们的研究结果表明,IGFII仅能维持hPSC增长和扩张在长期文化,及其IGF信号是通过激活介导的PI3K / AKT通路80年]。胰岛素的重要性hPSC媒体也证实了王等人表明,IGF1R抑制性抗体减少hESC增殖和诱导分化,而且,IGF1R-specific shRNA转导在为其文化的自我更新能力(81年]。血清中其他的研究旨在识别特定因素,促进的增长为其显示lysophospholipid鞘氨醇1-phosphate (S1P), PDGF一起,需要保持在他们的未分化状态为feeder-free文化和S1P和PDGF的凋亡效应为(82年,83年]。Phosphoproteomic分析为其还透露,PDGF受体RTK (PDGFR)抑制剂导致为其分化和减少表达多能性的标记。PDGF-AA配合bFGF稳定保持未分化为其在文化、甚至它帮助保持未分化状态下的次优FGF2的浓度(84年]。

此外,RTK信号的作用是证明在另一项研究中,调查了表皮生长因子受体(EGFR)的贡献家庭成员,在hESC文化。他们发现ERBB2/3 hESC细胞上表达因此暗示作用的调节配体1 (NRG1) [81年]。此外,抑制ERBB2显著降低hESC增殖和诱导细胞凋亡在feeder-free文化81年]。考虑这些生长因子确定的角色,王等人组建了一个简单的给料机,血清,和KSR-free定义媒介(DC-HAIF),旨在刺激IGF1R和ERBB2/3信号,调节通过合并1(或heregulin-1β)、FGF2 LR3-IGF1 (GMP-grade重组人类IGF1)和苯丙酸诺龙(81年]。他们显示为可以成功和稳定传播媒体自发分化最小的几个月。

4.3。TGFβ总科

的TGFβ总科包含超过100个蛋白质,包括TGFβ蛋白质、苯丙酸诺龙、节点、骨形成蛋白(bmp)和生长和分化的因素(gdf),所有这些调解一些生物效应通过受体丝氨酸/苏氨酸激酶,维持干细胞的命运。一旦激活TGF的绑定β家庭配体,这些受体使磷酸化和激活Smad蛋白质,把原子核,和函数作为激活靶基因的转录辅因子。I型受体(TGFRI),也称为Activin-like激酶(艾礼克斯),在多潜能发挥核心作用,骨形态发生蛋白配体和苯丙酸诺龙/节点/ TGFβ通过受体配体施加其影响碱性2/3/6(激活SMAD 1/5/8)和碱性4/5/7(激活SMAD 2/3),分别为(85年]。

八个不同的生长因子的影响的分化为被Schuldiner等人在TGF评估β1没有导致分化细胞的生产记录,从而表明其在镇压hPSC分化中的作用。Amit等人表明TGFβ1导致增长的因素还包括FGF2的鸡尾酒,保持未分化状态,为其在feeder-free文化(37,86年]。据报道,在未分化的细胞,TGFβ/苯丙酸诺龙是通过信号激活的传感器节点分支SMAD2/3是通过添加苯丙酸诺龙(25 ng / ml),这是证明是需要规范的下游Wnt激活,这是必要的,以维护hPSCs [87年- - - - - -89年]。这种依赖进一步证实了研究表明TGFβ苯丙酸诺龙/ Nodal-responsive SMAD2/3直接绑定到Nanog近端启动子和激活它的表达90年]。苯丙酸诺龙的要求/节点信号通过SMAD2/3激活维持多能性是另一项研究也证实了88年),其中该信号通路的抑制剂导致hPSC分化。然而,根据这项研究中,节点和苯丙酸诺龙就能够维持长期hPSC增长,但这两种,当结合FGF2,帮助实现最优条件保持长期hPSC多能性和自我更新88年]。这是在协议与徐等人还显示,FGF或TGFβ独自一人是无法长期维持多能性为(91年]。

当节点和激活素作用于相同的受体,激活相同的信号机制来抑制hPSC分化(87年- - - - - -89年),后者是更经常使用在体外细胞培养由于其广泛的可用性的重组蛋白质和相对较低的成本。贝蒂等人还显示,苯丙酸诺龙被MEF分泌喂食器和丰富培养基结合的外源苯丙酸诺龙(最佳浓度确定为50 ng / ml),连同FGF7(角质细胞生长因子,50 ng / ml)和烟酰胺(10毫米),为维护处于未分化状态超过20通道没有MEF食或条件培养基(92年]。去除苯丙酸诺龙相反导致快速分化hPSCs从而确认这种增长的必然性因素hPSC文化传媒(92年]。肖等人详细的研究首次提供了证据,低浓度的苯丙酸诺龙(5 ng / ml)是必要的,足以支持未分化hESC增长feeder-free文化(人工基底膜)40]。他们还表明,苯丙酸诺龙OCT4诱导表达,Nanog,节点,Wnt3, FGF2和抑制BMP信号,从而反映其核心作用维护hPSC多能性和自我更新40]。然而,有趣的是,激活素A有矛盾影响hPSCs维持多能性和诱导分化,如苯丙酸诺龙A-induced hPSCs成mesoendodermal细胞的分化良好的文档记录,在研究表明更高浓度诱导分化而多能性(低浓度是必要的86年,93年]。

TGF的另一个成员β总科,BMP4,众所周知,协同白血病抑制因子(生活)在制维持多能性,在hPSCs有着相反的作用。在BMP信号保持自我更新制,它诱导分化在hPSCs [94年]。这是显示在报告显示,为生长在无血清与FGF2媒体补充,被BMP4诱导分化成不同的胚胎外的血统,滋养层(95年),或自发分化为胚胎外的endoderm-like细胞由于BMP2 [96年]。这证实了其他研究的BMP4在中诱导多能性的快速损失为(92年),BMP4拮抗剂‘诺金’(500 ng / ml)与FGF2协同效应(40 ng / ml)保持未分化状态为(67年,97年]。后者表明BMP2和BMP4蛋白质检测血清中上级replacement-based hESC文化,相比MEF-conditioned媒体文化,这可能是压抑的‘诺金’和FGF2的组合或高剂量的FGF2 (100 ng / ml),这两个持续长期未分化增殖hPSCs feeder-free文化条件(67年]。许等人还显示,TGFβ和FGF信号加强对抗BMP信号,从而维持与多能性相关基因的表达,如NANOG OCT4、SOX2 [91年]。Dorsomorphin,另一个小分子中包含一些xeno-free媒体成分、行为通过抑制BMP信号从而促进hPSC自我更新和防止hPSCs BMP-induced分化98年,99年]。

4.4。Wnt家庭

Wnt信号一直在干细胞涉及众多功能,一般来说,他们的行为来维持干细胞的未分化状态。佐藤等人表明,规范Wnt通路的激活足以维持自我更新能力为(71年]。他们报告说,Wnt激活的抑制糖原合成酶激酶3 (GSK-3)或添加重组Wnt3a在媒体上推广的发展紧凑、未分化hESC殖民地,而参与细胞。此外,撤军GSK-3抑制剂导致逆转的多能性状态和诱导分化71年]。Dravid等人另一方面,报道,Wnt激活是不足以维持多能性为其状态,但是Wnt3a应用程序刺激hESC扩散(而不是One hundred.]。蔡等人还显示,如果FGF2或MEF-conditioned媒体——(MEF-CM)派生因素缺席,添加Wnt3a或Wnt1刺激hESC增殖和分化101年]。然而,FGF2的存在和MEF-CM Wnt可以刺激增殖的未分化为101年]。微阵列数据的荟萃分析发现Wnt受体FZD7 hESC-specific抗原,在降价导致了快速变化的形态细胞和多能性标记物的表达,从而表明Wnt信号的贡献hPSCs的多能性和自我更新能力102年]。Wnt激活在媒体可以通过使用化学GSK-3抑制剂,这是递增的顺序特异性,氯化锂,6-bromoindirubin-3 - - - - - -肟(生物)和CHIR99021,从而不再需要任何异种的化合物调制Wnt信号(103年,104年]。在另一项研究中,长谷川等人发现了一个小分子Wnt信号调制器,ID-8,连同Wnt3a完全阻止Wnt-induced分化而不影响扩散,同时保持稳定的hPSC生存(105年]。因此,尽管Wnt /的角色β连环蛋白信号hPSCs尚不清楚,没有共识关于其自我更新和分化的影响,上述研究凸显了FGF2 Wnt和TGFβ信号来维持合作hPSC自我更新、多能性和增殖在体外。在另一项研究中,据报道,仅Wnt3a和FGF不能够支持hPSC增长feeder-free系统,但随着添加胰岛素,转铁蛋白,白蛋白、胆固醇、化学定义和proliferation-inducing配体(4月)/ B细胞激活因子属于肿瘤坏死因子(金属),修改后的中名叫HESCO是开发能够支持hESC增殖和自我更新了三个段落42]。有趣的是,Tsutsui等人开发了一个定义的文化系统中一个独特的结合分子包括bFGF、以及抑制剂对葛兰素史克,MEK Rho-associated激酶(岩石),允许长期维护的为单个细胞使(106年]。

最近的研究表明,Wnt /β连环蛋白信号是活跃在hPSCs天真的多能性状态,虽然在待发状态减弱或消失。天真hPSCs分泌实际上Wnt激活Wnt /β连环蛋白信号的自分泌或旁分泌的方式,促进有效的自我更新和抑制他们过渡到待发状态(107年]。抑制Wnt / b-catenin信号天真hPSCs不会导致分化,细胞继续表达干细胞标记。也,它诱发转向"像hPSC状态(107年]。

5。化合物

在过去的二十年里,大多数hPSCs一直在维护文化包括异型生物质组件有免疫原的污染或病原体的风险呈现为再生医学应用这些细胞无能。因此,化学的发展定义或xeno-free系统hPSC文化系统是必要的。绕过这些挑战研究人员一直在努力开发定义条件hPSCs通过使用化学合成分子调节生物过程。化合物如MEK抑制剂(PD98059和PD0325901), GSK-3抑制剂(Wnt信号激活)(生物和CHIR99021), Rho-associated激酶(岩石)抑制剂(y - 27632), FGF / RTK抑制剂(PD173074)和TGFβ/筛选抑制剂(SB431542)商用和最广泛使用的维护,hPSCs的增殖和分化。因为fgf / rtk TGFβ实际上wnt / s /艾礼克斯,GSK-3信号描述了在之前的章节,化合物广泛用于调节其他信号hPSCs将回顾在这一章。

5.1。岩石抑制剂

Rho-associated蛋白激酶(岩石),Ras基因家族成员同系物的下游效应器(RhoA),是一个激酶属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,主要参与调节细胞的形状和运动作用于细胞骨架(108年]。可怜的可行性hPSCs通道引起的细胞凋亡,期间由于肌动球蛋白hyperactivation称为起泡(109年研究人员),是一个障碍,妨碍日常生活文化如离解/扩张。岩石抑制剂如y - 27632减少起泡,减少细胞凋亡,从而提高细胞分裂后的克隆效率(110年]。研究也表明,岩石抑制剂提高的效率和生存能力hPSCs冻融循环后(111年,112年]。它还有助于保持hPSCs处于未分化状态在馈线以及feeder-free条件(113年]。没有岩石的抑制,细胞凋亡可以减少游离hPSCs细胞团,而不是单个细胞,而岩石抑制剂添加通道时可以部分减少细胞凋亡诱导在单细胞分离。因此,进一步的研究强调减少压力诱导的方法分离成单个细胞需要进一步实现最大的可行性。

5.2。化合物用于天真的文化条件

最初试图获得或维持天真为依靠多能性基因的连续异位表达除了hPSC媒体包含白血病抑制因子(生活)和抑制剂MEK和GSK-3(称为2我)114年- - - - - -116年]。然而,最近,Gafni等人发明了一种化学定义媒体称为天真的人类干细胞培养基(NHSM),包含一个基底媒体DMEM + KSR, N2, AlbuMAX和胰岛素生长因子FGF2 TGF也β,补充2 i /生活(如上所述),p38 MAPK /抑制剂(SB203580)和经典之中Wnt / c-Jun-N-terminal激酶抑制剂(SP600125)(物),进一步优化以提高细胞生存能力的增加岩石抑制剂(y - 27632)和蛋白激酶C (PKC)抑制剂(Go6983) [13]。然而,其他研究已经表明,最小的媒体包括bFGF, MEK和葛兰素史克抑制剂(15),或另外岩石抑制剂和生活117年可以支持天真的多能性。有趣的是,(118年)显示不同的鸡尾酒5抑制剂(我)包括MEK抑制剂(PD98059)、葛兰素史克(IM12),岩石(y - 27632), BRAF (SB590885)和LCK / SRC (wh - 4 - 023)随着生活,bFGF、苯丙酸诺龙(5 i / L / F / a)是最有效的天真hPSCs推导和维护。他们还显示,包含20% KSR不利于感应天真的多能性,与文化在N2 / B27媒体相比,以及补充与葛兰素史克抑制剂(CHIR99021)是棘手,因为低浓度提高了维护天真的多能性,而更高的浓度导致了相反的。减少CHIR99021浓度为1μ米也合作MEK和PKC禁忌,在生活面前(称为t2iL +去)保持天真的多能性(119年]。有趣的是,最近的一份报告表明,Wnt5A是一个至关重要的组件,和我一起/生活和bFGF,天真的多能性的促进感应建立hESC线(120年]。

6。细胞外基质

食动物的知识和理解的ECM组件之间的串扰,细胞,和媒体利用,开发feeder-free细胞外基质(ECM)模仿喂食器提供的条件,为hPSCs同时减少依赖异种的组件。如前所述,第一批底物用作feeder-free替代人工基底膜,主要由附件蛋白和层粘连蛋白一样,entactin,胶原IV,和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,除了生长因子,和每一个单独的组件显示不同程度的效率在支持hPSC文化(36]。然而,由于基底膜基质来源于动物来源,它也可以引入不必要的异种的污染物,从而使这个不适合临床疗法。已经取得了显著的进展在识别个体ECM组件(如层粘连蛋白- 511,纤连蛋白,vitronectin希望发展化学定义和合成基质。Laminin-coated表面是非常有效的在支持hPSCs的多能性和扩散,而胶原IV和纤连蛋白(36]。此外,特定层粘连蛋白亚型显示不同的效果与亚型ECM衬底-111年,-332年和-511年,而不是-211年和-411年,能够支持附件和未分化hPSCs扩散。此外,它已被证明,支持馈线细胞和hPSCs生产层粘连蛋白亚型-511/-521和整合素表达α6β1受体,主要为这些层粘连蛋白受体亚型(121年]。自整合蛋白的主要分子,是调解cell-ECM交互,vitronectin等基质,通过整合素已被证明支持hPSC自我更新αVβ519年,开发(122年]。重组体人层粘连蛋白- 511年和-521年,vitronectin和钙及其短片段首先定义ECM基质中被描述,他们现在已经经常受雇于feeder-free文化。因此他们使用代表hPSC文化中一个重要的里程碑。这些导致聚合物的发展,改性合成肽,如SyntheMax [123年]。然而,cell-ECM的确切机制,和粘附在hPSCs仍然不清楚,需要加以解决。

7所示。hPSC批量培养系统

应用程序在工程和医学hPSCs需要生成大量的10¹⁰细胞或更多,同时坚持cGMP准则和规定的要求hPSC-based疗法(124年,125年]。2 d附着feeder-free文化可以“具有伸缩性”乘以体积通过使用多层的玻璃瓶,文化和一些机器人平台自动化过程已被证明可以提供大规模的品质管理制造hPSCs [126年,127年]。然而,这种方法的大部分文化仍然是有限的商业用途的要求相当大的空间,时间,成本,和运营商,同时也限制了文化参数的在线监测。这可以大大影响细胞在文化的再现性和稳定性。三维(3 d)或悬浮培养在转轮烧瓶或者是厄伦美厄烧瓶已经报道了大量的扩张hPSCs [128年- - - - - -131年文化),而他们的体积,控制参数和监控系统可能是不够hPSCs hPSC需要大规模生产的应用程序。因此,生物反应器提供控制的文化环境和实时监控系统参数需要扩大hPSCs发达工业水平。在这些3 d悬浮培养系统中,细胞培养的形式matrix-free hPSC团作为骨料或hPSCs固定化微载体或hPSCs的微型胶囊。重要的是,媒体等用于大规模3 d hPSCs扩张是基于2 d feeder-free系统中使用的培养基本身,如KSR-based媒体,mTeSR1, StemPro hESC SFM,和必要的8。定义协议hPSC悬浮培养mTeSR1中已发表和被广泛使用132年,133年]。然而,hPSCs培养成功在2 d系统在某些媒体可能不会继续以同样的方式表现在同一培养媒体,在3 d悬浮。这可能是因为某些媒体组件可能无法保持稳定悬浮,根据最近的一项研究显示,在胰岛素发现沉淀从商业hPSC媒体(E8, TeSR-E8、mTeSR1 StemMAXs iPS-Brew XF),只有当用于蠕动泵电路悬挂系统(62年]。有趣的是,胰岛素从培养基的损耗导致过度解体hPSC总量与后续损失的可行性应用文化系统,虽然bFGF的遗漏,TGFβ1,或转铁蛋白没有显著阻碍hPSCs的形态和生存能力。这表明胰岛素绝对必要性hPSC维护(62年]。这些研究强调是多么必要密切监控媒体组件,而建立自动化批量培养系统。Lipsitz等。在一个有趣的报告,它已经表明,hPSCs转换从一个准备另一种naive-like状态便于suspension-grown hPSCs和转移到高收益状态(134年]。他们报告说,对于动态悬架文化,使用媒体补充生活,TGFβ1,FGF2,包括抑制剂GSK-3 (CHIR99021)、物(SP600125), p38 MAPK / (BIRB796)和PKC (Go6983),是最有效的支持更快的增长和更高的密度,相比传统hPSC媒体。此外,他们显示转换的影射hPSCs这个替代“high-suspension-yield”状态的贴壁培养要求MEK抑制剂(PD0325901)除了以上4抑制剂,当细胞被转移到悬浮培养后,撤出MEK / ERK抑制至关重要,为了维持多能性。这表明我们对媒体的角色的理解组件在每个阶段的过程可以使更有效和具有成本效益的生产hPSCs治疗应用。总的来说,这个系统演示了如何通过特定的媒体形态转换感应组件提供了一个长期战略,高密度hPSCs扩张,可伸缩的悬挂的文化。这个强调文化的重要性媒体优化克服的挑战的低收益率hPSCs悬浮生物反应器(134年]。

这些三维培养系统通常由生物材料来模拟在活的有机体内微环境比2 d和3 d领域更好的系统。这些生物材料有助于文化和提高细胞内信号串扰,从而模拟了生物物理和生物化学特性的原生细胞。因此,这种文化系统可用于研究药物毒性和胚胎发生和器官形成以及筛选化验。值得注意的是,这种可伸缩hPSC悬挂文化也可以作为一个方便的起点诱导它们分化通过改变hPSC扩张媒体lineage-specific媒体(135年- - - - - -137年]。因此,三维培养生物反应器允许质量和自动化生产的hPSCs hPSCs及其分化细胞。事实上,最近的事态发展在干细胞研究已导致建立协议使用这hPSCs可以在悬挂各种细胞类型分化,因此成长为微小器官,称之为“瀑样。“瀑样文化是由成千上万的细胞结构,通常来自不同的血统(组成一个器官在活的有机体内),自组装成三维结构,在外生ECM基质的存在与否。这将创建一个动态的自我更新和分化细胞之间的微环境,提供最接近在体外体系结构的等效的器官。他们2 d-differentiated相比表现出增强的功能细胞,因此有广泛的研究与临床应用138年]。

各种船只和生物反应器可用于hPSC扩大文化系统,如搅拌釜、空运,转轮烧瓶,波浪,旋转墙,空心纤维、多平台、磁性微载体,和3 d支架生物反应器。他们由一个玻璃或塑料容器装备有或没有一个叶轮,确保同质增长环境的高效混合细胞,营养,和气体,同时保持一个隆起对重力,使细胞聚集或微载体悬浮(139年,140年]。hPSCs可以作为单个细胞接种或聚集,与单一的细胞接种,用岩石抑制剂,广泛被更好地防止大型聚合,可以限制营养扩散(141年]。营养喂养可进行批量或灌注,据报道,尽管后者导致更均匀的环境使优越的细胞密度和产量(142年]。pH值等关键参数,溶解氧(做)的水平,流体剪切应力,生长因子,营养,和代谢物浓度hPSC扩大文化正是精心控制,确保一个统一的环境和充足的营养水平和氧化129年]。

使用涂层微载体珠在生物反应器可以被认为是一个实用的选择。几个研究已经证明,使用微载体如聚苯乙烯包覆层粘连蛋白和vitronectin vitronectin HSA与紫外线进一步治疗,或那些带正电的纤维素实现高附件效率和生存能力即使在高confluency,同时减少媒体和消费增长因素由于他们的可调表面面积(143年- - - - - -146年]。珠子与多个毛孔给更大的表面积细胞粘附和气体扩散,比平面二维文化,而附着在/ hPSCs珠子可能非常类似于二维传统文化得到是什么(147年]。最后,微型胶囊的hPSCs水凝胶,如海藻酸钙胶囊,开发技术以减少过度聚集在悬浮培养,以及提高细胞复苏率低温贮藏后(148年]。尽管这种方法提供的增加细胞保护,减少了气体的扩散限制和营养胶囊,再加上细胞收获被膜剥除术的要求。因此,三维细胞培养系统可以提供实实在在的利益hPSC文化和蜂窝产品的制造,是一个有吸引力的平台由于其可伸缩性、易于监控,方便细胞喂养和收集选项。然而,一些重要问题,如控制增长速度,总大小、分化的压力,并确保基因组稳定性,需要解决前就被批准用于临床应用(149年]。

8。结论

的增长和进步hESC / hiPSC技术的应用都伴随着一个巨大的作品致力于优化和标准化hPSC文化。文化系统的优化不仅限于定义文化媒体组件还细胞外基质,环境因素,使模式。正如上面所讨论的,这导致了简单定义文化的发展条件,也促进了开发3 d和大部分细胞培养系统。化学定义媒体适合最小化lot-to-lot变异和确保一致性,对于研究和临床应用,而xeno-free和cGMP-compliant文化系统是细胞移植的首选。在这个方向上的努力主要集中在理解所需的信号分子,更换非人组件的媒体和开发合成基质,就立即应用疾病模型和最终可以用来治疗应用工程师细胞和基质。

最近发现的孤立和维护天真hPSCs给了巨大的洞察人类发展早期,但尚未决定如何相关的这些不同的多能性状态,对下游工程应用研究和治疗。因此,未来的平台应该尝试生物工艺适应性强的天真和hPSCs。

干细胞治疗成为现实,通过人体试验的批准,防止任何改变细胞状态和身份是至关重要的。随着新疗法的出现,关于细胞产品的安全性和有效性的问题也将上升。研究揭示了hPSCs的异质性文化,和一些程序隔离和同质hPSC克隆传播被描述。然而,更清晰和更严格的监管需要定义如何维持细胞同质性在可伸缩的文化系统。重要的是要注意,hPSC-based的植入治疗的障碍之一是致瘤性的风险,由于hPSCs无限自我更新和扩张的内在属性。然而,除了在体内影响,长时间的在体外扩张所需的细胞疗法本身会导致随机一代染色体畸变从而积累迅速通过正选择压力。这样的文化适应性细胞高度不良之前累积的总基因组异常,某些高通道hPSC行数的特征。因此,随着批量培养系统的建立,化验的验证可以有效地和地监控增长条件下,细胞压力,自发分化信号,基因表达谱,和染色体完整生产过程中,处理和存储hPSCs绝对是所有下游应用程序的成功至关重要。未来的研究应该解决这些挑战通过建立协议提供健壮、稳定,同质细胞群为原料。

另一个潜在的挑战在于确定主要媒体的长期效应用于hPSCs在大规模的文化传播系统和解决这些系统的成本与维护。hPSC处理的经济一样重要的地址,他们的安全的担忧和功能的病人。成本与媒体组件与一种改进的理解在很大程度上降低了它们的功能和随后的发现小分子可以代替昂贵的生长因子和细胞因子,正如上面所讨论的。除了让媒体具有成本效益的,这也导致媒体被更多的定义,因此提高再现性。

现在有多学科方法用于推导和多能性的不同阶段,文化发展xeno-free培养条件以及代GMP-compatible协议,这将有助于规范和简化流程,以商业规模养殖。3 d文化的融合系统,化学定义媒体,和合成生物材料模仿ecm显示了巨大的潜力,提高传播,安全,为各种应用程序和功能的干细胞。

推导和维护原材料,hPSCs,包括为其hiPSCs,必须完成的方式概括他们的等效利基体内;因此,媒体这些细胞培养成功的核心都是下游应用程序。作为起点,因此,有必要了解媒体组件和他们的角色在调节自我更新、增殖、生存、稳定、hPSCs和功能,这是一个关键的步骤,确保大规模、安全、可再生的、质量受控hPSCs用于干细胞工程的扩张。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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