静止的人类间充质干细胞细胞比骑自行车更耐热应力

文摘

静止是流行的许多细胞类型在稳态条件下的状态。然而,令人惊讶的是,对静止细胞如何应对环境挑战。本研究的目的是比较循环压力反应和静止的间充质干细胞(MSC)。人类子宫内膜间质细胞(eMSС)被雇佣为成体干细胞。eMSC静止被血清饥饿建模。亚致死的热休克(HS)被用作压力因素。静止和自行车在45°C细胞被加热30分钟,然后回到标准培养条件的复苏。HS反应是由DNA损伤反应,应激过早衰老(sip),细胞增殖活性和氧化代谢。人们已经发现,静止细胞修复DNA更快,恢复增殖,并接受口不到增殖细胞。HS-enforced加热循环细胞ROS生产是伴随着基因调节redox-active蛋白质的表达增加。 Quiescent cells exposed to HS did not intensify the ROS production, and genes involved in antioxidant defense were mostly silent. Altogether, the results have shown that quiescent cells are more resistant to heat stress than cycling cells. Next-generation sequencing (NGS) demonstrates that HS-survived cells retain differentiation capacity and do not exhibit signs of spontaneous transformation.

1。介绍

人类MSC承诺细胞疗法的候选人正在深入调查中。其分化能力、免疫调节效应和导航属性提供潜在的增加许多组织的再生能力。间充质干细胞呈贴壁细胞,可与各种组织,如骨髓、脐带、脂肪组织、外周血、脾脏,和皮肤(1]。目前,MSC来自子宫内膜(eMSC)吸引越来越多的关注。与其他MSC类型相比,eMSC显示vasculogenic更高,抗炎和免疫调节潜力(2,3]。这些有价值的特性与一个特殊的角色相关联的eMSC子宫内膜每月再生。培养eMSC应用于临床试验和令人鼓舞的结果报告(4,5]。

MSC-based疗法的发展的主要障碍,然而,可怜的受伤的细胞生存在现场。一般来说,受伤组织的恶劣的环境与氧化应激有关,慢性炎症、纤维化,细胞外基质降解,和免疫排斥反应6]。这就是为什么人类干细胞培养的应激反应是在深入研究[7- - - - - -11]。

细胞暴露在压力可能会有不同的反应:经过分化、衰老(sip),细胞凋亡或坏死。选择取决于细胞类型和压力强度。轻微的压力可以提高干细胞的分化12,13]。无法忍受压力的结果是坏死。亚致死剂量的各种压力主要产生衰老(sip),有时后细胞凋亡。

热应力(热休克、高热)是一种研究类型的压力。它能影响多种细胞类型。高热可以伴随治疗过程,如干细胞治疗和癌症治疗。高热改变血液循环和供氧减少了ATP水平和增加厌氧代谢产物和DNA修复蛋白的活性。它有各种对免疫系统的影响,如增加外周血单核细胞增殖,增加细胞毒性CD8的活动⁺T细胞和分泌的干扰素-增强γ由这些细胞。它还导致炎性细胞因子的分泌,如肿瘤坏死因子-α和il - 1,改变了朗格汉斯细胞的迁移,引起淋巴细胞归巢到次级淋巴组织。热休克MSC可以抑制肿瘤的生长,提高肿瘤细胞死亡(14]。高热应用体内刺激骨生成(15,16]。这是证明温和热应力促进成肌细胞分化[17)和骨骨髓MSC (18,19]。严重的HS常见的骨科手术在培养成骨细胞诱导凋亡和坏死(20.,21]。牙科毛囊干细胞的增殖刺激通过增加温度(22,23]。增大温度提高了扩散UCV-MSC cocultured与外周血单核细胞以及il - 10的表达、TGF -β1,FOXP3 mrna。对IL-17A和干扰素,它没有影响γ分泌和减少CXCL12 [24]。在我们的实验中,亚致死的温度诱导的初步衰老(25]这是一个维护MSC遗传稳定机制排除受损细胞的扩散池。

活体内,干细胞可能会长期驻留在休眠状态进入细胞周期,以应对当地信号的损失和其他再生的需要。静止是流行的许多细胞类型在稳态条件下的状态。文化增殖细胞可以诱导成静止由有丝分裂原撤军血清剥夺(26]。血清剥夺(SD) 48小时将MSC为静止状态的细胞保持新陈代谢水平降低的健康但nonproliferative RNA和蛋白质合成。再引入到标准培养条件,SD-MSC恢复增殖和亲代细胞的性质。静止preconditioning-afforded MSC增加生存能力在低氧或葡萄糖消耗总量(27]。然而,令人惊讶的是,对静止细胞如何应对环境挑战。在这一点上,本研究的目的是比较热应力循环反应和静止eMSC (HS)。此外,我们研究了HS-survived HS-expanded细胞的分化潜能和肿瘤发生的风险使用下一代测序(门店)。

2。方法

2.1。细胞

我们使用MSC与脱屑子宫内膜的经血(eMSC)健康的捐赠者28]。细胞在DMEM / F12培养(英国Gibco)与10%胎牛血清(美国HyClone), 1% GlutaMAX(生命技术、日本),和1% penicillin-streptomycin 30毫米(英国Gibco)塑料培养皿(Nunc、丹麦)37°C, 5%的公司₂,95%的湿度。对微观实验,细胞生长在玻璃盖玻片。5-7th段落的细胞用于实验。

静止细胞的积累,eMSC达到单层trypsin-EDTA收获使用0.05%解决方案(英国Gibco)和镀10×10的密度³细胞/厘米²。第二天,无血清培养系统中改变了30 h。

2.2。细胞静止的加热和增殖的文化

海关之前,静止细胞和血清添加2 h在平等条件下加热静止和增殖细胞。静和增殖细胞暴露在亚致死的海关在45°C 30分钟(29日]在水浴parafilm-covered板块。以前,我们证明了这些条件尚不致命的自行车MSC和细胞能够存活下来的一部分(25]。这两种类型的细胞暴露于海关返回37°C下为72 h血清培养基上复苏。

2.3。免疫荧光

eMSC种植在盖玻片和4%福尔马林固定在磷酸盐(PBS) 15分钟,permeabilized Triton x - 100, 0.1%堵塞1%牛血清白蛋白为30分钟,治疗主要抗体45分钟,用渐变20 0.1%,处理二次抗体45分钟,洗20 / 0.1%渐变,复染色1μ克/毫升DAPI。然后盖玻片是安装在延长黄金不变色试剂(美国热费希尔科学)。主要对Hsp70抗体单克隆抗体使用鼠标(30.),γH2AX(美国Abcam),兔多克隆对ki - 67(美国Abcam)。山羊anti-mouse IgGAlexa 488(美国表达载体)和山羊anti-rabbit DyLight 567(美国英杰公司)是应用二次抗体。图像捕获使用徕卡TCS SP5共焦显微镜(德国徕卡微系统)装有固体激光激发(405、488和543海里)HCX PL APO CS 40 x油浸物镜(NA = 1.3,徕卡)。Adobe Photoshop软件被用来查看和获取图像。

2.4。免疫印迹分析

细胞培养细胞溶解的里帕缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA, 10%甘油、1% Triton X100, 1毫米Na3VO4,氟化钠1毫米和0.5毫米PMSF)和鸡尾酒的蛋白酶抑制剂(σ1:500年,美国))15分钟在冰上取消从盘子和离心20分钟15000 。被添加变性的蛋白质电泳缓冲(40毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值6.8),液10% SDS,甘油2-mercaptoethanol 20%和40%)的上层清液,进一步孵化100°C 5分钟。由布拉德福德的蛋白浓度测定方法使用卵白蛋白进行施工的校准曲线。蛋白质分离electrophoretically 10%聚丙烯酰胺凝胶与随后转移到HybondC额外硝化纤维素膜(Amersham法玛西亚生物技术,瑞典)。检测蛋白质的乐队,以下主要和次要抗体(所有从细胞信号)使用:anti-phospho-pRb (Ser807/811, 8516年代),anti-cyclinA2(4656年代),anti-GAPDH(2118年代),GAR-HRP(7074年代),和GAM-HRP(7076年代)。GAR-HRP的过氧化物酶活性和GAM-HRP轭合物被增强化学发光检测(ECL)反应(Amersham、瑞典)。化学发光信号被暴露在一个限制级电影记录从东航RP新(东航AB、瑞典)。光密度分析蛋白质的乐队,ImageJ软件使用。

2.5。活性氧的检测

测量细胞内的活性氧水平,荧光探针2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA,表达载体,d - 399)。H2DCFDA溶解在DMSO获得10毫米原液在PBS进一步稀释使用前获得染色方案。细胞培养与5μM H2DCFDA染色溶液在黑暗中为20分钟37°C,然后用0.05%收获trypsin-EDTA解决方案,悬浮在一个全新的媒介和立即分析CytoFLEX流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特;波长488纳米的激光)。细胞被检测到和粒度大小使用FSC / SSC点阴谋,和细胞碎片被封闭了。平均荧光强度从10000个细胞。

2.6。细胞周期分析

细胞收获trypsin-EDTA解决方案和悬浮在新鲜培养基。200年μ美国纽约g / mL皂苷(丙烯酰胺),250年μg / mL核糖核酸酶A(σ,圣路易斯,密苏里州,美国,R4642),和50μ美国g / mL propidium碘(σ)被添加到每个样品管。孵化60分钟后在室温下,样本分析CytoFLEX流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特;波长488纳米的激光)。平均荧光强度从10000个细胞。细胞周期分析使用CytExpert v . 2.0软件(美国贝克曼库尔特)。

2.7。可行性分析

细胞收获trypsin-EDTA解决方案和悬浮在新鲜培养基。50μ美国g / mL propidium碘(σ)被添加到每个样品管。孵化后5分钟在室温下,样本分析CytoFLEX流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特;波长488纳米的激光)。平均荧光强度从10000个细胞。细胞的大小和粒度使用FSC / SSC点阴谋,和细胞碎片被排除在分析之外。

2.8。rt - pcr和存在化验

分析基因表达,总RNA分离RNeasy微设备(试剂盒)根据制造商的指示。RNA是量化NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop Technologies Inc。威尔明顿,德,美国)。互补脱氧核糖核酸是500年通过逆转录ng使用RevertAid H - RNA合成第一链cDNA工具包(Fermentas)根据制造商的指示。它随后放大与特定的引物,用DreamTaq™PCR反应混合液(2 x)(热费希尔科学)CycloTemp amplificator。放大产品的电泳在2%琼脂糖凝胶TAE缓冲和溴化乙锭。100 kb DNA梯(Fermentas,立陶宛)作为分子量标记。放大产品可视化在紫外线透照器(302海里),注册一个数字佳能相机。存在,cDNA放大与特定的引物,使用EvaGreen®染料(Biotium)和DreamTaq™PCR反应混合液(2 x)(热费希尔科学)Bio-Rad排名- 96实时系统(Bio-Rad、钙、美国),根据装备的封闭的协议。20岁的体积和RT PCR反应μl .目标基因的表达被规范化GAPDH或肌动蛋白基因。引物和反应条件展示在表1。所有放大反应进行了一式三份。实验至少重复三次。

2.9。SA -β加活动分析

细胞表达senescent-associatedβ牛乳糖(SA -β加)与衰老检测β牛乳糖染色工具包(细胞信号技术)根据制造商的指示和量化显微镜下计数X-Gal-positive细胞而不是减少500个细胞中随机领域的观点。

2.10。下一代测序(门店)

细胞存活HS亚文化6通道,受到上天。上天是由平行测量三个生物样品:常温加热在静止和增殖细胞和细胞阶段。样品准备挥动和测序在«Genotek»Illumina公司平台进行公司(莫斯科,俄罗斯)。RNA提取使用PureLink RNA迷你包(Ambion,生活技术)。互补脱氧核糖核酸数据库准备使用NEBNext®mRNA图书馆准备试剂为Illumina公司®(新英格兰生物学实验室)。2100年准备库使用生物分析仪质量控制(安捷伦科技)。测序的完成于2500年HiSeq互补脱氧核糖核酸数据库(Illumina公司)在快速运行模式读取长度为100元。

微分差异表达基因的基因表达和基因模块丰富了类似于以前的作品(31日]。生物过程是取自数据库。NCBI生物系统被用作分子途径的来源。

获得生物过程和NCBI生物系统通路与分化相关,我们寻找基因模块包含在他们的头衔方面相关的各种类型的间充质干细胞分化。我们选择基因模块包含在标题上“分化”、“骨骼”,“adipo”、“神经”,“脑源性神经营养因子”,“oligodendro”、“chondro”与显著性水平 和 。数据在关键转录因子(TFs)调节间充质干细胞分化来自[32]。

评价细胞转化潜力,我们使用[提供的基因集33]。作者分析了DNA序列的8200多名tumor-normal双和确定了49致癌基因(ong)和50个肿瘤抑制(次数)扮演最重要的角色在癌症启动进程,预防和抑制。

2.11。统计分析

实验进行了一式三份。结果表示为平均数±标准差。学生的t以及用于确定两组之间的差异的统计学意义;单向方差分析与事后图基HSD测试是用来确定组间差异的重要性。零假设被拒绝在0.05水平的意义。

3所示。结果

3.1。eMSC积累在静止状态

eMSC采用无血清培养技术30 h停止增殖和积累在G0 / G1期(图1 (b))。大多数细胞成为ki - 67 -(图1(一))。蛋白质的表达细胞周期蛋白A2和p-pRb常见细胞分裂抑制(图1 (c))。海关之前,静止细胞和血清添加2 h加热静止和增殖细胞等细胞培养条件下。静止细胞培养2 h的完整生长培养基有10%血清保持静止细胞(图的所有特征1)。大多数的这些细胞G0 / G1和ki - 67负。几ki - 67阳性细胞在无血清培养和2 h后血清除了表现出较低的荧光强度与细胞增殖文化(图1(一))。

3.2。海关在静止和增殖eMSC诱导Hsp70的表达

HSP70水平是细胞应激反应的迹象。Hsp70蛋白的水平和定位测量表明,加热45^oC为30分钟对静止和增殖eMSC压力。图2显示免疫荧光和PCR检测HSP70的表达。HS-triggered观察HSP70基因的表达2 h后复苏的细胞类型。这是高水平的增殖细胞72 h而开始下降G0 / G1-heated文化48 h和下降接近72 h后在没有暖气的细胞水平。免疫荧光的评估显示,本地化的HSP70蛋白在细胞核的细胞类型2 h HS之后。在细胞复苏后24小时,HSP70的模式在增殖和静止细胞分布是不同的。加热静止细胞HSP70几乎是不确定但可见在加热循环细胞的细胞核和细胞质。这些发现表明,HS静止和增殖细胞反应的文化是不同的。后迅速恢复的HSP70表达商品的正常水平在静止细胞复苏表明他们的更高的抗h。

3.3。HS导致过早衰老增殖和静止的文化

最常见的MSC应激反应是过早衰老(9]。我们发现以前eMSC暴露于亚致死的海关接受压力诱导过早衰老(口)25]。图3表明细胞数量减少,细胞变得更平坦和扩大文化的细胞类型受到海关。这些细胞是SA -β加积极的。一般认为,小口的关键特性是SA - MSC文化β加染色形态学和修改。

SA -的数量β-Gal-positive细胞增殖的文化中静止的略低于暴露于商品。

3.4。HS引起DNA损伤反应(DDR)增殖和静止eMSC

一般认为,啜饮引发各种压力是由DNA损伤(34,35]。海关作为压力因素诱发单-和双链DNA断裂。DNA断裂激活DNA损伤反应。eMSC加热是伴随着的外观γH2AX疫源地,DNA损伤标记(图4(一))。复苏的最大焦点数量是观察到24小时,然后开始下降。然而,这种趋势在不同加热静止和细胞生长。72 h后恢复,γH2AX疫源地是可见的只有在一些细胞在文化加热静止但被确定在许多细胞在增殖阶段加热(图4(一))。在此期间,细胞内加热静止状态恢复增殖,ki - 67阳性细胞的数量增加(图4 (c))。细胞增殖状态接受海关的大多是ki - 67 -(图4 (b))。

在大多数体细胞,DDR伴随着激酶激活传感器。图4 (d)显示的ATR激酶的表达,丝氨酸/ threonine-specific蛋白激酶参与传感的DNA损伤。看到ATR是弱表达完整细胞两种类型。加热后,其表达在24小时循环细胞增加,然后下降。在细胞的静止状态,ATR表达式不是海关引起的。

3.5。静止细胞暴露于商品恢复扩散速度比加热增殖细胞

口的另一个特点是细胞周期阻滞。热应力逮捕两细胞的增殖而控制细胞分裂维持在37°C积极(图5 (c))。在商品后24小时,主要静止细胞停止在G0 / G1期而被捕的增殖细胞G0 / G1and G2 / M阶段(图5 (b))。虽然总细胞数在G2 / M和S阶段高(大约50%),这个模式的增殖细胞的细胞周期分布保持不变在接下来72 h的复苏。图5 (c)表明这些细胞不能分裂。静止细胞接触到商品,回到常温条件下恢复增殖后48 h的复苏。细胞周期分布的模式改变了。在G0 / G1期细胞数量减少而在G2 / M和S阶段,从18个增加到34%在72年复苏h。他们的细胞周期分布变得类似常温日益增长的文化(图5 (b))。细胞的增殖状态也验证了ki - 67的表达。图5(一个)演示细胞染色与抗体ki - 67。见过,在37°C,有几个ki - 67阳性细胞在静文化而大多数细胞在增殖文化中沾染了这些抗体。商品后,文化的ki - 67阳性细胞数量,返回复苏在正常情况下被改变。它在增殖的文化接触商品大幅下降,增加加热静止的文化。

我们也评估p21蛋白的表达,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。图5 (d)展示了不同p21的表达在静止和增殖的文化商品。它是在静止细胞h(图更高5 (d))。在商品后24小时,p21表达增加在两种细胞类型。在激烈的细胞增长,高p21水平持续复苏的72 h(图5 (d))而在静止细胞暴露于HS和返回在正常情况下,它大大降低了,成为低于常温静止细胞72 h后(图5 (d))。总的来说,结果中给出数据5(一个)- - - - - -5 (d)表明在72 h的复苏,静止细胞扩散而日益增长的细胞不会恢复。加热细胞收获和亚文化。的后代HS-survived细胞增殖和静止的文化产生一个单层(数字5 (e)和5 (f))。大多数细胞是可行的和半乳糖苷负面。因此,HS-treated细胞继续增殖但循环细胞做的更慢。

3.6。活性氧(ROS)和抗氧化防御商品后在静止和增殖细胞

众所周知,高热ROS增加生产。图6(一)展示了ROS水平商品后在两种细胞类型。看到ROS生产是高架在增殖而不是静止细胞暴露于商品。ROS水平可能的增加伴随着改性抗氧化防御相关基因的表达。我们研究了过氧化氢酶的表达、SOD1 PRDX4, GPX, TXN2基因控制ROS-scavenging和其他redox-active蛋白质的合成。发现PRDX4在两种文化增强72 h后加热(数字6 (d)和6 (e))。过氧化氢酶的表达、SOD1 TXN2基因增加加热循环细胞时不变在静止期细胞接受商品。SOD1水平造成的商品大幅增加在72 h的复苏,而过氧化氢酶表达增强在48小时然后下降(数字6 (b)和6 (c))。GPX表达在细胞类型未加(数字6 (d)和6 (e))。这些结果显示HS-enforced ROS生产加热增殖细胞,是伴随着基因调节ROS-scavenging和protein-reducing酶的表达增加。相比之下,海关没有改变ROS在静止细胞和基因参与生产抗氧化防御大多是沉默。

3.7。分化和转换的潜力与门店HS-Survivor细胞化验

探讨细胞转换潜力,我们评估肿瘤抑制基因(次数)和癌基因的表达(ong)。图中给出的数据7表明次数和ONG表达式的一般模式仍然是所有细胞类型虽然有些相似的基因活动可能会有所不同。ong在没有暖气的平均表达细胞和加热扩散和静止细胞由7.19±0.92,6.87±0.78,6.79±0.68 arb。单位。次数,相应的意思分别为21.8±1.78,22.3±1.69,22.7±1.96。因此,我们的数据显示,次数无显著差异或ONG表达式之间的细胞类型进行了研究。缺乏致瘤的潜在在所有细胞类型中,也有证据显示没有几个严重的致癌基因的表达,包括Myc hTERT,极品,国家管制当局方面,Pi3K,装备,SOX2, BCL6,蒋春暄对于费马大定理,和所有主要的表达次数包括TP53、PTEN、STK11, TSC1, TSC2, CDKN1A, SMAD2和SMAD4。因此,我们的数据表明,加热扩散和静止细胞的后代没有暖气的细胞保持安全的次数以及ONG概要,不表现出转型的潜力。

细胞分化潜力评估生物过程和生物系统分子途径丰富与分化相关的基因(图8、表年代补充)。我们发现(图8(一个))HS-survived细胞的后代表现出15感应模块相关的中胚层的分化谱系(脂肪形成,骨和软骨形成)和两个模块涉及的外胚层的分化谱系(神经发生)。分化潜力的幸存静止细胞子代高于加热循环的子代细胞。进一步验证诱导分化相关的基因模块,我们对转录因子的表达(TFs)驾驶成骨的脂肪形成的,chondrogenic,神经源性分化32]。图8 (b)表明TFs参与分化表达在激烈的细胞的后代。他们的表达水平高于HS-survived静止细胞。

4所示。讨论

细胞对压力的反应因素正在密集的考试。大部分的现有知识的细胞应激反应是基于实验与自行车培养细胞。压力对细胞的影响所知甚少在细胞周期的不同阶段。年代的中国仓鼠卵巢细胞中期和后期阶段更容易受到压力比细胞在有丝分裂中,早期的年代,G1, G2期细胞周期(36]。海拉细胞和人类皮肤成纤维细胞更敏感,热应力比晚年代早期阶段(37,38]。彗星试验显示,细胞DNA损伤的最高级别接触依托泊苷,观察拓扑异构酶ⅱ抑制剂,在G2 (39]。

干细胞的反应是在文化也基本上与增殖细胞检查。在活体,干细胞仍处于静止状态的时间太长,进入细胞周期,以应对当地信号的损失和其他再生的需要。很少有研究探讨MSC在静止状态的压力反应。它已经表明,静MSC比骑自行车更耐缺氧和代谢压力细胞(27]。静止细胞的全基因组转录分析揭示了不同的转录因子格局的转变对能源供应的限制40]。

在我们的实验中,我们模拟细胞静止比较静的应激反应和扩散间充质干细胞。实验已经进行eMSC脱屑子宫内膜的经血。认为这些细胞来自子宫内膜。细胞多能的自我更新能力,表达CD13、CD29、CD44, CD73, CD90、CD105标记,造血CD34、CD45标记为负25]。从他们的起源感兴趣这些细胞出现。他们被认为是公认的细胞参与子宫内膜的再生和重构。人类子宫内膜是高度动态的组织再生能力每个月女人生育期间的生活。

静止是一种可逆的细胞周期阻滞在驻留在G0 / G1期细胞。他们可以进入增殖阶段,以应对增长的信号。不同的方法应用于模拟MSC静止在文化41]。培养皿表面的涂层与透明质酸绝大多数人类placenta-derived MSC在G0 / G1相比国家标准组织培养的细胞生长表面(42]。早些时候,作者证明透明质酸基础在这些细胞诱导多药耐药性43]。然而,培养的MSC的静止状态建模通常是通过细胞在无血清培养条件。应该强调,MSC对血清饥饿和敏感扩展血清剥夺诱导细胞死亡(44]。我们选择30 h血清饥饿,没有引发可检测细胞损伤。大多数细胞积累在G0 / G1期,ki - 67是阴性的,不表达细胞周期蛋白A2和其功能目标复审委员会蛋白质参与的过渡G0 / G1的S期细胞周期(45]。

这些细胞受到海关。海关是一个最保守的细胞应激反应。它的特点是转录和蓄热休克蛋白(HSP)。监护人被定义为蛋白质绑定到一个不稳定的和稳定另一个蛋白质的构象异构体。绑定和控制释放的基质蛋白,他们促进其正确的命运。在各种休克,HSP70,分子量70 kDa,是主要的分子伴侣。在轻细胞HSP70存在于细胞质中。商品以及其他压力因素展品健壮的HSP70表达增强及其搬迁从细胞质到核(46]。在恢复期间,HSP70离开了细胞核,就分布在细胞质中。HSP表达返回完整细胞的水平。在我们的实验中,我们观察HSP70的表达,一个高度诱导分子伴侣。我们发现HS触发HSP70的表达基因在两种细胞类型。在增殖细胞在高级别72 h postthermal quiescent-heated文化压力而开始下降后48 h和接近水平的下降在72 h后常温细胞培养在正常培养条件。免疫荧光的评估显示,本地化的HSP70蛋白在细胞核的细胞类型2 h HS之后。在细胞复苏后24小时,HSP70的模式在增殖和静止细胞分布是不同的。加热静止细胞HSP70并不确定但可见细胞核和细胞质的加热增殖细胞。这些发现表明,静止和增殖细胞显示不同海关回复。 Cells heated in the quiescence state are more resistant to HS as they exhibit more rapid return of HSP70 expression and distribution to the norm than growing cells that underwent HS.

一般认为,引发衰老程序的各种压力是由DNA损伤(34,35]。热休克压力因素诱发单-和双链DNA断裂。DNA断裂激活DNA损伤反应(DDR)。在大多数体细胞,DDR是由激活的传感器激酶的ATM(共济失调毛细血管,突变),ATR (ATM和Rad相关),dna - pk(依赖dna的蛋白激酶)。他们认识到DNA损伤,使磷酸化下游信号级联的成员,包括组蛋白H2AX [47]。磷酸化H2AX (γH2AX)焦点所需招聘和锚定DDR参与网站的DNA损伤。γH2AX焦点很容易检测到荧光缩微复制,允许使用它们作为一个可靠的DDR标记。

静和增殖细胞在HS引发的DDR反应不同。伴随着一代细胞加热γH2AX疫源地。他们的最大产量是注册后24小时恢复,之后,它开始下降。72 h后的细胞培养在标准条件下,只有少数细胞内加热静止γH2AX疫源地,但是焦点仍在细胞暴露于海关在增殖阶段。ATR(另一个DDR标记)弱表达完整细胞两种类型。24小时中表达增加加热循环细胞,然后下降。在细胞的静止状态,ATR表达式被海关不激活。ATR的差异表现在两个细胞类型,可能归因于不同的细胞周期分布模式文化受到海关。其区别主要是关注在S期细胞数。在静止细胞接受商品,4%的呆在S期的细胞而HS-treated增殖文化有14%在S期细胞。大多数报告ATR函数链接ATR在S期的重要作用[48- - - - - -50]。文化在S期细胞数较低的抗损伤,不需要和ATR表达DNA损伤修复。

在我们最近的实验中,HS诱导eMSC初步衰老(sip)。这是伴随着修改细胞形态、细胞周期阻滞,和增强的p21蛋白的表达,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(25]。现在,我们已经表明,口在静止和诱导增殖eMSC文化商品。海关停止增殖,细胞类型之后都成为增殖标记为阴性表达ki - 67,获得夷为平地,扩大形态,对SA -是积极的β加染色,表现出更高的p21蛋白表达。细胞存活HS逐渐恢复了正常的表型在正常培养条件。Quiescent-heated细胞比骑自行车更迅速。HS 72 h后,大多数细胞没有显示口特性而增殖状态的细胞暴露于海关仍然保留口表型。

ROS是众所周知的是涉及多种重要的细胞过程包括信号,调节体内平衡(51]。然而,过量的活性氧产生重大损害的细胞结构和功能影响细胞增殖,导致基因组不稳定性,细胞衰老或死亡。各种各样的压力包括过热导致生产过剩的活性氧(52]。

在我们的实验中,海关提高了骑自行车但不是静止细胞ROS水平。在细胞增长,HS诱发增强活性氧产量和过氧化氢酶的表达和SOD1 PRDX4, GPX, TXN2基因。据说,在静止细胞,系统的氧化防御应对任务ROS数量保持在阈值水平比细胞增长更快。它是由非微扰的过氧化氢酶的表达,SOD1, GPX, TXN2控制redox-active蛋白质的合成。

自发的恶性转化的MSC在体外长期扩张的担忧。目前认为,正常的人类MSC不接受在使体外自发转型。肿瘤发生的效力所知甚少的压力,MSC幸存下来。我们执行信使rna序列和评估表达式50次数和49个韵母30.)检查HS-survived培养细胞的致瘤的潜力。所有的细胞都没有不朽的迹象。我们发现所有关键的主要致癌基因和表达的沉默肿瘤抑制在所有调查细胞类型(未加热的控制和细胞受到海关在静止或增殖阶段)。这些结果是在良好的协议与我们以前的结果表明激烈的人类后代的MSC没有显示癌症的标志(31日]。此外,长期培养的MSC幸存HS导致复制衰老(25]。

细胞的后代加热静止或增殖阶段保留了常见的MSC分化的能力。HS-survived细胞内加热静止相比表现出更高的分化潜能循环细胞受到海关的后代。早些时候,我们报道,人类eMSC扩大商品后可以分化成脂肪细胞和成骨细胞以及transdifferentiate成神经细胞(25]。据报道,人类MSC的后代进行了基因毒性压力或不利的条件53,54)保持分化潜能。因此,门店数据表明细胞经历了压力保持分化潜能并没有肿瘤发生的风险的迹象。

集体,我们证明了更高的静压力宽容人类间充质干细胞相比,循环细胞。在生物体中,干细胞面临众多的挑战,应防止过早疲劳,确保组织维护。可以推测的是移植的细胞累积在静止状态,血清饥饿建议一个新的,易于实现,和安全策略来提高移植细胞存活和干细胞疗法的有效性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

俄罗斯科学基金会支持的工作是格兰特(14-50-00068)。

补充材料

表年代:基因本体¹生物过程和生物系统²丰富的分子途径的基因之间的微分表达式没有暖气的细胞和加热静止和激烈的增殖细胞的后代。(补充材料)

引用

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