成骨分化的hDPSCs生物骨磷灰石薄膜

文摘

一项研究报告的结构表征生物磷灰石(BAp)薄膜实现了脉冲电子沉积系统脱去蛋白质的牛骨的消融。薄膜退火400°C表现出成分和结晶度度非常接近的生物磷灰石;这种亲和力是至关重要的获取更快的骨整合与传统相比,厚羟磷灰石(HA)涂层,整形外科和牙科。在这里,我们调查了粘附、增殖和成骨分化的人类牙髓干细胞(hDPCS) as-deposited热处理BAp和化学计量公顷。首先,我们表明,热处理BAp电影可以显著促进hDPSC粘附和增殖。此外,hDPSCs,起初保持典型的呈形态和具备干细胞表面标记,之后开始表达成骨的标记,如Runx-2和OSX。值得注意的,当在成骨培养基培养在退火软面包卷电影,hDPSCs还可以达到一个更成熟的和终端的承诺,对HA和as-deposited电影。我们的研究结果表明,退火软面包卷电影不仅保护典型的具备干细胞的生物学性质,hDPSCs成骨的承诺也提高他们的能力。

1。介绍

20多年来在骨科和牙科领域,金属implants-intended机械联锁和生物整合与宿主骨tissue-have经常涂有生物活性磷酸钙电影为了克服其内在bioinertness [1]。羟磷灰石(HA)已远的主要选择实现这一目标,由于普遍接受相似的无机相骨(2]。由于低成本、高沉积速率和可能获得高度多孔涂层,商业HA涂层目前意识到几乎完全通过等离子喷涂方法(2]。

然而,即使很多在活的有机体内动物实验证实HA-coated金属植入物的证据更好的能力,促进骨再生相比,裸的(3),一些长期的人体试验的结果未能最终展示一个真正的涂层植入物的临床优势(4]。此外,有害的喷涂HA涂层的失败已经指出[5),主要是相关的界面分层,疲劳或出现裂缝。

因为这些问题,替代沉积技术,如磁控溅射、脉冲激光沉积逐渐探索,目的是制造创新的涂料和表现出更高的机械and-eventually-better临床表现6]。

最近,我们开始调查功能纳米陶瓷的沉积薄膜的脉冲电子沉积(PED)技术(7,8]。最有用的功能之一PED技术的高保真沉积的化学计量的目标转移到电影和高效工作的可能性也在室温下(从而使外套也热敏性材料)9,10]。在先前的研究中,我们报告,第一次,纳米薄膜的制备与化学成分和生物磷灰石的结晶度很近,只需使用一个完全脱去蛋白质的牛骨轴作为沉积的目标;在这项研究中,我们使用一个突破升级的PED技术,名为电离喷气沉积(IJD) [11]。这项研究背后的假设是,生物磷灰石薄膜,由于巨大的亲和力与自然骨磷灰石组成和结晶度,将提供更快和更健壮的移植骨整合,相比传统的HA涂层。

在目前的研究中,我们专门调查了粘附、增殖,和人类牙髓干细胞成骨分化等生物磷灰石(hDPSCs)电影,为了未来的临床前研究铺平了道路。人类牙髓是一个非常有趣的干细胞来源细胞由于低侵袭性的程序隔离和干细胞的高增殖和multipotency包含在这个组织12]。在文献中报道,hDPSCs都进行了广泛的调查的特点和对细胞谱系分化的能力来源于三个发育层,主要是由于他们的神经嵴来源的13]。一些报告表明hDPSCs能够向成骨的提交,脂肪形成的,肌原性的血统14,15一起),能够区分对胶质和神经细胞(16,17)和胰岛素生产细胞(18]。在这项研究中,我们评估是否以及如何这部小说生物磷灰石电影能够影响的行为hDPSCs的族群,以前免疫选择表面标记物的表达STRO-1和c - kit,其形态、增殖和成骨的潜力。

2。材料和方法

2.1。薄膜沉积和表征

生物磷灰石和HA薄膜沉积的电离喷气沉积(IJD)技术(19)(Noivion Srl、Rovereto、意大利),所述其他地方(11]。硼硅酸盐显微镜玻片(2×2厘米,厚度1毫米)超声波清洗后被用作基质在异丙醇在水中5分钟,然后额外的5分钟。沉积后,部分样品在空气中退火在400°C 1小时增加结晶度使用20°C分钟的电影⁻¹加热/冷却坡道。

电影形态和表面粗糙度进行了原子力显微镜(AFM)使用一个独立的斯明娜牌照相机AFM (NT-MDT,莫斯科,俄罗斯)在semicontact运营模式在环境条件。表面粗糙度是表示为均方根(RMS)粗糙度和计算平均获得的值在几个不重叠的样本地区,范围从10×10的维度μ米²2×2μ米²。所有图片都是未经过滤的,除了一个二阶水准,和获得的分辨率为512×512像素。

表面润湿性能估计被水接触角(CA)使用Digidrop接触角测量仪(GBX仪表科学化、浪漫、法国)的体积下降~ 0.5μl。接触角值获得至少三个样品表面不同位置,和中值确定。

评价程度的玻璃衬底附着力的电影,微划痕测试执行使用Micro-Scratch测试仪(MST, CSM Instruments-Anton洼地Srl, Peseux,瑞士),ISO 20502规范后测定陶瓷涂料的机械故障模式(20.]。简单地说,一个锥形罗克韦尔C与球面顶端硬度计压头尖笔(120°角,球体半径100μ米)受到累进正常负载从0.01 N 10 N和穿过表面的涂层样品扫描10毫米的速度最小⁻¹和加载速率10 N分钟⁻¹。至少五个划痕是在每个样本。穿跟踪进行了光学显微镜(20 x和50 x缩放)安装在微观划痕平台确定涂层的失效模式,并将它们与发生的负载。在一般情况下,可以观察到一系列的失效模式和用于研究涂层表面的力学行为,爆发的地方nth失效模式定义了法向力Lcn至关重要。

2.2。细胞分离和免疫选择

人类牙髓中提取成人受试者从第三磨牙( )接受常规拔牙后患者的书面知情同意。细胞被孤立于牙髓和以前描述(15]。短暂,从牙齿和牙髓沉浸在消化解决方案(αmem + 3毫克/毫升I型胶原酶和4毫克/毫升dispase) 1 h在37°C。随后,果肉分离,过滤到100μm猎鹰细胞过滤器,为了获得一个细胞悬液。细胞悬液镀在75厘米²烧瓶和维护在培养基(αmem heat-inactivated 10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素),在37°C和5%的公司₂。到达融合,细胞进行了免疫选择通过mac技术(Miltenyi研究):首先,细胞分数表达STRO-1表面抗原是孤立的,通过使用鼠标anti-STRO-1抗体(Santa Cruz),然后积极有序的细胞培养基山肩和扩展。当融合了,STRO-1⁺hDPSCs接受了进一步的免疫选择,通过使用一个兔子anti-c-Kit抗体(Santa Cruz),为了获得STRO-1⁺/ c - kit⁺hDPSC人口。大约5×10⁶细胞被用于每个免疫选择。

2.3。评价细胞粘附和细胞增殖

为了确定哪些涂料可以更好地促进STRO-1粘附和增殖⁺/ c - kit⁺hDPSCs,细胞被播种在2×10的细胞密度³细胞/厘米²as-deposited (HA_AD和BAp_AD)和退火(HA_HT和BAp_HT) HA和软面包卷电影。细胞被监控1周,细胞计数进行日常10日随机选择的字段。在确定最合适的电影,STRO-1和c - kit具备干细胞标志物的表达了在1和3周的文化在标准条件下,通过免疫荧光分析,如[16]。简要,单层细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA)磷酸盐(PBS)在室温下15分钟。删除PFA之后,细胞与PBS冲洗三次,然后饱和溶液中含3% BSA在PBS在室温下30分钟。在PBS泥沙后,细胞培养1小时在室温下用以下主要抗体:鼠标anti-STRO-1和兔子anti-c-Kit,所有稀释1:50包含3% BSA PBS。随后,细胞被洗在PBS包含3% BSA和孵化1小时在室温下与二次抗体稀释1:200年PBS包含3% BSA:山羊anti-mouse Alexa647和山羊anti-rabbit Alexa488(技术)。在PBS洗涤后,样本沾1毫克/毫升DAPI PBS 1分钟,然后安装抗衰落中。

此外,为了评价这部电影是否可以诱发hDPSCs形态学变化,固定的单层细胞接受immunolabeling TRITC-conjugated anti-phalloidin抗体(生命技术)。

对于所有的测试,hDPSCs培养在标准条件下玻璃盖玻片被用作控制。

2.4。成骨分化

为了执行成骨分化,STRO-1⁺/ c - kit⁺hDPSCs被播种在大约2.5×10³细胞/厘米²BAp_HT电影和标准玻璃盖玻片。到达汇合,培养基代替100年与成骨的介质(培养基补充μ米2 p-ascorbic酸、100 nM地塞米松和10毫米b-glycerophosphate) [17]。成骨诱导了3周,然后典型的表达分化标记,如Runx-2 osterix (OSX)和骨钙素(OCN),被免疫荧光和免疫印迹分析评估。

STRO-1⁺/ c - kit⁺hDPSCs播种BAp电影不提供成骨的媒介和hDPSCs培养玻璃盖玻片或塑料组织培养的菜肴被用作控制。

2.5。免疫印迹

完整的细胞溶解产物从无差别STRO-1获得⁺/ c - kit⁺hDPSCs和STRO-1⁺/ c - kit⁺hDPSCs分化成骨的血统,要么BAp_HT电影和玻璃盖玻片,3周后归纳。细胞被收获,轻轻用PBS洗净,细胞溶解在冰上10分钟在低渗的裂解缓冲(30毫米Tris-HCl, pH值7.8,含1%诺乃清洁剂P40, 1毫米EDTA, EGTA 1毫米,1毫米Na₃签证官₄鸡尾酒,蛋白酶和磷酸酶抑制剂;Sigma-Aldrich)。经过短暂的声波降解法和microcentrifugation 12000 rpm 15分钟在4°C,收集上清液和蛋白质浓度测定布拉德福德化验。三十μ从每个样本由g总蛋白质的钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),然后转移到PVDF膜。一夜之间,膜被孵化在4°C兔子anti-Runx2和鼠标anti-OCN (Abcam;稀释1:1000年Tris-buffered盐水渐变20 + 2% BSA和3%脱脂牛奶)。辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit和anti-mouse二级抗体稀释1:3000年在室温下培养30分钟。膜都是可视化使用增强化学发光(Amersham)。Anti-actin抗体被用来控制蛋白质的加载。微被斐济ImageJ上执行三个独立实验的软件。同等面积被选在每个乐队和集成密度进行了计算。数据规范化的背景值和控制肌动蛋白带。值表示为平均数±标准差。

2.6。统计分析

所有实验进行了一式三份。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。区别两个实验条件被配对分析,学生的t以及。差异三个或更多实验样本分析方差分析后跟Newman-Keuls事后考验(GraphPad棱镜软件版本5 Inc .,圣地亚哥,美国)。在任何情况下,意义是 。

3所示。结果

3.1。电影描述

表面形貌由AFM研究。这两部电影从生物磷灰石沉积或HA目标表现出类似的微/纳米颗粒的表面,与粒度从约100纳米小颗粒为较大的骨料(图几微米1(一))。热退火过程并没有大幅修改表面形貌,与之前的数据相一致(11]。然而,表面粗糙度BAp电影略高于HA电影,报道在表1。BAp电影被发现的表面亲水性比相应的电影。热处理后,接触角值减少软面包卷和HA类似的程度;因此,所有的电影增加了亲水性退火。膜粘附在玻璃衬底被微划痕测试(评估数据1 (b)和1 (c))。

一般趋势,软面包卷电影更好地坚持玻璃衬底HA电影相比,缺乏完整的分层(图表示的1 (c)最大负载应用(即)。,10 N), which was instead detectable for HA films. Among the investigated samples, HA_HT showed the lowest adhesion degree, as suggested also by the complete exposure of the glass substrate at extremely low loads (Figure1 (b))。相反,BAp_HT显示粘连程度最高,显示的低数量的电影从微观划痕硬度计压头尖端,把旁边的穿跟踪BAp_AD相比。这个事实清楚地表明显著改善的机械附着力软面包卷膜的基质退火后,由于结晶度的增加(11]。

3.2。细胞粘附和细胞增殖

细胞后播种在HA和软面包卷电影、细胞粘附和细胞增殖在不同时间点进行评估。没有观察到显著差异在24小时后细胞粘附HA和软面包卷电影文化,如相衬图片报道在图所示2。

与此同时,STRO-1扩散⁺/ c - kit⁺hDPSCs培养HA_AD和BAp_AD没有显示通过1周的文化差异,报道在直方图(图2)。有趣的是,观察显著差异,相反,在分析细胞增殖BAp_HT hDPSCs培养,与同行相比HA_HT培养。特别是,细胞生长的显著值测量2和3天,最多7天(图的峰值2; , 对HA_HT)。

与TRITC-conjugated Immunolabeling anti-phalloidin抗体显示hDPSC形态不同的电影(图后粘连3)。他们典型的呈形态完全保存在细胞生长在BAp_HT电影。同时,hDPSCs显示均匀扩散传遍整个BAp_HT电影领域,相比其他电影。也突出了DIC的图像,一个保存完好的附着力BAp_HT底层表面观察到的电影,而电影粘附在HA_HT只是部分维护,几乎没有可检测在HA_AD BAp_AD电影和完全失去。

根据这些初步数据,只有BAp_HT电影进一步表征。

3.3。细胞形态和具备干细胞标记表达式

为了评估STRO-1的表达式和c - kit标记hDPSCs BAp_HT电影培养,免疫荧光分析1和3周后的文化。图4表明BAp_HT电影并不影响具备干细胞标记物的表达STRO-1和c - kit 1周后,而略有降低的表面标记的表达是由共焦检测分析后3周的文化。没有显著差异的表达STRO-1和c - kit在hDPSCs培养观察控制玻璃盖玻片。Phalloidin immunolabeling也表明,呈形态学hDPSCs BAp_HT电影讲究的是类似于hDPSCs种植在控制玻璃盖玻片。

3.4。评价成骨分化

为了试验的影响BAp_HT电影STRO-1的成骨分化潜能⁺/ c - kit⁺hDPSCs, 3周后进行细胞免疫荧光分析标准培养条件下的膨胀后,3周的诱导成骨的媒介。

在标准条件下,hDPSCs表达STRO-1和c - kit标记显示高水平的成骨的标记Runx-2 OSX,而只有轻微染色与后成骨的标记OCN显示(图5(一个))。3周后感应与成骨的媒介,除了Runx-2和OSX表达,也高水平的OCN被观察到。免疫印迹分析表明hDPSCs培养成骨的媒介,在控制盖玻片或BAp_HT电影,显示显著更高水平的Runx-2和OCN相比未分化hDPSCs ( , 和未分化hDPSCs)。有趣的是,hDPSCs培养的成骨的媒介控制玻璃盖玻片表达高水平的Runx-2 (^# ),而hDPSCs分化BAp_HT电影,微密度分析(图做了演示5 (b))。此外,只有未分化hDPSCs种植Runx-2 BAp_HT电影表达水平较高,对未分化hDPSCs种植在控制盖玻片( )。这可能是由于BAp_HT电影引发的能力的初步承诺hDPSCs向成骨的血统,即使在标准培养条件。此外,当分化BAp_HT电影,相比,hDPSCs显示更高水平的OCN hDPSCs分化在控制盖玻片( 控制盖玻片和hDPSCs分化)。

4所示。讨论

基于“仿生原则”(21),涂料完全仿生磷灰石与适当的机械强度,由于更高的化学/无机相的结构关联骨头,有望促进移植骨整合nonbiomimetic磷灰石,相比其他磷酸钙阶段,或不同bioceramic涂料。在这项研究中,我们表明,事实上,纳米生物磷灰石薄膜沉积的小说IJD技术提升一个族群的扩散hDPSCs表达STRO-1和c - kit, HA涂层相比。此外,细胞增殖在HA涂层和as-deposited BAp电影是有限的。

它被广泛报道,表面粗糙度和亲水性/疏水性会强烈影响细胞粘附和增殖22]。特别是,涂料显示好,纳米表面纹理,的沉积在这项研究中,有望提高细胞粘附和传播,由于他们更高的表面积与微结构涂料相比,从而最终促进骨组织再生(23]。此外,对于表面的润湿性,中度或高度亲水表面,沉积磷灰石电影之一,已经被证明是促进细胞粘附和增殖而高度疏水表面(24,25]。

另一个关键参数对薄膜衬底附着力的程度,作为一个稳定和well-adherent电影将提供细胞锚定一个合适的平台和传播,而快速降解或poor-adherent电影将代表一个不稳定的表面损伤细胞粘附。

在目前的研究中,表面粗糙度和润湿性BAp电影略高于HA的电影。然而,这些小差异不能单独证明hDPSC粘附和增殖中观察到的趋势。事实上,如果是这种情况,BAp_AD和BAp_HT应该表现相似,同时,相反,扩散BAp_HT统计增加BAp_HT BAp_AD相比。这个事实,一起共焦图像残留电影的第七天,仅指出BAp_HT显示一个完整的电影,实验时间,表明不同的粘附和增殖hDPSCs要归因于不同的粘附程度中观察到的电影。事实上,正如在图3DIC的图像不同电影的沉积明显表明,经过一个星期的文化只有BAp_HT电影还是现在和均匀附着到底层表面,而其他电影失去了粘附到表面。这个事实可以解释细胞增殖有关的差异在其他电影。在此基础上初步数据,我们的研究集中在BAp_HT电影。事实上,BAp_HT电影保持了文化的沉积,在扩张中、后3周的诱导成骨的媒介,这表明这部电影是牢固稳定,这是一个理想的要求再生医学的成功应用,如骨科和颅面植入物。

电影的粘附在底层阶段不仅可能影响细胞粘附,还STRO-1的增殖能力⁺/ c - kit⁺hDPSCs。的确,在增长动力学干细胞均呈增长趋势,当培养BAp_HT电影,类似文化过程中观察到的细胞增殖率控制玻璃盖玻片。

此外,hDPSCs保存他们的典型的具备干细胞标记物的表达呈形态学和维护经过7天的文化。相反,在3周的文化BAp_HT电影,hDPSCs显示略有减少的表达STRO-1和c - kit标记,同时,一个明显的immunolabeling Runx-2和OSX成骨的标记。特别是hDPSCs分化行为的积极影响软面包卷电影,能够促进自发承诺向成骨的血统,没有添加成骨的介质,并支持早期诱导成骨分化,证明了低水平的Runx2和更高水平的OCN, 3周后的文化在一个感应介质,hDPSCs相比,在标准条件下培养。这些数据证实了免疫荧光分析,清晰地显示表达式和成骨的标记的细胞定位BAp_HT电影,在标准培养基和成骨诱导后3周。

5。结论

这项工作的报告结果表明生物骨磷灰石IJD获得的薄膜技术和随后退火为hDPSC提供合适的衬底附着力,扩散,承诺向成骨分化。进一步的调查通过BAp_HT生物效应的电影在活的有机体内研究将建立真正的牙齿和骨再生潜力整形应用程序。

的利益冲突

作者认为不存在利益冲突。

确认

作者要感谢SPM@ISMN设施支持的AFM图像。

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