抽象性

组织工程正在形成修复受损组织或器官策略当前研究探索使用分解鼠隔膜脚架与人用单流多权细胞合用以提供脚架干细胞构造,允许组织生长/再生期间结构屏障功能我们创建了创新细胞注入系统,允许HAFMSC嵌入脚架中,然后将复合组织植入鼠中,左侧生成插片缺陷控制鼠单接分解隔膜脚架合成组织综合HAFMSC显示生理功能提高和肌肉-腾腾结构提高,而原生反向对映式同鼠分解隔膜架是隔膜修复的潜在辅助材料,带HAFMSC复合移植可加速分解悬膜机恢复功能

开工导 言

组织工程技术在过去十年中快速开发数个成功的生物工程组织正在临床试验中接受评价最近,去细胞化组织被用作脚架生长器官,包括功能性心脏、肺部、肠部和其他器官一号,2..分解过程可用洗涤器和机械扰动清除寄生细胞或组织,留下三维外细胞矩阵(ECM)脚架可用新子细胞或复合法重新播种3-5..分解式ECM脚架的好处包括保护自然器官结构以及维护微血管网络[4,6,7..分解脚架越来越受欢迎并正成为全器官再生常用脚架大器官原封不动大流体中,干细胞再细胞化可以通过血管内注入实现。小组织比较难解决模型中的这个问题,我们开发了聚变机 允许加压投送细胞注入 ECM脚架

遗传分片性热室(CDH)与肺高血压和心肺衰竭相关联的先天分片性分片缺陷,对新科和儿科外科[CDH]继续构成挑战8-10..CDH发生率介于1:2000-4000活胎间,医院费用比非复杂分娩费用高100倍11..可主要修复同源 DigragmaticHernia研究组描述为A型和B型小缺陷12..大型C型和D型缺陷需要补丁13..与CDH关联的早期死亡率下降5-10%,原因是新生儿强化护理改善,与补丁修复相关长期发病率仍然很高,包括肌肉骨架墙变形(67%)、骨质疏松症(13 %)和小肠阻塞(13 %),以及许多婴儿在卸载24个月后体重不足50%未能生长(78%)[14,15..近十年来,临床前科调查员一直在调查生物补丁用于CDH修复,并包括lypic化dura、小肠子膜osa和acellicalderis16-18号..生物补丁单因缺少组织生长而失效,随后重新吸附补丁、弱即时强度、破裂、近邻组织粘合和纤维化组织设计CDH修复补丁力求提高生物机能兼容性并同时减少复发性HERNIA18号-23号..分解式ECM脚架有可能重构原生组织的结构和功能,超出商业从其他组织获取的矩阵分解式ECM脚架与干细胞并用构建复合组织成功用于组织修复,包括隔膜修复23号-25码..PTFE/Gore-TexZQ当前实践以可接受的复发率和感染率算得上有效,简单生物组织可代表优势,特别是大隔膜缺陷

在当前研究中,我们探索使用生物补丁由老鼠隔膜播种的解分解ECM脚架组成,用人称流水多能细胞修复老鼠模型插片缺陷结构功能性计量法用于定义处理结果测试去分解ECM支架与amonic派生干细胞重新分解能否搭建功能复合组织供大鼠模型隔膜缺陷修复

二叉材料方法

2.1.Rat Diphragms分解式ECM文片

组织分解程序有效清除细胞组件和剩余DNA,但保留ECM物理化学结构支持3D结构中的播种细胞生存25码,26..协议中包括 (1) 鼠脑膜切片双膜插管40毫升PBS(50毫升BD)3)将隔膜转换成50毫升管预填0.5%SDS并旋转0.5sec24小时5转隔膜换新管预填0.5%dodegyl硫酸盐并旋转24小时(6) 分解组织转成50毫升管并无菌PBS并轮播24小时和 (7)留组织PBS存储4摄氏度

2.2.Rat Diphragm或分解ECM分片机测试

六头SpragueDawley成人鼠(女150至175克,约7至8周大Charles River实验室)用于生物型捐赠隔膜成功去细胞化后,大鼠隔膜ECM组织编译为5毫米宽x10毫米长带并安装在一个分解室内,与通过多层功率实验室监控测量强度的强制传感器接口匈牙利Balatonfured)组织安装到传感器上后,连接传感器的钩线拉拉塔特,随后的任何收缩都拉下强制传感器并取代传感器由放大器增强的位移图后用图形显示在计算机屏幕上并用时间显示最大力读数~6.0克为这些测量量设置,自6.0余滴ECM脚架

2.3传输电显微镜扫描分解EM

ECM脚架样本固定为TEM准备解析法,内含3%浮度加2%伪甲状腺素0.1Mcoylate缓冲(pH7.3),环境温度为1小时,然后用coylate缓冲冲(0.1M,pH7.3)3x10分钟固化后,样本顺序处理为1%水丁酸30分钟和1%aurianyl乙酸1小时样本脱水后数列乙醇增聚5分钟后转至数列六甲基地铁并夜间喷气样本安装到双棒碳标签板上(TedPella公司、Redding公司、CA公司),这些标签板曾安装到铝标本机上(Ecron显微镜科学公司Ft华府后用BalzerMED010反射器(Technotrade International,ManchesterNH)加白金合金厚度为25纳米并立即在真空中闪存碳样本转归脱水器供日后检验JSM-5910扫描电子显微镜中阅读所有样本(JEOL,USA公司PeabodyMA)加速电压5kV

2.4.hAFMSC隔离识别

hAFMSCs通过amoniccentis(2-5mL)隔离孕妇(18岁及以上,至少16周0/7天在德克萨斯妇产治疗中心病人常规诊断amoniccentes时怀无菌(HSC-MS-111-0593)。样本收集后存储5摄氏度,采购后48小时内处理(机构生物安全委员会)。样本处理,包括隔离扩展,是在ISO7人体细胞生产设施内进行的,符合食品药品管理局当前良好制造实践指南细胞识别基于表层标志 免疫流细胞分析选取一位捐赠者HAFMSC参加当前研究(从20周怀孕时33岁健康白种女性非历史捐赠者中选取)。所选 hAFMSC使用小扁病毒向量(Invitrogen)根据制造商指令预贴绿色荧光蛋白标记

扩展后,aliquot存储液氮供进一步研究hFMSC通过细胞表面标记测试特征:CD90、CD73、CD45、CD34、CD29、CD106、CD10、CD13、HLA-ABC和HLA-DR流态细胞测量,与国际细胞处理学会定义Mesenchyldle我们还评价了体外多辨别能力,包括骨质生成、二分导、分解和线性偏差,如他人描述和前几次报告所描述[27号-31号..

2.5设计并创建细胞播种注入系统

设计注入系统是为了在脚架内创建划一的取素细胞分布一号)流/中位影响能够传输感应细胞并分布到去细胞化ECM深段简言之,捐献式插片ECM脚架(成年母鼠)通过静水压推穿脚架注入室,媒体和细胞推穿脚架机房由两片聚碳酸酯、密封Oring、润滑连接器配件和套机螺丝组成CAD模型爆集图解1(a)并1(b)..聚碳酸盐片从 stock 1++中心孔线程接受润滑安装聚碳酸机械化后,部件用二氯甲烷蒸发光化提高设备光透明性e-EMM系统均以1x10播种4fAFMSC之后,这些复合组织运输(4摄氏度)外科修复老鼠模型生成的隔膜缺陷

(a)
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(b)
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图1
程序设计细胞注入系统二次圆柱路径可加压嵌入介质的细胞穿透一个脚架,结果产生细胞多层脚架的播种注入系统组件中流方向
2.6外科修复插片变形

所有外科程序均获休斯敦德克萨斯大学医学院动物福利委员会批准(协议号AWC-12-080)。SD鼠类使用数N级=40150-175克,7周大,女性Charles River实验室动物放上加热操作平台并连接量控通风机,速率为每分钟85分,潮流量为10cc/kg加2%异休适配麻醉平面通过脚趾抓取确认后,大鼠便无菌地准备并涂层以揭开上角和腹部造出1.5cm中间切片 开始次于xiphoid进程进腹部后,自保腹部反射器被用来暴露肝脏和隔膜3-0染色线接通xiphid和皮肤后以无菌方式固定回溯器以进一步暴露隔膜

电容分解变形长片 并用牙力抓取左侧中位 提供下等温柔反射小缺陷允许插入电容装置端 破解thorac性负压一支18度脉冲管后直接可视化插入thoracic剖析1.2x1.2cm2圆形直径缺陷(约75%环形组织与25%肌肉类组织共表示Hemidiaphragm总值的~40%)由左侧用电容生成,实验补丁以2-3毫米重叠4-6中断5-0prene修复过程用图显示2(a)并2(b).

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图2
外科程序创建隔膜缺陷修复鼠膜通过腹部法探索,外科缺陷生成左侧生成标准缺陷尺寸1.2x1.2cm复合工程组织准备移植完全修复合成工程组织缺陷

关闭腹部 内核用10cc针筒排空efazolin(60 mg/kg)直接施到腹膜上,0.25%bupvacaine渗透入腹膜并沿切口分包组织切口用4-0Vicyrl@双层缝合

2.7生物力伸展测试

目前没有报告测试跨词函数的方法以我们前几次骨骼功能测试报告为基础 创建鼠膜函数生理测试32码-34号电阻测量鼠膜异维4至6个月后外科大鼠用4%异休氏菌麻醉,胸前和腹部用单中线切片接触骨架二分二分跨膜并后移到脊柱心脏穿孔后分片分片切除排行剪剪切后隔膜只加根根并置入Kreb解析法隔膜相切成双三角段,右段代表原生隔膜和左段表示补丁三角段基点和顶点中心角都有一个肋骨后两个段都连接到肌肉启发平台上 支持一端的肋骨段接通两个金属环创建统一电场5-0丝绸缝接上三角段顶端中心内含一个隔膜段的平台安装并固定为机体浴池,内含Kreb解析法并连接氧气供应缝合器随后绑定为预校准罐头使用LabChart应用工具软件强制移植隔膜段伸展至1.0克并用10伏生成基线力比时间曲线隔膜段允许平准30-45分钟,以便最大程度恢复生成力,顺序模拟为1.0克预伸展契约力测量组织段弹性还测量通过顺序延长组织段1.0毫米增量并测量每个增量段的被动或刺激最大强度

2.8语义分析

修复隔膜生物化,从修复边缘部分选择生物化网站进行组织学分析串行8-10显微数解剖Hematoxilin和EOSin染色识别肌肉组织里氏染色法用于分析修复工地组织中的collagen内容(反射形形组织编组)。组织滑动按厂商协议处理核染黑 肌肉纤维染红 collagen染蓝10%马血清(HS)阻塞非专用背景绑定并应用兔子杀Nestin(1:100,圣克鲁斯生物技术)和生物相联CD31(1:150,Chemicon)。二级荧光抗体(1:500,反rabt-594和1:800,Streptavidin-594)应用后,4+6二联苯35码,36号..负控件与所有免疫史化学染色并发光源显微镜视觉化(Nikon显微镜,Niken,Melville,New York)从3到5个不同位置/滑动中捕捉荧光图片时使用20x目标和FITC或DSRED通道而不录入DAPI图像使用imageJ软件分析(NIH,USA),测量阈值平均值灰度数据用Excel收集供进一步分析生成值表示3实验复制和4生物复制的平均值

2.9统计分析

类别外科处理和控制非外科隔膜差别的统计意义是通过单向分析差分测试判定的。发现意义后 举个例子 值<0.05%,后题分析使用Fisher最小差校正统计意义被认为a .

3级结果

3.1.HAFMSCs单词化多功能阵列

人类捐赠hAFMSCs从 健康33岁白种女性获取简言之,人类羊水四百分位离心 15分钟后粒子恢复完全 TheraPEAK免超模干介质(Lonza,Basel,CH)补充20%异源集合人AB血清(Valley生物医学,Winchester,VA),5ng/ml基本纤维生长因子(CellGenix,Portsmouth,NH)和50华府g/mLgnamicin(IrvineScience,Santa Ana,CA)和细胞在37摄氏度培养295%RH环境扩展条件相同,每3-5天改变介质到达80-90%汇合点后,细胞通过TrypLEExpressxe2.CS10介质密码存储器(Biolife Solutions, Bothell和WA)移植前分三细胞解冻、洗净并注入无生素介质并测试近效性、不育性(克染色度14天富氧和厌食文化)、异托毒和免疫型

人类捐赠hAFMSCs后通过流细胞测量分析根据表层标识识别,如我们前几次报告[27号,29..电池满足特定释放标准后释放注入,包括以下免疫机型: < 5%CD34+,CD45+,CD117HLA-DR90%CD29+、CD73+、CD44+、CD13、CD166细胞、负 mycoplasma和克染色图中显示此作业用批量的免疫学构造结果3.HAFMSC还显示三线分解潜力,包括骨质生成、二维生成、分解生成和线性分解4)[27号,29,37号..


图3
流细胞分析hAFMSCshAFMSC当前实验中表示表层标记表示可生存单片百分数百分数CD29、79.5%CD90、0.9%CD45、100%CD73、2.4%CD34、100%CD13、99.5%HLA-ABC、0.3%HLA-DR、0.4%CD106999%CD10、92.6%CD10546.4%CD9、0.1%CD11796.6%CD166和99.9%CD44
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图4
HAFMSC体外多差潜力5天HAFMSC诱导分解与Alizarin红色:(a) 非诱控HAFMSCs和(b) 诱导HAFMSCshAFMSC上传后生成:(c) 非诱控 hAFMSCs和(d) 5天内促导HAFMSCshAFMSC与Tluidine蓝染色体试管使用共生系统时,微信数(rows,C2C12预贴红比特)和hAFMSCs(rowheads,GFP预贴绿标签)为1:1混合f/装配多核极解构件后4天可检测出,其中部分透构件对红染色和绿绿绿GP加在一起都产生阳性结果显示,通过线性聚变而生成的线性分化潜力发生在 mybolasts和hAFMSCs之间
3.2组织分解和细胞注入Vitro

ECM脚手组织由H&E或DAPI染色校验分解后生存细胞缺缺5)EM测试ECM脚手架还显示组织结构或结构前没有变化(图解)。5(a)并5(b)和后(图解)5(c)并5d解细胞化选择适当尺寸ECM脚架开发复合组织,以便使用体外注入系统修复捐赠者HAFMSCs隔膜缺陷6(a)-6(c))

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图5
大鼠隔膜分解程序tEM扫描结果正常鼠膜TEM扫描结果解分 ECM网网格
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图6
细胞注入体外分解式ECM脚手架置入注入室顶部位置修复ECM脚架开始用文化介质向分解ECM脚架注入取素细胞d,e)用DAPI染色法对细胞分布成脚架进行历史分析f) 荧光GFP标签实验

ECM脚架分布于聚碳酸6(a).第二聚碳酸盐法术贴上O环和脚架阻塞螺丝一致收紧以压缩脚架和Oring对聚碳酸盐碎片生成液密封5ml针筒装满体积取细胞,Tluer安装贴入针筒尾端模拟压力计附在T安装上,第三端插入注入设备针头附在设备上,没有安装压力计6(c))静态常压通过人工推送针头并监控压力计压力在不同期间保持不变水平通过语义分析,我们检测到溢出系统可改善向脚架移植细胞,DAPI染色显示6d并6(e)并跟踪GFP标签单元格6(f))

3cm3Rat Diphragm或分解ECM文片机压力测试/Strain测试

图7显示破解式大鼠隔膜ECM开发出类似于新隔离大鼠隔膜的张力(大于90%)。


图7
分解ECM机架试管建模测试最大伸展距离6.0毫米和最大功率6.0克应用到ECM脚架内,结果显示新鲜鼠膜与脱分解式大鼠隔膜间压力/约束相似性
3.4.自然修复复元

契约力生成所有补丁组织 反向控制隔膜组织单脉冲约束测试(最大力)刺激测试模块强度测试,例如火车脉冲刺激单录单脉冲刺激用复合补丁补丁生成77+8%反向hiphragm威力,而50+8%单用去分解式ECM脚架 )复合补丁Hemiaphragms接近常数(1.0MPa)模块抗拉强度为1.2+0.0MPa )表一号)

表1
3.5理学解析解析解析

修复隔膜由填充和再生成的肌肉组织组成(中心核线程图8(a)和修复隔膜显示相似组织8(b))重生组织搭建支持分解ECM脚架有了免疫性,我们发现新隔膜组织是用内分解(生长外围神经管)和血管分解开发的9(a)并9(b)4个月后组织修复使用imageJ软件分析这些免疫史化学污点,测量阈值最小值、最大值和平均灰度值9(a)并9(b))含细胞组成分解式ECM组织导致双血管密度提高(CD31图)。9(a)神经元化图9(b)阳性细胞表示细胞加速渗透和再生 单与解分解ECM脚架群比

(a)
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(b)
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图8
H&E染色辨识鼠膜变换4个月后修复隔膜缺陷后再生成ECM脚架内肌肉组织Tendon类组织(rows、Blue组织)可检测到修复大鼠隔膜内连接新肌肉组织 表示中心核再生肌肉纤维箭形组织
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图9
仿真化学分析 大鼠隔膜内再生长组织CD31阳性细胞(红型)表示修复鼠膜组织内可检测到的血管性神经再生可用嵌入式ECM脚手架内Nestin染色(绿化)评估并用灰色荧光度测度CD31(A)和Nestin(B)。测量显示修复缺陷中发生的重新剖析(c)和再充电(d)。 .

4级讨论

有人建议生物素架与干细胞合并可加速组织再生并导致组织修复自然结构功能[38号,三十九..组织工程流程中将细胞分解为3D脚架时仍然存在挑战36号,40码..测试数种方法将干细胞注入脚架中,例如使用3D打印机、生长因子或化学刺激和带干细胞共生脚架试管[35码,41号-43号..在这次研究中,我们使用细胞注入系统 成功传递取素细胞 3DECM脚手架 建构复合组织体外分解式ECM脚架单可用修复大鼠隔膜组织缺陷,分叉式复合组织和HAFMSC从生理学和语义学学上改善隔膜缺陷的愈合骨骼肌肉或心脏组织使用工程组织进行类似研究显示,带干细胞的复合组织可加速愈合过程并改进功能组织恢复21号,36号,44号-46号..此外,HAFMSCs的好处是自动机细胞源码以尽量减少免疫响应并有2个月的充裕时间窗口允许扩展捐赠 hAFMSCs供出生时使用

我们用电阻exivo测量二维函数创新结果反映人工组织内肌肉恢复、圆形恢复、神经-肌肉结扎和肌肉-腾顿结扎此外,电动启发结果经语法分析确认复合补丁显示最大绑定力和抗拉特性接近原生组织,而单与分解ECM脚架比较直截面结果还显示单用分解ECM脚架或复合组织可用不同层次重构修复缺陷雀巢分解ECM脚架与复合组织有差异, 潜在代表永不增长虽然没有机械故障或回退,但这些脚架在向猪或人等模型扩展时有可能机械性不足。测试分解ECM脚架使用HAFMSC并用自然丝质或生物素素等其他矩阵此外,大型补丁可能需要改良播种方法,可能通过三文治复合组织使用多层分解ECM隔膜手架以潜在支持大隔膜缺陷修复或紧急使用策略与临床相关

5级结论

原生去细胞化电机插件可用作修复鼠隔膜缺陷的辅助材料混合生物补丁将分解ECM脚架与人用单流多能电细胞合二为一,可提高隔膜生物机函数和模块抗拉强度复合组织修复还伴有改善内分化、动脉生成和肌肉电腾再生长

利益冲突

当前研究中不存在金融利益冲突

感知感知

撰文者想感谢Ms.郑迈毛博士提供荧光成像技术协助克伦乌雷和她的团队 帮助生理测试这个项目由德克萨斯新兴技术基金资助