文摘

间充质干细胞(MSC)的基础治疗被认为是一个潜在的组织工程策略实现髓核(NP)再生治疗椎间盘变性(IDD)。然而,这仍然是一个挑战在NP-like诱导MSC分化细胞当MSC移植到NP。本研究的目的是构建聚(D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA)纳米粒子作为TGF -运营商β3控释和建立codelivery制度的右旋糖酐/明胶水凝胶纳米粒子为长期处理discogenesis分化。TGF -β3-loaded PLGA纳米粒子是由double-emulsion溶剂蒸发法和播种均匀水凝胶。形态学观察,评估释放动力学TGF -β3、细胞毒性试验、细胞增殖试验、生化试验内容,存在,immunohistological codelivery系统的分析进行了研究。结果表明,TGF -β3-loaded纳米粒子可以释放TGF -β3逐步。codelivery系统表现出良好的cytocompatibility, TGF -β3,发布可以诱导msc NP-like细胞同时促进ECM-related生物合成。这些结果表明这个codelivery系统可能使用作为一个有前途的载体discogenesis msc原位。

1。介绍

椎间盘变性(IDD)是一种常见的疾病,引起腰痛,颈部疼痛,甚至残疾(1]。IDD影响患者的生活质量,导致一个很大的经济负担。目前,IDD的共同治疗包括卧床休息、锻炼、物理治疗和手术2]。然而,所有的这些治疗只能缓解症状没有针对IDD的病因。因此,没有批准治疗IDD,迫切需要为治疗目标的病因IDD修复椎间盘(试管)。

试管是一个复杂的关节,由三部分组成,中央水化髓核(NP),外层片状纤维环(AF),和软骨终板(CEP),连接相邻椎。IDD被认为起源于NP,不当负载试管导致NP脱水和随后减弱试管吸收压缩的能力(3]。因此,补液的退行性NP可以治疗IDD的关键。先前的研究已经表明,NP细胞的生物活性和数量(npc)在IDD显著降低,导致较低的分泌细胞外基质(ECM)的相关蛋白质,包括aggrecan和II型胶原蛋白(4]。具体来说,aggrecan的主要功能是吸收水分子进入NP,导致压缩试管的吸收功能。因此,增加人大数量和生物活性可以促进恢复NP水化。由于npc的可怜的自我革新能力,细胞疗法的治疗可能是一种很有前途的战略IDD [5]。所有细胞的方法,移植间充质干细胞(msc)的封装在水凝胶已收到最大的关注(6]。

MSC-based战略的一个优势是,自体的细胞很容易收获和迅速扩大在体外。我们更有可能重新生成大量的NP植入细胞。另一个优势是,msc能够区分一个NP-like表型与一些适当的生化方向,如转化生长因子β(TGF -β)[7]和分化因子5 (GDF5) [8]。TGF -β家庭是一种外源性生长因子广泛用于诱导msc discogenesis分化。一般来说,高密度msc在三维(3 d)载体与TGF -用无血清诱导培养基培养β亚型在体外为chondrogenic分化,尤其是TGF -β3 (9),随后,混合植入了NP再生(10]。水凝胶被认为是适当的航空公司,因为他们的流变性质类似的NP和有利cytocompatibility [11]。然而,这种策略是很难申请早期IDD的治疗。由于房颤早期IDD的结构完整性,试管开窗法应植入散装cell-hydrogel混合之前,这可能会加速IDD [12]。因此,一种新的替代可能涉及使用msc的可注射水凝胶作为载体。可注射水凝胶在植入前的液态,注射后变硬在活的有机体内。过程允许最小通过房颤入侵。它有利于避免挤压后植入适应的不规则形状缺陷在NP腔(13]。前体溶液也可以结合生长因子和细胞逆转椎间盘变性(14]。然而,这仍然是一个挑战来维持长期的MSC分化原位(15]。TGF -的半衰期β3只有十分钟在活的有机体内它可以很容易地在体液稀释扩散。如果经济增长因素直接与水凝胶相结合,他们很快就会被降级或取消。因此,很难影响TGF -β通过物理混合(315]。因此,它是特别重要的交付系统构建一个适合持续生长因子的释放。

fda批准的快速发展聚(D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA)长期分化可能是有用的16]。PLGA是解放军和PGA的共聚物有良好的生物相容性,良好的生物降解性、低免疫原性。最近,PLGA用于药物输送和组织工程应用中最具吸引力的聚合物候选人(17]。纳米粒子的制备与传统方法的进步增加了,因为纳米粒子可以交付给不同的身体部位与范围广泛的持续释放药物(18]。PLGA纳米粒(PLGANPs)可以针对一个特定的组织和释放药物局部通过内吞作用[19]。这些PLGANPs也被广泛用于开发抗癌药物输送系统,如紫杉醇、阿霉素、5 -氟尿嘧啶、和地塞米松,有效地制定通过PLGANPs [20.]。它也被纳入组织工程支架控制空间和时间释放生长因子。例如,胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)封装在PLGANPs当植入脊髓诱导增加神经元生存报告王等。21]。如果PLGANPs用作逐步释放生长因子载体到试管,当地维护可能导致足够浓度的TGF -β3 NP再生的长期的过程。可注射水凝胶加上持续释放纳米粒子可以满足临床需求的理想MSC-based微创植入。

在这项研究中,TGF -β3-loaded PLGANPs准备播种成右旋糖酐/明胶水凝胶构建小说codelivery系统长期诱导MSC分化原位。本研究的总体目标是调查codelivery NP再生系统的潜力。为了达到这个目标,我们首先评估释放动力学的TGF -β3、确认TGF -β3-loaded PLGANPs释放足够的TGF -β3在一个适当的discogenesis时间框架。第二,我们调查的cytocompatibility TGF -β3-loaded PLGANPs。最后,我们研究了codelivery系统能否支持细胞增殖,discogenesis分化,msc和功能性生物合成。

2。材料和方法

2.1。制备的TGF -β3-PLGANPs

TGF -β3-loaded PLGANPs准备使用double-emulsion溶剂蒸发法(W / O / W)如前所述[22]。以达到TGF -的浓度β3如前所推荐discogenesis分化的msc、目标释放的TGF -β3 10 ng在1毫升培养基(23]。简单地说,10μTGF - gβ3(美国PeproTech)溶解在0.1毫升蒸馏水(W₁)。随后,PLGA 50: 50(200毫克,24-38 kD, Sigma-Aldrich,美国)溶解在1毫升二氯甲烷(O, Sigma-Aldrich)。后来,TGF -β3解决方案是一滴一滴地添加到PLGA的解决方案。那么解决方案是在冰浴超声治疗。这主要乳化添加一滴一滴地6毫升1%聚乙烯醇(美国Sigma-Aldrich PVA)水溶液(W₂)和超声治疗了。获得W₁/ O / W₂乳液是转移到20毫升0.3%的PVA水溶液与螺旋桨搅拌器和搅拌4小时。随后,固体颗粒在离心后收集。最后,得到沉淀与去离子水清洗三次。纳米粒子被冻干收获和储存在干燥剂20°C条件。

2.2。形态学观察

TGF -的形态β3-loaded PLGANPs检查了扫描电子显微镜(SEM, S3400N二世、日立、日本)和透射电子显微镜(TEM、TECNAI 10、飞利浦、美国)。简单地说,20μL的PLGANPs悬掉在云母,紧随其后的是一夜之间被风干。形态学的TGF -β3-loaded PLGANPs被喷涂后的扫描电镜检查。透射电镜检查,PLGANPs悬掉在铜网的电影。然后多余的液体对铜网边缘与滤纸吸收。接下来,降磷钨酸负染色溶液2分钟,随后轻轻洗了三遍。纳米粒子被风干后的TEM研究。颗粒大小是由激光粒度分析仪(Zetasizer V7.02,莫尔文,英国)()。

2.3。封装效率(EE)

的EE PLGANPs估计的“两步”萃取法(24]。简单地说,约5毫克的冻干TGF -β3-PLGA纳米粒子加入1毫升的乙腈。浮在表面的丢弃,离心后沉淀是颗粒状。颗粒的溶解在PBS和样本(一式两份)再次离心。离心后的上层清液是保存,残渣溶解在氢氧化钠。蛋白质在水溶液和氢氧化钠(实际数量理论加载的TGF -β3封装在PLGANPs 5毫克,)是由酶联免疫试剂盒(美国热费希尔科学)()。TGF - EEβ3 PLGANPs计算如下: 在哪里的理论加载量TGF -βPLGANPs 3封装在5毫克。

2.4。释放动力学的TGF -β3

释放动力学的TGF -β3确定在体外如前所述(25]。简单地说,TGF -β3-loaded纳米颗粒(50毫克)停牌3毫升的PBS,摇晃在100 rpm 37°C。上层清液收集和储存在−20°C在预先确定的时间点(天1、3、7、10、14、21日和28日)后离心分离。然后,等量的新鲜PBS添加和孵化如前所述。TGF -的释放量β3是由酶联免疫试剂盒。纳米颗粒的释放动力学曲线得到使用累积释放百分比()。

2.5。隔离和鼠标msc的文化

动物的使用遵循当地动物伦理委员会的指导方针(SYXK (YU), 2012 - 0012年)。骨骨髓来源msc收集从之前的6周大的Balb / c小鼠为研究[26]。简单地说,鼠标被颈椎错位。骨髓被冲洗的股骨和胫骨收获完全培养基(杜尔贝科的修改鹰的介质(美国HyClone DMEM)补充10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)和1%青霉素和链霉素(美国Gibco)]。msc被隔绝骨髓细胞密度梯度离心(1.077克/厘米³)。删除不依从细胞后3天,收集粘附细胞的胰蛋白酶化(美国Gibco trypsin-EDTA 0.05%)达到90%的融合。每2天中被改变。

2.6。生活/死亡分析

四组细胞毒性试验的选择:(1)TGF -βTGF - 3-PLGANPs:补充β3-loaded PLGANPs在1000的浓度μg / mL培养基;(2)TGF -βTGF - 3组:补充β3在10 ng / mL的浓度培养基;(3)PLGANPs组:与空白PLGANPs补充1000的浓度μg / mL培养基;(4)对照组:不补充培养基。除了TGF -β3组,msc或MSCs-seeded混合动力车和完整的培养基培养。细胞培养与0.1% Triton (Beyotime生物技术、中国)选为消极的控制。为了评估PLGANPs的细胞毒性,msc被播种在24-well板块1×10的密度⁴/好。一天后,培养基被和1毫升浓度的培养基包含PLGANPs 1000μ克/毫升细胞后添加到井附件。7天的coculture后的细胞毒性进行了评价在体外由生活/死可行性/细胞毒性试验设备(美国英杰公司)根据制造商的指示。染色观察细胞的荧光显微镜(LSM 510、蔡司、德国)。活细胞比例计算图像J软件(美国国立卫生研究所的韦恩Rasband)。三张图片从每组三个样品进行了评估。

2.7。建立Codelivery系统

右旋糖酐和明胶从Sigma-Aldrich获得。氨基酸的氧化葡聚糖(Oxi-Dex)和明胶(amino-Gel)准备与我们前面的研究(27]。最终的解决方案是透析(JinKeHongDa MWCO 7000年,中国)对蒸馏水3天。然后,冻干获得的产品。右旋糖酐和凝胶溶解在PBS达到20%的浓度。封装和持续释放过程表现出图1。简单地说,TGF -β3-loaded PLGANPs或空白PLGANPs Oxi-Dex停牌的解决方案。接下来,amino-Gel的解决方案是添加到混合物的质量比右旋糖酐和明胶3:5的浓度为20%。最终的解决方案被转移到一个模具快速凝胶为5分钟。PLGANPs在水凝胶的密度是1000年μg / mL,将达到TGF -β3系统中的10 ng / mL的浓度根据释放动力学。1毫升的培养基添加和改变每天以下测试。电池封装,msc (P3-P5)预拌的密度与预聚物的解决方案5×10⁶细胞·毫升⁻¹。和混合的一个圆柱体(毫米,高度= 6毫米)和培养生物反应器循环系统。混合动力车被分为四组:(1)TGF -β3-PLGANPs: TGF - msc封装在水凝胶β3-loaded PLGANPs 1000密度μg / mL,与完全培养基培养;(2)TGF -β3组:水凝胶的msc封装没有补充,培养中等含TGF -β3在10 ng / mL的浓度;(3)PLGANPs组:空白的msc封装在水凝胶PLGANPs 1000密度μg / mL,与完全培养基培养;(4)对照组:水凝胶的msc封装没有补充,与完全培养基培养。

2.8。3 d细胞增殖

检测细胞增殖的msc codelivery系统,水凝胶被转移到24-well板在7天的时间点,14日和28日。然后,新鲜培养基含有10% CCK-8添加3 h孵化。孵化溶液的吸光度测量使用标450海里(美国Bio-Rad型号550)()。

2.9。生物化学分析

检测细胞活力和ECM存款,MSCs-seeded混合动力车冻干7天,14日和28日。DNA和粘多糖(呕吐)之前所描述的内容进行了分析28]。羟脯氨酸(忧郁)内容是根据前一个量化方法(29日)()。

2.10。实时PCR试验

postseeding 28天之后,梗塞部位混合动力车是处理试剂盒(基因工程技术有限公司、美国)。RNA提取根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸是由应用cDNA逆转录工具包(美国生活技术)和稀释到5 ng /μ分析了l .基因表达定量实时PCR(美国应用生物系统公司7500年热费希尔科学)。计算的数据方法。在这项研究中使用的引物如表所示1。

2.11。免疫组织化学分析

组织学分析的细胞形态和ECM分泌,混合动力车从每个时间点(7、14、28天)搬进了石蜡。然后以可视化ECM沉积的混合动力车,第二部分是由胶原蛋白应用和aggrecan报道方法(30.]。aggrecan (sc - 16492 1: 400年,圣克鲁斯生物技术,美国),II型胶原蛋白(1:400年,ab34712 Abcam,英国),和山羊anti-mouse辣根peroxidase-conjugated二级抗体(美国Cwbiotech 1: 1000年,CW0102)被应用于分析。

2.12。统计分析

平均值±标准偏差(SD)是应用于当前研究中的定量数据。组之间的差异进行了分析通过方差分析SPSS(15.0版本、IBM、美国)。Student-Newman-Keuls采用测试比较两两之间的组织。差异被认为是重要的双边概率小于0.05时。

3所示。结果

3.1。形态学和释放动力学TGF -β3-Loaded PLGANPs在体外

扫描电镜的TGF -β3-loaded PLGANPs图所示2(一个)。光滑表面的粒子表现出对纳米球体。如图2 (b)TEM图像显示,纳米颗粒分散,他们的大小是一致的。测试样品的粒度呈现正态分布(图2 (c)),纳米颗粒的直径nm。右旋糖酐/明胶水凝胶的总形态TGF -β3-loaded PLGANPs图所示2 (d)。

释放动力学TGF -β3在图所示3。在第一天,TGF -β3被释放在破裂释放的百分比%。随后,持续释放药物和稳定逐渐减少的百分比在中间阶段第二天到14天的释放%的TGF -β3从纳米颗粒在这个阶段被释放。28天后,累积释放百分比达到了%。TGF - EEβ3在PLGANPs%。它表明,TGF -β3中加载PLGANPs长期稳定就会获得释放。

3.2。PLGANPs细胞毒性和细胞增殖的msc Codelivery系统在长期的文化

荧光寿命/死污点被用来评估PLGANP内化的影响。活细胞是由钙染色,产生绿色荧光。膜组成EthD-1死去的细胞,产生一个红色荧光。荧光图像获得的msc PLGANP接触后7日内图所示4。没有显著差异MSC的生存能力在所有组7天(),尽管几乎所有的死细胞被发现与PLGANPs集团孵化。结果表明,PLGANPs几乎没有细胞毒性暴露浓度和好的cytocompatibility当PLGANPs TGF -加载β3所示。

CCK-8试验是进行量化codelivery系统msc的增殖活动。较高的光密度(OD)表示更大的细胞数量。如图5的细胞增殖活性的msc TGF -β3组在统计学上高于其他组postseeding 7天后()。14天,TGF -提供的mscβ3在中等或TGF -β3-loaded PLGANPs展出OD值高于其他组()。细胞代谢活动是更高的TGF -β比TGF - 3组β3-PLGANPs组,但差异不显著(1.1倍,)。postseeding 28天之后,包含TGF -的媒介β3和TGF -β3-loaded PLGANPs可以促进细胞增殖显著大于其他组(),但没有明显的差异,可以发现两组之间)。结果表明,TGF -βTGF - 3-loaded PLGANPs会释放活跃β3 codelivery系统,TGF -β3能促进长期的细胞代谢。

3.3。Codelivery系统对MSC表型的影响

播种msc在28天的discogenesis表型是调查中存在,如图6。一般来说,TGF -β3可以诱导msc分化成NP-like细胞。postseeding 28天之后,KRT18的表达调节更TGF -β3、TGF -β3-PLGANP群体比其他群体()。TGF -β3组,相对于TGF -表达明显升高β3-PLGANP集团(1.84倍)。TGF -构造培养β3-loaded PLGANPs,嘘的表达是3.7,2.8,和1.9倍大于控制,PLGANP, TGF -β3组,分别为()。TGF - Aggrecan表达式β3-PLGANPs组为24.7、13.3和1.4倍后28天的文化比控制,PLGANP, TGF -β3组,分别为()。II型胶原蛋白的表达αTGF - 1β3-PLGANP组为2.1——2.2倍高于控制和PLGANP组,分别为(),经过28天的文化;然而,TGF -没有显著区别β3-PLGANP和TGF -β3组()。这一现象表明,TGF -β向NP-like 3-loaded PLGANPs可以诱导分化细胞有效的表达,促进NP-selective ECM-related基因。

3.4。生化Codelivery系统的内容

如图7(一),DNA含量测定的结果同意CCK-8化验。增强细胞增殖活动也体现了更大的DNA含量升高至28天比天混合TGF - 7和14β3-loaded PLGANPs(1.9和1.2倍,分别地。)。

如图7 (b)恶作剧的内容是不断升高的混合文化时期TGF -β3-PLGANPs(1.9倍到2.4倍高于7天,)。插科打诨的内容明显更大的TGF -β3-PLGANPs组相比,控制和PLGANPs组在14至28天(),但不是postseeding(7天)。GAG含量明显高于TGF -β3-PLGANPs组比TGF -β3组28天(高1.2倍,)。

如图7 (c),忧郁内容为1.0——1.1倍大14至28天后文化在对照组,分别,而第七天()。TGF -β忧郁3-PLGANPs集团内容1.5 - 2.3倍大,分别,而第七天()经过14至28天的文化。有明显高于TGF -忧郁的内容β3-PLGANPs组比PLGANPs组在整个时期()。postseeding 28天之后,忧郁的内容显著更高的TGF -β比TGF - 3-PLGANPs集团β3组(1.1倍,)。

如图8组织学染色显示,msc在所有的组织表现出圆形形态作为本地npc。有更多的细胞集群与TGF -混合β包含TGF - 3-loaded PLGANPs和媒介β3所示。免疫组织化学分析显示ECM分布在细胞质和pericellular地区。更高的aggrecan和II型胶原沉积可以发现TGF -β3-PLGANPs和TGF -β3组。ECM能找到的最低沉积PLGANPs和对照组。这些结果显示细胞增殖和ECM-related生物合成的msc可以提升TGF -β3-PLGANPs。

4所示。讨论

由于加速老龄化,治疗IDD近年来已被广泛认为是。生物治疗IDD可能更适合减轻疼痛,修复退化的NP,和恢复的生物力学功能试管比传统治疗(31日]。然而,适当的植入和交付策略仍在探索。codelivery系统的优势建立在目前的研究中是可以应用微创注射,可以促进长期分化成NP-like细胞原位。本研究的目的是评估的潜力与TGF -水凝胶β3-loaded PLGANPs长期诱导msc分化,促进NP再生。

在这个codelivery系统,所述的水凝胶由Schiff-based交联反应。右旋糖酐和明胶的组成包括天然材料,网站提供一个胶封装细胞(32]。他们的生物降解性也为细胞增殖和基质分泌提供了空间。同时,Oxi-Dex和amino-Gel预聚物在液体状态,而凝胶时间大约是58秒后混合,这对于临床注射的应用程序是可行的。虽然右旋糖酐/明胶水凝胶机械弱作为NP的植入,植入支架不会携带太多的压缩IDD的早期阶段,由于机械结构不受损。此外,材料的醛组可以与组织的表面反应,导致水凝胶修复组织表面通过共价键(33]。组织整合将封装msc和PLGANPs防止泄漏,促进长期codelivery系统的有益影响。因此,右旋糖酐为msc /明胶水凝胶是一种合适的载体。

药物的释放百分比和时间取决于运营商的降解率。PLGA是一个著名的药物输送系统的载体。一般来说,低分子量的PLGA具有更高比例的PGA迅速退化由于其亲水性和无定形状态引起的乙醇酸含量高。相反,更高分子量的PLGA与解放军使纳米粒子更疏水的比例较高,而减缓退化(34]。因此,药物的释放时间可以很容易地控制几周到几个月通过调整中国人民解放军/ PGA比率。根据软骨形成过程,TGF -β3需要持续释放时间超过一个月(35]。与此同时,TGF -β3是一种亲水蛋白,类似于PGA。因此,PLGA相对较低的分子量和高PGA内容(解放军:PGA = 50: 50)被选为达到相对快速退化为载体材料用于本研究。

SEM扫描表明,TGF -β3-loaded纳米粒子是球形,光滑的外观。TEM图像显示,之间没有明显的粘附颗粒,表明适当的分散。这将是有益的TGF -如果纳米颗粒均匀,均匀分布β3水凝胶的浓度。在先前的研究中,与TGF -水凝胶β构建了)下载微球,并表现出良好的软骨形成活动的msc (36,37]。与这些微米大小的微球相比,可以显著提高注入能力通过使用纳米尺度的PLGA codelivery系统。针穿刺会加重IDD,甚至IDD的用于建立动物模型38]。兔子试管进行环形针穿刺使用16 - 21 G针头导致变性后8周(38,39]。由于完整结构的试管IDD的早期阶段,应有效地保护环结构。然而,注射时无法避免的细胞疗法应用于早期IDD。令人鼓舞的是,PLGANPs可以注射比微米大小的微球细针,减轻环形损伤。因此,PLGANPs尤其适合作为药物载体治疗早期IDD。

所需的药物输送率是一个必不可少的条件对于一个成功的药物输送系统。一般来说,药物释放可以大致分为以下三个阶段:破裂释放时期,稳定的周期,加速时期。纳米粒子表现出相对较低的破裂释放在第一天。然后,TGF -β三是稳定释放2至14天的纳米颗粒。累积释放大约是56.4% 28天。一般来说,TGF -β3-loaded PLGANPs在这项研究中建立了一个仓库与低破裂释放,这是理想的长期持续的药物释放和满足discogenesis差异化的需求原位。在先前的研究中,TGF -β3也可以固定在支架控释[40]。drug-immobilized脚手架可以释放TGF -β3在一个长期的文化和诱导chondrogenic分化。然而,TGF -β3交联支架通常表现出更高的突然释放。高浓度的TGF -β3以上10 ng / mL可能损害软骨形成的msc据克拉克et al。23]。因此,PLGANPs的稳定版本系统在这个研究可能是一个合适的替代长期软骨形成。

细胞的生存能力在所有的组大于94%,表明TGF -β3-loaded纳米颗粒和空白纳米颗粒都有利cytocompatibility展出。调查的细胞增殖与TGF -水凝胶β3-PLGANPs MSC discogenesis期间,封装MSC的增殖是28天的评估。如图4,仅PLGANPs没有明显的在测试期间对细胞增殖的影响。TGF -β3-PLGANPs和TGF -β3组,msc的细胞增殖显著增强,已被史和Massague [41]。这种现象可以归因于TGF -这一事实β3可以激活Smad复杂,随后激活p15Ink4b启动子(42]。这也可以证明codelivery系统中的DNA含量逐渐增加。结果表明,高代谢活动的msc与TGF -在水凝胶中维护β3-loaded纳米颗粒,分化奠定了基础。

由于低细胞密度在NP,移植大量自体的细胞,如msc、适当的载体可能是一个有效的策略促进新组织的形成(43]。这个策略,恰当分化表型是NP的再生的基础。msc可以区分向chondrogenic血统的协助下TGF -β3,就是证明的upregulation aggrecan(能)和II型胶原蛋白(Col2)α1。然而,由于缺乏人大表型,本机NPC总是视为位于细胞和由软骨形成标记的表达,如SOX-9、Col2和能。因此,它不能决定是否实际上msc分化成npc在很多研究中得到验证。然而,软骨细胞的组成和生物功能和npc明显不同(44]。ECM由软骨细胞分泌比公布的npc的要严格的多,不适合在NP流体增压。因此,差异化不当可能导致未能恢复功能。如果选择msc作为细胞来源,促进NP再生,有必要确定分化细胞的细胞表型,以确保适当的ECM存款(45]。鼠中确定标记数组显示相对重要的微分表达式在人类npc和关节软骨细胞,尤其是KRT18 [46]。这些结果也证实蛋白质含量与免疫组织化学(47]。此外,声波刺猬(嘘)是一个刺猬家族的配体,并有选择地表达年轻NP, Dahia等人报道(48]。嘘npc的正常运行,需要是一个潜在的重要表型npc (49]。封装与TGF - msc在水凝胶β3-PLGANPs导致显著增加KRT18 NP表型标记基因和嘘相对于控制和PLGANP组。特别是,有一个更高的表达嘘TGF -β比TGF - 3-PLGANP集团β3组。这些积极的结果表明,codelivery系统可以有效地诱导msc的discogenesis分化引发的TGF -β3原位,建立一个基础增强植入细胞的生物合成。

的生物合成的活动存在TGF - mscβ3-loaded纳米颗粒被证明与一个扩展文化通过增加呕吐和忧郁。有趣的是,蛋白合成水凝胶TGF -略高β3-loaded PLGANPs比TGF -β在28天3-supplemented培养基。有两种可能的解释这一现象。一方面,由于水凝胶的体积大小,TGF -β3在中可能无法渗透水凝胶的中部地区。TGF -的浓度梯度β3可以从外到内面积下降。相反,纳米颗粒可以在上述水凝胶作为分配均匀。因此,TGF -β3可能达到的内部区域水凝胶和激活更多的msc在水凝胶。另一方面,TGF -的半衰期β3在中是相对较短。随着时间的延伸文化,生物效应观察TGF -持续时间较短β3也逐渐增加。

集群的msc位于圆形形状codelivery系统显示细胞增殖状态的退化的面积脚手架,朝着discogenesis分化。研究结果也表明,aggrecan和II型胶原蛋白表达在TGF -调节β3-PLGANP和TGF -β3组。ECM-related蛋白开始分发pericellular地区,表明新的NP组织形成。由于相对较短的文化时期,支架不够退化为组织提供更多的空间的形成。进一步的实验需要进行确定长期的文化的影响。

在目前的研究中,一个限制是混合培养在体外,介质条件适用于MSC增殖。这可能影响了MSC在严酷的生存能力和影响长期再生微环境的NP在活的有机体内高酸度和低营养供应,这是(50,51]。此外,我们发现,水凝胶的浓度为10%的结构很容易损坏后长期的文化在体外在我们先前的研究。因此,我们应用水凝胶具有更高浓度的20%,发现结构是足够稳定,但这可能会损害其注射产权。在将来,一个在活的有机体内研究应该进行探讨msc的生存能力和生物合成的情况和测试codelivery NP注入系统的可行性。

5。结论

总之,在这个系列的在体外研究中,我们成功地建立了一个codelivery系统与TGF -右旋糖酐/明胶水凝胶β3-loaded PLGANPs。纳米颗粒可以稳定释放活性TGF -β3长期。这部小说的区分潜在的混合被诱导msc discogenesis细胞进行验证原位28天的期间。可能codelivery系统可以应用治疗早期IDD使用自体msc。在未来的研究中,我们将探讨msc的长期再生效果使用IDD的猪交付混合在一个大的动物模型。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Yibo Gan和李Sukai这项研究同样的贡献。

确认

作者感谢德英陈优秀的技术支持。这项研究由中国国家自然科学基金委资助(批准号81272029),军事物流的关键项目(批准号BWS13C014-1),初步第三军医大学军事医学基金(批准号SWH2013JS04)。