文摘

支架由蚕丝蛋白来源于驯化蚕蛾的茧家蚕展示了支持附件和增长潜力的人类缘的上皮细胞(对待)在体外。在这项研究中,我们试图进一步优化协议来促进及细胞的扩张b .森蚕丝蛋白——基于(BMSF)的支架。BMSF电影最初涂上不同的细胞外基质蛋白,然后分析了影响角膜上皮细胞粘附,细胞形态和文化confluency。第三结果表明,胶原蛋白,胶原蛋白,胶原IV持续改进HCE-T细胞粘附,提拔一个细长的细胞形态,增加文化confluency。相比之下,ECM涂层主要的性能没有显著影响及细胞培养BMSF电影。在本研究的第二部分,主要及细胞生长在BMSF电影媒介的存在(闪)补充角质细胞生长因子(KGF)和ρ激酶抑制剂,y - 27632。结果表明,闪中补充了KGF和y - 27632急剧增加的角膜分化标记物的表达,角蛋白3和角蛋白12,而祖标记的表达,p63似乎并未显著影响培养基的选择。

1。介绍

角膜上皮细胞祖细胞是至关重要的维护眼部表面光滑,透明的。这些所谓的“角膜干细胞”都集中在周边或角膜缘的保证金(1)和表达分子标记的典型上皮细胞祖细胞包括转录因子p63 [2- - - - - -4]。相比之下,成熟的角膜上皮细胞覆盖中央角膜和suprabasal层缘的上皮是由coexpression角蛋白3和12 (1,5- - - - - -7]。

损失的角膜上皮细胞祖细胞通过疾病或损伤导致痛苦的因“角膜缘干细胞缺损和眩目的条件称为(LSCD) [8- - - - - -10]。LSCD的典型症状包括覆盖角膜和结膜表面的上皮细胞和血管化角膜基质。策略用于治疗LSCD基于植入角膜上皮细胞的祖细胞来源于一个自体或捐赠组织来源(11,12]。通常,上皮细胞祖细胞培养和植入而依附于某种形式的脚手架。最受欢迎的选择培养角膜上皮植入支架为剥蚀羊膜(点)。限制与使用,然而,包括可怜的透明度和疾病传播的风险13),鼓励发展等替代支架膜来自丝绸之结构蛋白,蚕丝蛋白(14]。

近年来,支架制作蚕丝蛋白产生的驯化蚕蛾家蚕(BMSF)展示了潜力眼科使用由于其独特的抗拉强度,控制生物降解性,透明度,兼容一系列眼部细胞类型(14- - - - - -19]。例如,BMSF-coated表面和独立膜支持附件,增长,人类角膜上皮细胞祖细胞分化[14,15,20.]。在这些研究之前,上皮细胞对BMSF已经通过serum-supplemented培养基的使用。进一步改善角膜上皮细胞附着和生长,然而,可能会通过涂层的BMSF纯化细胞外基质(ECM)的蛋白质。此外,比较研究角膜上皮细胞祖细胞生长的培养基对BMSF缺乏。特别是,越来越多的证据表明增加培养干细胞的自我更新和分化从眼部组织可通过附加的ρ激酶抑制剂,y - 27632,角质细胞生长因子(KGF)培养基(21- - - - - -23]。因此,本研究的目的是确定当前的协议体外扩大人类缘的上皮(对待)细胞培养BMSF电影可以提高(1)涂层蚕丝蛋白与特定的ECM蛋白质或(2)利用媒介与y - 27632和KGF补充。先前的调查进行的使用BMSF-based支架支持角膜上皮文化主要用在家乡和角膜上皮细胞(14,15,17,24- - - - - -26]。比较,在本研究的第一部分,涂层的影响与ECM BMSF因此评估使用一个家乡的角膜上皮细胞系(HCE-T)和初级及细胞。文化评估细胞粘附、细胞形态和文化融合。在本研究的第二部分,不同的文化的影响媒体的表达标记与祖或分化表型相关评估在初级及细胞培养建立在蚕丝蛋白的电影。

2。材料和方法

2.1。制备BMSF电影

b .森茧的蛹删除由日本田岛Shoji有限公司(日本横滨)。蚕丝蛋白的水溶液4% (w / v)的准备b .森蚕茧加工使用前面描述的材料和技术,使用1个月(14,15]。蚕丝蛋白的解决方案是涌入24 - 96或者T25烧瓶蚕丝蛋白涂层。协助干燥、蚕丝蛋白涂层被放置在室温下(RT)风动烤箱12 h,然后水退火(盛有水的烧杯)−80 kPa在一个真空室6 h RT,蚕丝蛋白表面在70%乙醇消毒30分钟,然后洗了三次在PBS。

2.2。涂层与ECM BMSF

BMSF-coated 24 - 96以及组织培养板涂以ECM蛋白质在5μ促进角膜reepithelialisation g / mL。胶原蛋白I(细胞矩阵),胶原蛋白III(微孔),胶原IV (Sigma-Aldrich)、纤连蛋白、层粘连蛋白(从Sigma-Aldrich)和vitronectin (Promega)稀释到5μ在PBS g / mL,应用于蚕丝蛋白表面,然后干在RT风动烤箱12 h。

2.3。建立HCE-T和初级及细胞

2.3.1。HCE-T细胞

调查开始使用一个人类角膜上皮细胞系(HCE-T)中被永久地传颂。细胞在DMEM传播高葡萄糖补充10%胎牛血清的边后卫,400μ谷酰胺,青霉素100单位/毫升(表达载体),和100年µg / mL链霉素(表达载体)。独立自主的工作股票STR概要分析Garvan医学研究所(澳大利亚悉尼)显示97%匹配有两个参考HCE-T细胞株(RCB1384和RCB2280)。

2.3.2。及细胞

从人类研究伦理委员会批准后(HREC)和捐助昆士兰眼库同意(澳大利亚布里斯班),尸体人眼组织收获建立及细胞的主要文化。缘的上皮细胞是通过机械剥离(与弯曲的钟表匠钳刮)后角膜消化1小时2.5毫克/毫升Dispase (Gibco)解决方案在37°C。分离及细胞被传播的辐照小鼠3 t3馈线细胞及介质(也称为绿色介质)如前所述[15]。简单,介质是由一个3:1的混合物杜尔贝科修改鹰的介质和火腿F12培养基(英杰公司)与10%的边后卫,1毫米消息灵通的缓冲区(表达载体),5µg / mL重组人胰岛素(Actrapid), 0.4µg / mL氢化可的松(法玛西亚),4µM谷酰胺(表达载体),下午2点三碘甲状腺氨酸(Sigma-Aldrich), 200 nM腺嘌呤(Sigma-Aldrich), 100国际单位/毫升青霉素(表达载体),100年µ0.25 g / mL链霉素(表达载体)µg / mL两性霉素B(表达载体),和10 ng / mL重组人表皮生长因子(Sigma-Aldrich)。

实现80%的confluency,及细胞和辐照小鼠3 t3馈线细胞被播种到fibroin-coated T25烧瓶和24-well组织培养板的密度1×10⁵细胞/厘米²和2×10⁴细胞/厘米²,分别。及细胞随后在绿色的或补充荷尔蒙上皮培养基培养(闪),结合杜尔贝科的修改鹰的中/火腿的F-12营养混合物(DMEM / F12;表达载体;1:1)包含1.05毫米钙补充5µg / mL结晶牛胰岛素(Sigma-Aldrich), 30 ng / mL霍乱毒素(Calbiochem), 2 ng / mL EGF, 0.5%二甲亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich), 0.5µg / mL氢化可的松,5 ng / mL亚硒酸钠,5µg / mL apotransferrin和补充10%的边后卫。闪媒体也补充了y - 27632 (10µ米)和KGF (10 ng / mL)(从英杰公司)。生长培养基变天3,5,7,每隔一天后第七天,直到完成。在7到14天,在24-well组织培养及细胞培养板固定用4%甲醛和洗3次immunoflourescence PBS。同时,及细胞培养在BMSF-coated T25烧瓶进行后续qPCR RNA隔离程序分析。

2.4。细胞连接试验

HCE-T或及细胞被播种到fibroin-coated井密度10⁵细胞/厘米²。避免意外的细胞依恋因素从serum-supplemented媒体,HCE-T细胞悬浮在角化细胞无血清培养基(KSFM;热费希尔科学)包含0.09毫米钙补充牛脑垂体提取物30毫克/毫升、0.2 ng / mL EGF和氨苄青霉素和链霉素。盘子在37°C 5%孵化有限公司₂在PBS为90分钟,洗一次,然后用4%甲醛固定。贴壁细胞的数量取决于染色文化与赫斯特染料(英杰公司)在100毫米消息灵通的缓冲区1 h RT想象细胞核。细胞被洗了三次蒸馏水,观想通过荧光显微镜,拍摄使用标准化矩阵五(10 x)领域的观点。细胞数量确定手动使用ImageJ软件。这个过程被重复使用的主要及细胞。

2.5。细胞离心率和Confluency

检查细胞离心率和confluency变化,3×10⁴HCE-T细胞/厘米²被播种到96孔ECM-coated蚕丝蛋白DKSFM板块。盘子被孵化IncuCyte变焦内活细胞分析系统(埃森生物科学)与照片捕捉到了每小时72小时。随后创建一个处理定义后,一组基本指标分析了使用阶段对象分析来确定细胞离心率的变化与完美的圆(范围从0到1的值为0)和confluency(图像面积的百分比被细胞)。

2.6。表型分析及文化生长在BMSF-Coated井

评估潜在的表型差异在两个不同的媒体BMSF-coated表面,细胞培养两种标记的角膜上皮细胞表型,p63(祖标记)和角蛋白3/12(分层,分化细胞),检查。兔多克隆抗体,p63(1: 100稀释,BioLegend)和一双鼠单克隆抗体,细胞角蛋白3/12(1:700稀释,微孔)被用来执行免疫细胞化学。最初,HCE细胞BMSF-coated井被封锁在5%正常山羊血清(上天)PBS含有0.5% Triton x - 100 30分钟。主要抗体稀释1%门店随后被应用于RT 1 h。井洗3次在PBS去除游离抗体前二次抗体(1:200稀释,Alexa萤石488 anti-mouse或Alexa萤石594 anti-rabbit;英杰公司)是应用于RT 20分钟。

2.7。RNA隔离

及细胞培养BMSF-coated T25烧瓶处理RNA提取使用前面描述的方法(27]。短暂,RNA提取立即开始前文化(天0)和文化也在每天7和14。培养细胞治疗1毫升试剂盒试剂(表达载体),然后结合氯仿(200μL /毫升溶解产物)2分钟rt,细胞溶解产物离心机在12000 g×15分钟在4°C。异丙醇溶解产物(0.5毫升/毫升)添加到水相,孵化后10分钟rt 12000×g离心10分钟在4°C,上层的丢弃,RNA颗粒用1毫升75%乙醇洗净。随后,RNA颗粒在7500×g离心5分钟在4°C,然后resuspended 30μL超纯蒸馏水和存储在−80°C。RNA含量估计光谱分析用nd - 1000(热科学)分光光度计和A260 / A280和A260 / A230比率计算估计RNA纯度。

2.8。逆转录(RT)

RT是由混合2μg RNA样本,1μL核苷酸(125海里),1μL随机引物(pd (N)₆;从Promega)和超纯蒸馏水10卷μl .样本孵化5分钟在65°C。随后,1μL上标三世(200 U /μL), 1μL核糖核酸酶,2μL 5 x第一链RXN缓冲区,4μL MgCl₂(25毫米),2μL德勤(0.1米,所有从英杰公司)被添加到样本,然后孵化10分钟25°C, 1小时55°C,然后15分钟在70°C。互补脱氧核糖核酸样本存储在−20°C。

2.9。实时聚合酶链反应(qPCR)

实时PCR分析相结合是由2μL样本cDNA(1: 10稀释)2μL正向引物和2μL反向引物(20µ米,GeneWorks), 10μL SYBR绿色我(罗氏),4μL超纯蒸馏水。在这项研究中使用的引物列表如表所示1。PCR反应是由潜伏在95°C 10分钟。其次是45(1)周期为10秒,95°C (62°C) 10秒钟,和(3)为10秒72°C。人类beta-actin用作参考基因在样品没有逆转录酶、cDNA模板作为消极的控制。

2.10。统计分析

统计分析的方法是双向方差分析。显著性水平是设定在和事后测试之间的治疗方法是使用图基进行测试。

3所示。结果

3.1。附着力HCE-T和对待细胞ECM-Coated BMSF电影

如图1(一)、涂料BMSF电影与胶原蛋白,胶原蛋白三世,或胶原IV显著()附着HCE-T细胞的数量增加。增加HCE-T细胞粘附也观察到的反应与vitronectin涂层,纤连蛋白、层粘连蛋白;然而,这些增加显著提高(使用裸蚕丝蛋白)获得的值。

结果使用HCE-T细胞相比,ECM涂层没有显著影响初级及细胞的粘附BMSF电影(图1 (b))。此外,对待细胞表现出倾向于坚持裸蚕丝蛋白远远高于HCE-T细胞。具体来说,坚持裸蚕丝蛋白及细胞的数量大约是六十倍的高于使用HCE-T细胞(数据获得的1(一)和1 (b))。

3.2。形态学和HCE-T和及细胞融合ECM-Coated BMSF电影

HCE-T细胞的形态学ECM-coated BMSF电影1小时后检查和25小时的文化。细胞在大多数电影似乎相对球面;然而,这些胶原蛋白和层粘连蛋白涂层电影通常表现出一个细长的形态与偏心值从0.7到0.75(数字2(一个)和3(一个))。25小时的文化,然而,HCE-T细胞每个涂层BMSF电影展示了一种相对细长的形态与偏心值从0.7到0.75(图3(一个))。

除了对细胞形态的影响,涂层与胶原蛋白增加BMSF HCE-T文化融合(图4(一))。例如,72年年底前人力资源文化时期,HCE-T文化建立在蚕丝蛋白涂有胶原蛋白胶原蛋白III或IV演示了几乎两倍的水平融合表现出的文化建立在裸露的蚕丝蛋白。

在戏剧性的结果使用HCE-T细胞相比,ECM涂料均没有显著的影响及细胞形态和文化融合在任何时候文化时期的人物3 (b)和4 (b))。

3.3。培养基的影响特征及细胞的基因表达

信使RNA转录为p63角蛋白3,角蛋白12被量化实时定量PCR及细胞生长在蚕丝蛋白电影闪中(补充了y - 27632和KGF)或DMEM 0, 7日或14天。研究的结果发表在表2和图5。一致的趋势观察所有捐助者是文化及细胞闪中补充了y - 27632和KGF诱发更大的相对增加,角蛋白的表达3和角蛋白12文化时期比在响应与DMEM文化。例如,14天后,所有对待文化生长在闪中表现出相对的3角蛋白表达增加至少30倍高于供者匹配控制在DMEM培养(图中观察到5(一个))。相似的一般趋势明显的表达角蛋白及细胞培养中12的闪与数据从捐赠者获得匹配的对照组培养在DMEM(图5 (b))。

p63基因表达的证据被发现在所有对待文化,无论捐赠测试,文化时期的长度,或媒体(图使用5 (c))。总体而言,p63基因表达的褶皱变化观察到在应对文化与闪相对较低(< 2倍),而不是明显不同,观察到在DMEM供者匹配的组织培养。没有明显的证据p63和角蛋白基因表达检测单一栽培的3 t3细胞(数据未显示)。

3.4。培养基的影响在特定的蛋白质标记的表达及细胞生长在BMSF电影

及细胞培养BMSF电影的闪或DMEM p63和角蛋白3/12的存在,通过免疫荧光7和14天的增长。如图6,强p63-IR普遍发现在对待文化,不管媒体使用或文化时期的长度。在所有情况下,p63-IR局限于细胞核。在闪还指出,细胞培养在更高的密度和现在一般都小于细胞在DMEM供者匹配的组织培养。7天后文化在闪,细胞质K3/12-IR中检测出一些稀疏分散细胞在对待文化(图7(一))。14天后文化在闪,强烈的细胞质K3/12-IR发现在对待文化从所有捐助者检查(图7 (b))。相比之下,没有证据表明K3/12-IR检测在7天在供者匹配的组织培养在DMEM(图7 (c))。K3/12-IR检测在14天在DMEM培养;然而,这种荧光的范围和强度都低于那些在供者匹配的组织培养在闪(图7 (d))。

所有负面的控件(漏报主要抗体)及文化没能证明任何重要的荧光(图6 (c)和7 (c):插入)。除此之外,没有证据表明反应p63或K3/12观察单一栽培的3 t3细胞(数据未显示)。

4所示。讨论

在之前的调查中,我们已经表明,丝素蛋白分离b .森蚕茧可以被加工成灵活、渗透和透明的角膜上皮细胞支架支持附件,成长,和分化14,15]。在目前的研究中,我们试图优化协议BMSF角膜上皮细胞的扩张在体外通过与ECM蛋白质或涂层的电影包括媒体补充促进角膜分化和可行的祖细胞数量的保留。在第一部分的研究中,结果表明,涂层的蚕丝蛋白电影与ECM蛋白质,特别是胶原蛋白,显著提高家乡的角膜上皮细胞的粘附和生长(HCE-T)。这些发现一般协议与其他工人寻求改善协议来自角膜上皮细胞的扩张。例如,据报道,涂层组织培养塑料与胶原蛋白或纤连蛋白显著增加人类角膜内皮细胞培养的扩张(18,28- - - - - -30.]。同样,胶原蛋白和层粘连蛋白涂层提高角膜上皮细胞吸附和迁移在活的有机体内并促进增加了聚碳酸酯膜的分层在体外(31日,32]。此外,人类角膜上皮细胞表现出明显较高的伤口关闭当培养治疗隐形眼镜涂上vitronectin [33]。基于上面的证据和HCE-T细胞反应的报道在目前的研究中,我们建议涂料BMSF-based与ECM支架蛋白可能会增加潜在的生物材料,促进上皮细胞粘附和增长。

虽然发现角膜上皮细胞中被永久地传颂演示增加附着力和增长ECM-coated蚕丝蛋白支架很有意思,从科学的角度来看,这个数据对临床应用的潜在价值是有限的。特别是,动物性蛋白质ECM的使用在创建组织结构修复或重建眼表可能有问题,因为它引入了潜在的风险,拒绝或疾病传播。我们还演示了在当前的研究中有重大差异的反应和初级角膜细胞ECM-coated电影中被永久地传颂。HCE-T细胞系选择在当前研究的开始作为一个方便的和健壮的模型系统调查选项为改进协议在BMSF-based角膜细胞培养支架的扩张。这个细胞株经常被用作模型系统,其他工人获得洞察角膜上皮细胞生长和功能。特别是HCE-T细胞系已被提升为一种使用活的动物研究角膜屏障功能(34- - - - - -36]。然而,HCE-T细胞有显著改变基因组资料主要角膜细胞和时,必须仔细考虑这一事实得出结论通过使用任何数据(37]。在最近的研究中,HCE-T细胞的反应与ECM蛋白质涂层蚕丝蛋白电影所观察到的明显不同的使用主要及细胞。具体来说,虽然HCE-T细胞增加细胞附着和生长在应对涂料BMSF ECM蛋白质,没有这样的好处是实现主对待文化的细胞。此外,初级及细胞表现出更大的能力坚持裸蚕丝蛋白电影比HCE-T细胞,实现更高水平的融合的文化。基于这些数据,我们建议HCE-T细胞系将只有有限的价值进一步尝试优化BMSF-based支架及细胞的扩张。

第二本研究的结果是,替代传统的角化细胞增长的媒体(DMEM)中补充了y - 27632和KGF(闪)促进角膜上皮细胞分化的显著增加。这个结果是一致的数据获得的其他工人已经表明,中等和y - 27632和/或补充KGF改善上皮细胞生长和分化在活的有机体内和在体外(38]。例如,包含y - 27632培养基在初选的长期增殖能力显著增加各种各样的解剖位置的角化细胞(39]。补充培养基的y - 27632还促进分离及细胞的粘附明显增加了保护这些细胞活性氧的压力(40]。有强有力的证据表明KGF也是一个有效的诱导物的上皮细胞分裂和分化,包括那些在角膜上皮细胞和异色边缘。例如,增强了角膜上皮愈合伤口的局部应用KGF [38,41]虽然KGF表达受体,FGF2bR显著调节刮后的小鼠角膜上皮损伤(42]。当前研究的结果表明,使用y - 27632和/或KGF也有利于我们试图促进角膜分化在对待文化建立在BMSF-based支架。

重要的是要强调,在这项研究中,增加与角膜分化相关的基因的表达是实现没有任何明显减少干细胞标记物的表达,p63。这个结果非常重要,因为任何的长期可持续性角膜上皮结构需要保留一个可行的缘的祖人口。总的来说,目前的调查结果相比,与其他工人试图优化协议过程中维持一个祖人口及文化。例如,它已被证明,KGF分泌缘的,可见在活的有机体内促进缘的上皮细胞生长和分化43]。此外,KGF在缘的上皮细胞的作用似乎是由涉及的表达途径p63 [44]。证据也已提出,KGF-supplemented媒体促进羊膜上缘的上皮外植体文化的产物(AM)的表达水平明显高于p63比暴露于HGF补充媒体(44]。它也表明,对待文化包含细胞表现出祖标记可以维持几个月的闪补充了KGF和y - 27632 (23]。基于这些数据,我们建议进行进一步的研究来确定是否增加y - 27632和KGF培养基有助于促进祖种群的长期生存能力及细胞培养建立在BMSF-based支架。

5。结论

基于我们的研究结果,我们建议(1)BMSF支架的能力来支持附件或增长的一些细胞类型(例如,HCE-T)可能提高了涂层与ECM蛋白质;然而,这一战略为主要的文化提供了没有明显的好处及细胞;我们还表明,(2)使用闪中补充了KGF和y - 27632在我们的文化体系促进增加角膜分化没有任何明显减少祖标记的表达,p63。这一发现可能对未来的临床研究设计优化方案的生成及构造BMSF-based支架用于眼部表面重建。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。