文摘

移植间充质干细胞(msc)的严重程度降低硫酸葡聚糖钠- (DSS)诱导结肠炎。msc能分泌Galectin-3 (Gal-3),蛋白质会影响扩散,粘附和免疫细胞的迁移。我们调查是否Gal-3新形成的抑制剂(Davanat)将影响生产的Gal-3减弱DSS-induced结肠炎msc和增强他们的潜力。药物抑制Gal-3 msc增强他们的能力促进腹膜巨噬细胞激活的替代办法在体外和在活的有机体内。注入msc培养的Davanat DSS-treated动物的血清il - 10的浓度增加,显著提高或者激活和生产巨噬细胞il - 10的冒号DSS-treated老鼠。药物抑制Gal-3 msc显著变弱的浓度Gal-3 DSS-treated动物血清,表明msc生产Gal-3这种疾病。总之,我们的研究结果表明,Davanat可以用于改善MSC-mediated极化对免疫抑制M2巨噬细胞的表型。

1。介绍

溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的两种主要形式是炎症性肠病(IBD)和特点是异常细胞流入肠道组织和大规模释放促炎介质(1]。最常见的一种是IBD-related动物模型右旋糖酐硫酸钠- (DSS-)诱导结肠炎,最初报道Okayasu et al。2]。DSS-induced结肠炎的临床特征类似于人类结肠炎和包括减肥、便溏、腹泻、神秘和直肠出血。DSS对上皮细胞有毒性作用,导致肠道细菌的侵入牙龈组织。树突状细胞(dc)和巨噬细胞捕获细菌通过DSS-injured结肠上皮细胞,并通过激活toll样受体(通常),释放促炎细胞因子(TNF -α,il - 12)和趋化因子巨噬细胞炎性蛋白- 1 (MIP)α,单核细胞趋化蛋白- 1 (MCP),和keratinocyte-derived趋化因子(处于受控/ KC), CCL11)诱导结肠炎症细胞的迁移(3,4]。

间充质干细胞(msc)是成年人,多功能细胞,可以发现在几乎所有产后组织(5,6]。msc可以改变免疫应答和调节扩散,激活,和效应T淋巴细胞的功能,专业的抗原呈递细胞(DCs、巨噬细胞、B淋巴细胞),和NK细胞,通过细胞间接触或通过可溶性因子的生产7]。由于他们的免疫调节特性,兴趣主要集中在MSC-based治疗炎症性疾病,包括炎症性肠病(8- - - - - -10]。

最近,移植msc被发现减少的严重程度DSS-induced结肠炎(11- - - - - -14]。刘等人。15]发现,msc显著缓解DSS-induced结肠炎、TGF -的主要来源β1是巨噬细胞,它们被msc。巨噬细胞的特定消融完全废除msc的抗炎作用15]。

Sioud et al。16)表明,msc能够分泌Galectin-3 (Gal-3),蛋白质会影响扩散,粘附和免疫细胞的迁移。因为Gal-3广泛表达于免疫细胞(中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,肥大细胞,DCs,单核细胞、巨噬细胞,以及NK细胞)(17),参与DSS-induced结肠炎的发病机制,我们研究了Gal-3由msc的角色在这个实验模型。

2。材料和方法

2.1。细胞

小鼠骨髓msc隔绝C57BL / 6小鼠从Gibco购买(目录S10502-01数量)。细胞培养杜尔贝科鹰介质的修改heat-inactivated (DMEM)含10%胎牛血清的边后卫,100国际单位/毫升青霉素G和100μg / mL链霉素(Sigma-Aldrich化工、德国慕尼黑),37°C的5%的股份有限公司2孵化器。msc在通道6在这些实验使用。

2.2。动物

我们使用6-8-week-old雄性野生型(WT)对DSS诱导C57BL / 6小鼠结肠炎。男,6-8-week-old, Gal-3−−/C57BL / 6小鼠(由丹尼尔·许博士,加州大学萨克拉门托,CA)被用于coculture实验。鼠标Gal-3基因的靶向破坏了C57BL / 6小鼠胚胎干细胞和纯合子扰乱基因得到[18]。老鼠在动物饲养设施维护医学科学教师,塞尔维亚Kragujevac大学。所有实验动物收到人类保健和批准,按照指南进行动物伦理委员会的医学科学教师,塞尔维亚Kragujevac大学。老鼠被安置在一个温控环境12小时的光暗周期和标准实验室管理食物和水随意。

2.3。实验设计

实验动物分为4组:(1)野生型(WT);(2)WT + DSS(硫酸葡聚糖钠);(3)WT + DSS + msc(间充质干细胞);和(4)WT + DSS + msc + Davanat (Gal-3抑制剂)。每组有10的动物。完成这项研究,80吨级和10 Gal-3−−/C57BL / 6动物使用。

2.4。诱导的急性结肠炎

结肠炎是诱导C57BL / 6 w / v 3% DSS(分子量40 kDa;TdB咨询,乌普萨拉,瑞典)溶解在饮用水随意(天1 - 7)如前所述2]。控制老鼠DSS-free水。

2.5。msc管理

0天,12 h DSS政府后,小鼠腹腔注射与0.5×10 (ip)6msc在200毫升PBS稀释或车辆控制(PBS) [19]。

2.6。药物抑制Gal-3 msc

为了抑制生产Gal-3 msc、msc治疗与Gal-3抑制剂(Davanat 15μg / mL,请提供Klyosov教授和教授Traber Galectin疗法Inc .,牛顿,MA)和msc + Davanat管理0天(DSS)的第一天,腹腔内,根据以前公布的协议(20.]。

2.7。结肠炎的严重程度的评估

疾病活动指数(戴)被用来评估结肠炎的临床症状(表1)。每天体重测量,与体重测量0天(DSS)的第一天。获得的结果为±%体重损失。分析粪便一致性和Hemoccult(贝克曼库尔特)粪便隐血试验进行每日(21]。

表1
评分标准炎症性肠病的疾病活动指数(DAI) 。
2.8。组织学

组织学分析,冒号从安乐死老鼠,冲洗和磷酸缓冲溶液(PBS)和纵向前滚切成“瑞士卷,“如前所述22]。Swiss-rolled冒号在福尔马林固定和嵌入式石蜡和5μm部分被苏木精和伊红染色())和检查蒙蔽组织病理学家。部分分析了隐窝的损伤上皮包括损伤粘膜下水肿、出血,以及免疫细胞的渗透。每个鼠标的组织学得分的总和计算“渗透”和“上皮损伤”部分的得分,如前所述(表2)[23]。

表2
组织学评分 。
2.9。血清中细胞因子的测量

我们使用了商业ELISA集(研发系统、明尼阿波利斯、MN)来衡量选择细胞因子的浓度(Gal-3, TNF -α,il - 1β、il - 10和TGF -β)根据制造商的指示24]。简单地说,血液样本收集从腹主动脉在安乐死的过程。血清是由离心分离和储存在−80°C。Gal-3,肿瘤坏死因子-α,il - 1β、il - 10和TGF -β血清水平以酶联免疫吸附试验(ELISA)。

2.10。隔离的免疫细胞固有层和流式细胞术分析

隔离的免疫细胞固有层如前所述(进行25]。简而言之,每个冒号解剖远离盲肠。冒号是切成3厘米长的段,然后减少纵向,结肠组织的皮瓣,3×3厘米。皮瓣是放置在一个50毫升锥形管和清洗3 - 5次,30毫升寒冷的哈佛商学院,钙和magnesium-free。卸载后上层清液,部分被孵化20毫升哈佛商学院/ EDTA为30分钟37°C水浴。每个管经常动摇了孵化期间,确保从粘膜上皮细胞被破坏。是沉积物和上层的套利交易。其余EDTA清洗与哈佛商学院40毫升、钙和magnesium-free。结肠组织的碎片被放置在一个10厘米培养皿,切成小块用刀片或手术刀。块是送气音的吸管,转移到一个新的50毫升锥形管,和满20毫升与10%胎牛血清的DMEM补充的边后卫。 Then, 1 mL of 4000 Mandl units (3 × 106温斯迟单位)/毫升胶原酶D和200年μL(1毫克/毫升DNase被添加到管和孵化1 h 37°C水浴。上层清液过滤100μm细胞尼龙滤网清洁50毫升锥形管。寒冷的哈佛商学院,钙,magnesium-free加入50毫升。细胞颗粒状,使离心10分钟450×g,在4°C。颗粒被破坏,细胞在50毫升resuspended哈佛商学院,钙和magnesium-free,透过40μm细胞尼龙滤网清洁50毫升锥形管。再次细胞颗粒状,使离心10分钟450×g, 4°C。颗粒被破坏,细胞resuspended Percoll 20毫升的30%。然后,细胞悬液小心地分层超过25毫升的70% Percoll 50毫升锥形管和离心20分钟1100×g,室温下,尽可能加速率低和刹车了。阻止了细胞聚集增加1毫米EDTA溶液。Percoll层上皮细胞浮动在30%,30%和70%之间的免疫细胞被发现层。碎片和死细胞颗粒状底部的锥形管。

流式细胞术是通过使用1×10例行程序6每个样本的细胞和孵化了antimouse F4/80, antimouse CD206, antimouse FcεRI、antimouse CD117 antimouse CD11c, antimouse CD11b, antimouse CD80、antimouse NK1.1, antimouse CD3共轭和异硫氰酸荧光素(FITC;BD生物科学,富兰克林湖,新泽西州),藻红蛋白(PE;BD生物科学),peridinin叶绿素蛋白质(PerCP;BD生物科学),或者allophycocyanin (APC;BD生物科学)。细胞内染色,细胞以前刺激十四烷酸与佛波醇酯(PMA)和ionomycin 4 h在37°C。细胞外染色后,细胞被固定,permeabilized,彩色TNF -α、il - 10、il - 12、il - 1β利用共轭antimouse抗体。流仪分析了BD生物科学FACSCalibur和使用流动分析软件分析程序。

2.11。隔离和在体外Coculture的腹膜巨噬细胞

从腹腔巨噬细胞的治疗,健康的Gal-3−−/老鼠。老鼠注射5毫升的PBS ip,摇晃后,腹腔灌洗。从小鼠的腹腔巨噬细胞收集在无菌条件下和完整的DMEM培养补充10%的边后卫在37°C公司5%2孵化器。孤立的巨噬细胞被镀的密度106细胞/和cocultured msc和msc + Davanat细胞24小时(26]。il - 10的水平和TGF -β测定细胞培养上清液的ELISA集,根据制造商的建议。巨噬细胞表型是由流式细胞术,如上所述。

2.12。统计数据

数据表示为每组的均值±SEM。我们测试正常使用Shapiro-Wilk莱文的方差的同质性测试和使用的测试。一个配对样本 以及被用来比较两个匹配组。独立样本学生的 以及与高斯分布否则用来比较两组。确切概率法被用来评估生存组之间的差异。使用SPSS 19.0统计分析为Windows软件(SPSS, Inc .,芝加哥,IL)。所有报告 价值观是双向的, 被认为是统计学意义和高度显著不同的什么时候 。

3所示。结果

3.1。药物抑制Gal-3 msc显著变弱的浓度Gal-3 DSS-Treated小鼠的血清

的浓度Gal-3 DSS-treated小鼠的血清收到msc与药物抑制这种分子在msc。因为它是图所示1(一)在msc明显变弱,药物抑制Gal-3 DSS-treated动物的血清中的Gal-3浓度,表明msc生产Gal-3这种疾病( ;学生的t -测试)。

(一)
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(b)
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(d)
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(e)
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图1
msc减弱DSS-induced结肠炎。水有3% DSS给老鼠为7天;普通饮用水是美联储控制老鼠。的浓度Gal-3 msc的血清组(a)。小鼠结肠炎(b)的存活率。疾病活动指数(DAI)得分在第七天使用以下参数:减肥,粪便一致性、DSS治疗后,直肠出血(c)。整个结肠长度测量(d)。组织学检查进行苏木精和伊红染色(e)。他走时染色代表结肠组织的图像显示在同一放大(100 x) (e)。数据表现为±SEM手段; 每个实验小鼠组。 , 。

抑制Gal-3 msc不改变他们的潜力,防止DSS-induced结肠炎的发展,根据存活率(图1 (b))( ;确切概率法),临床参数(图1 (c)(图),结肠长度1 (d))( ;学生的t以及)。所有DSS-treated WT发达与相似的临床症状:严重的结肠炎小鼠腹泻,直肠出血,体重减轻。血液的存在在粪便检测后一到两天DSS的开始治疗,而总出血和腹泻最初观察到第四天。显著的体重损失(> 5%)后成为著名的四天的DSS治疗。DSS-only-treated动物相比,DSS-treated老鼠收到msc + Davanat或msc没有出现腹泻、直肠出血,体重和重大损失到实验的最后。这些观察结果也证实了组织学分析(图1 (e))( ;学生的t以及)。DSS-treated组明显表现出严重的粘膜炎症细胞浸润和破坏地下室建筑(上皮杯状细胞的溃疡和损失),而DSS-induced病变预防msc + Davanat -和MSCs-only-treated动物(图1 (e)、较低的面板)。

3.2。药物抑制Gal-3在msc的血清il - 10浓度的增加导致DSS-Treated动物

在努力调查的影响Gal-3 msc在DSS-induced结肠炎免疫调节特性,分析血清中细胞因子的浓度。有明显的低水平的炎症TNF -α和il - 1β和抗炎il - 10的水平明显高于TGF -βDSS-treated小鼠的血清获得msc + Davanat或msc DSS-only-treated相比只有当动物(图2)( ;学生的t -测试)。重要的是,il - 10的浓度明显高于(图2 (c))( ;学生的t -测试)在msc + Davanat-treated小鼠血清浓度相比,细胞因子与DSS-induced MSCs-only-treated小鼠结肠炎。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图2
药物抑制Gal-3在msc的血清il - 10浓度的增加导致DSS-treated动物。血清中促炎细胞因子水平显示:(a) TNF -α和(b) il - 1β。血清抗炎细胞因子的水平显示:(c) il - 10和(d) TGF -β。值意味着±SEM ( 每组)。 , 。
3.3。药物抑制Gal-3在msc结果显著增强或者激活和生产巨噬细胞il - 10的冒号DSS-Treated老鼠

注入msc导致F4/80 +巨噬细胞数量显著降低,Fcε国际扶轮+ CD117 +肥大细胞,炎症CD11c + CD11b + DCs,和CD3 + NK1.1 +冒号的NKT细胞DSS-treated老鼠(图3)。在所有这些细胞,药物抑制Gal-3在msc只影响巨噬细胞的表型和细胞因子生产(数字3 (b)和3 (c)在冒号DSS-treated动物。虽然没有任何区别il - 12、il - 1的百分比β生产F4/80 +结肠巨噬细胞(数字3 (d)和3 (e)msc和msc + Davanat团体之间),药物抑制Gal-3在msc结果显著增强或者激活和生产巨噬细胞il - 10的冒号DSS-treated老鼠。F4/80 + CD206 +的百分比或者激活巨噬细胞以及巨噬细胞产生il - 10在老鼠收到msc的风险高的生产Gal-3抑制(数字3 (b)和3 (c))( ;学生的t -与其他实验小组测试)相比。

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图3
药物抑制Gal-3 msc青睐替代激活的巨噬细胞在结肠组织DSS-treated老鼠。F4/80 +在结肠癌组织中巨噬细胞的百分比(a)。显著降低百分比F4/80 + CD206 +和F4/80 + il - 10 + MSCs-treated小鼠巨噬细胞(白色的酒吧),相比msc + Davanat-treated老鼠(黑条),7天后DSS治疗(b和c), il - 12和il - 1的比例β第F4/80 +巨噬细胞(d和e)。炎症树突细胞的百分比(f)和Fcε国际扶轮+ CD117 +肥大细胞(g)以及CD3 + NK1.1 + NKT细胞(h)所示。值意味着±SEM ( 每组)。 , 。
3.4。药物抑制Gal-3 msc增强他们的能力促进腹膜巨噬细胞激活的替代办法

为了阐明Gal-3的角色由msc对替代激活巨噬细胞,Gal-3−−/巨噬细胞与msc cocultured或msc + Davanat细胞。药物抑制Gal-3 msc增强他们的能力促进腹膜巨噬细胞激活的替代办法。有更高比例的F4/80 + CD206 +或者激活的巨噬细胞与msc +腹膜巨噬细胞cocultured人口Davanat细胞(图4(一))( ;学生的t -测试),而没有显著差异的百分比炎症F4/80 + CD11b +巨噬细胞实验群体之间(图4(a))。符合这些发现,显著提高巨噬细胞的上清液中il - 10水平与msc cocultured + Davanat细胞(图4(b)) ( ;学生的t以及)。



图4
药物抑制Gal-3 msc增强他们的能力促进腹膜巨噬细胞激活的替代办法。的显著增加百分比F4/80 + CD206 +巨噬细胞在msc + Davanat-treated Gal-3−−/巨噬细胞(黑条),相比只有MSCs-treated Gal-3−−/巨噬细胞(白色酒吧)(a)。F4/80 + CD11b +巨噬细胞的百分比(a)所示。代表流式细胞术点图所示。il - 10的水平和TGF -β在上层清液(b),值的意思是±SEM ( 每组)。 , 。

4所示。讨论

msc的免疫调节活动提供了一个新策略的设计协议旨在抑制病理性免疫反应治疗IBD的发展负责。在这种情况下,它已经表明,msc可以发挥他们的抑制作用不仅在细胞的适应性免疫反应,但同样在先天免疫细胞,包括直流、NK细胞和巨噬细胞7]。

巨噬细胞已被确认为最重要的一个细胞诱导的急性结肠炎和DSS-induced结肠炎(27,28]。DSS的巨噬细胞激活Nlrp3 inflammasome导致增加炎症细胞因子il - 1的生产β和地震。此外,一氧化氮(NO)和诱导一氧化氮合酶的表达(间接宾语)巨噬细胞恶化DSS-induced结肠炎(29日]。

最近,刘和同事表明,msc移植可能招募巨噬细胞产生抗炎细胞因子,它减弱结肠炎(15]。符合这些发现,我们发现msc显著改善临床和组织病理学DSS-induced结肠炎(图的严重性1)与血清il - 10水平增加(图2)和增加的百分比F4/80 + CD206 +或者激活巨噬细胞在冒号(图3)。

数量有限的研究已经进行骨髓间充质教育调查潜在的巨噬细胞适应抗炎/ immune-suppressive表现型:表达高水平的CD206(或者激活巨噬细胞的标志)和抗炎细胞因子il - 10的增加产量。金姆和Hematti [30.)第一次报告,人类骨骨髓来源MSC可以促进或者激活巨噬细胞的生成。

在另一项研究中,卡特勒和同事表明单核细胞从外周血分离显示CD206表达的增加,低水平的表面HLA-DR,和减少刺激alloreactive t细胞反应的能力,与脐cord-derived MSC coculturing后(31日]。Zhang et al。32)表明,人类gingiva-derived msc可以诱导M2巨噬细胞的极化在体外并证实了这一现象在活的有机体内。他们报告说,不断注入人类gingiva-derived msc可以回家与主机伤口在靠近巨噬细胞,促进他们对M2极化表型(32]。

有关机制M2 msc施加于巨噬细胞极化效应,一个至关重要的角色,不同的可溶性因子已被证明。通过使用特定的中和抗体,张先生和他的同事们(32]显示il - 6和granulocyte-macrophage-CSF虽然卡特勒et al。31日]报道的重要性PGE2 M2表型的诱导MSC。

在这里,我们表明,Davanat-mediated药物抑制Gal-3在msc导致增强F4/80 + CD206 +或者激活和il - 10在结肠DSS-treated动物生产巨噬细胞(图3)和血清il - 10水平增加(图2)表明Gal-3由msc的重要性,对巨噬细胞极化对M2表型。此外,我们表明,药物抑制Gal-3 msc msc增强能力促进M2巨噬细胞的极化和il - 10生产在体外(图4)。

众所周知,在巨噬细胞极化Gal-3扮演重要的角色和功能(33- - - - - -36]。在1型糖尿病动物模型,巨噬细胞Gal-3缺陷小鼠产生更少的tnf和一氧化氮(NO)和更有效的在细胞内和细胞外的杀戮与WT老鼠(37]。利用动物模型免疫介导的急性肝炎(36),我们表明,基因缺失和TD139-induced药物抑制Gal-3数量的增加导致IL-10-producing或者激活,M2-polarized巨噬细胞在肝脏。

Traber和同事证明Davanat显著降低表达Gal-3在门户和隔巨噬细胞产生的减毒纤维化thioacetamide-induced肝脏疾病(38]。同时,药理抑制剂Gal-3设法改善肝细胞损伤,炎症和纤维化小鼠模型的非酒精性脂肪肝病(39),这些影响与减少Gal-3表情肝巨噬细胞。

5。结论

总之,Davanat-induced Gal-3抑制不显著影响骨髓间充质减弱结肠炎的潜力但设法提高生产抗炎细胞因子il - 10在结肠的巨噬细胞,促进他们对免疫抑制偏振M2表型。我们的发现表明Gal-3目标药物可用于改善MSCs-mediated抑制巨噬细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢慷慨的阿纳托尔a Klyosov教授和教授Peter g . Traber Galectin疗法Inc .,牛顿,马人提供Galectin-3抑制剂(Davanat),用于这项研究。本研究支持塞尔维亚科技部(项目号。ON175069和ON175103)和Macroproject医学科学学院的01/14,Kragujevac大学。