文摘

人类amniotic-fluid-derived间充质干细胞(AF-MSCs)有趣的multilineage分化潜力和广泛的治疗应用程序由于缓解文化扩张。然而,msc接受复制衰老。到目前为止,构成胎儿疾病和细胞衰老的分子机制仍知之甚少。在这里,我们分析了senescence-associated形态学、分子和表观遗传特征在传播的msc源自AF的正常和fetus-affected怀孕。AF-MSCs文化两种细胞来源显示非常相似的形态和表达特定的细胞表面(CD44, CD90、CD105)和具备干细胞(Oct4、Nanog Sox2,和Rex1)标记,但个别间变化扩散能力和时间到达衰老。在段落4和8,衰老文化表现出典型的形态学特征,senescence-associatedβ牛乳糖活动水平的提高p16, mir - 17和miR-21水平下降但显示微分p21的表达,p53, ATM依赖性细胞衰老的开始。这些差异与变化的染色质修饰符(DNMT1和HDAC1)和polycomb组蛋白(EZH2, SUZ12 BMI1)并联与压抑的组蛋白的表达变化标志(H3K9me3和H3K27me3)和具备干细胞标记(Oct4、Nanog Sox2,和Rex1)。因此表观遗传因素是重要的对于AF-MSCs衰老过程,可能与个性有关捐赠或胎儿恶性状态。

1。介绍

人类羊水(AF)包含多个细胞类型,包括大约1%的细胞和间充质干细胞特征(1]。这些amniotic-fluid-derived干细胞(AF-MSCs)可以获得少量的房颤的怀孕中期妊娠通过羊膜穿刺术用于产前诊断程序来确定胎儿状况和遗传疾病(2,3]。房颤具有许多优点,如安全、简单的抽样,孕产妇和儿童创伤小,没有道德限制。迄今为止,房颤的被认为是一个有吸引力的来源msc在再生医学,因为他们拥有巨大的潜力应用广泛的自我更新,multilineage分化能力(4- - - - - -6)、低或微不足道的免疫原性,不能形成肿瘤植入后(7,8]。然而,扩展通过顺序使干细胞培养在体外可能导致复制衰老状态。有人建议,人类msc来自不同来源变得衰老的形态变化,减毒的比表面标记物的表达,减少增殖和分化潜能,端粒长度缩短,和全球基因表达改变,DNA甲基化模式和microrna的概要文件(9- - - - - -11]。很明显,细胞衰老是一个复杂的过程和分子事件与AF-MSCs有关在体外扩张是迄今为止未知的。

主要体细胞可以复制文化大约50累积人口倍增,之后的文化停止分裂。这种现象称为海弗利克极限,被称为复制衰老(12]。msc的使用寿命有限在体外任何正常的体细胞,也受到海弗利克极限。建议复制衰老msc是一个持续的过程从第一段(11),导致严重影响增生性和单独使用潜力(11,13)和相关的形态学和分子特征。扩散逮捕在10 - 20通道在衰老msc进行形态观察和表型的改变11,14,15)与全球基因表达模式的改变在不同段落的差别和重要对这些基因参与细胞周期、DNA复制和DNA修复通道(年末11]。通过使用凝胶蛋白质组学方法(16),监护人的观察各种波动,信号,抗氧化剂,蛋白酶体,细胞骨架,房颤和结缔组织蛋白在人类干细胞线CD117/2文化沿着通道5 - 7和25。二维凝胶electrophoresis-based定量蛋白质组学在章节3 - 7演示了骨髓msc文化也是有差异的蛋白质表达谱与细胞骨架重塑和/或组织的损伤和修复受损的蛋白质(17]。也有证据表明,衰老涉及DNA损伤,氧化应激,降低multilineage分化潜力,和端粒酶活性15,18,19]。

有几个生物标志物定量评估细胞衰老,包括senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β加)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,p16INK4A分子、p21WAF1逮捕参与控制的增长由两个主要的肿瘤抑制通路,p16INK4A分子/复审委员会和p53 / p21WAF1 [20.,21]。的潜在标记干细胞的衰老状态可以减少的多能性转录因子的表达,如Nanog和Oct4 [22,23]。

复制衰老似乎epigenetically控制(24]。最近的研究表明,senescence-associated DNA甲基化变化与压抑的组蛋白标记和与目标相关联的组蛋白甲基转移酶EZH2,组件polycomb复杂PRC2 [25- - - - - -27]。然而,表观遗传调控机制形态和表型的变化在msc文化扩张仍不清楚。

众所周知,存在不同的msc的增殖能力文化孤立的从不同的捐赠者11,13),经历衰老和相当大的属性更改。为了进一步探索观察对增长的缺点,本研究旨在研究捐赠者个性和胎儿畸形可能影响amniotic-fluid-derived msc在文化扩张状态。这里我们提供的证据表明,msc文化房颤的正常妊娠和胎儿异常表现出多样性的扩散和衰老。我们描述senescence-associated分子和表观遗传变化在msc培养与msc特征的程度有关。

2。材料和方法

2.1。Amniotic-Fluid-Derived msc隔离、文化和扩张

房颤样本(5毫升)通过活检(羊膜穿刺术)mid-second-trimester晚期妊娠(24周)或(28-34周)孕妇产前诊断,并没有发现异常基因分析使用的生物医学研究伦理委员会批准的协议维尔纽斯地区,数量158200-123-428-122。样本保持在室温下放置4小时前羊膜细胞隔离使用两级协议(23]。样品在1800转离心20分钟,上层清液被免职,细胞颗粒在DMEM培养基清洗一次(Sigma-Aldrich有限公司)没有血清去除血液和细胞碎片。离心后,细胞颗粒在5毫升的生长培养基(AmnioMAX resuspended™与AmnioMAX c100基础培养基™c100补充(Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国)),含100 U / mL青霉素,和100年μg / mL链霉素(美国纽约Gibco,大岛)和镀25厘米2瑞士培养瓶(TPP)。Amniocytes培养10 - 15天在37°C公司5%2当第一个殖民地出现(第一阶段)。培养的MSC(第二阶段),nonadhering AF细胞收集的主要文化和进一步扩大新的25厘米2培养瓶在37°C公司5%2。电池的外观殖民地后,成长中每3天了。当细胞达到融合为80%,接种到更高的段落是由用0.05%胰蛋白酶化trypsin-EDTA (Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国)为3分钟。纤维母细胞形态均匀的人口获得了经过两轮的亚文化。相差显微镜观察细胞形态(Nicon Eclipse TS100)。细胞人口翻番水平提出的平均值计算如下:细胞培养时间(天)/数量的段落。

2.2。流式细胞术分析

的表型鉴定AF-MSCs从段落4 - 5,离心收集的细胞在1200 rpm 6分钟,洗一次磷酸缓冲盐(PBS)与0.2%胎牛血清(FCS),并再次离心。总共5×105细胞被resuspended 50μL PBS的1% BSA和孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠标反抗体CD44表达载体,CD34 (Miltenyi生物技术),CD90(分子探针,生活技术),或藻红蛋白——(PE)标记CD105表达载体和适当的同形像控制鼠标IgG2A-FITC (Miltenyi生物技术)或IgG1-PE(分子探针,生活技术)。样本在4°C在黑暗中孵化了30分钟,最后分析微孔番石榴®easyCyte 8 ht流式细胞分析仪使用InCyte 2.2.2软件。为每个样本收集一万个事件。

2.3。Senescence-Associatedβ牛乳糖化验

细胞衰老是评估使用β牛乳糖染色工具包(细胞信号)根据制造商的指示。细胞被播种在48-well盘子和培养48小时。与PBS洗涤后,细胞被固定为4%甲醛在PBS 15分钟和染色β牛乳糖活动使用染色解决方案在一夜之间在37°C在恒温器有限公司2。染色细胞在相差显微镜下观察(Nicon Eclipse TS100)和数据被表示为的百分比β牛乳糖阳性细胞。

2.4。RNA隔离和RT-qPCR

msc AF样品正常妊娠和胎儿畸形是培养为3 - 8通道和分析干细胞特定的标记。总RNA提取试剂盒(美国应用生物系统公司),推荐的制造商,然后reverse-transcribed cDNA使用最大值合成第一链cDNA工具包(热科学)。qPCR执行与Maxima®SYBR绿色qPCR大师混合(热科学)6000年Rotor-Gene系统(Corbett生命科学)。的信使rna是GAPDH规范化。相对基因表达是由一个比较阈值计算周期δCt方法。使用学生的统计分析 以及。

转发(F)和反向(R)引物(5′3′)用于RT-qPCR如下:OCT4: F: CGAGAAGGATGTGGTCCGAG;接待员:CAGAGGAAAGGACACTGGTCNanog: F: AGATGCCTCACACGGAGACT;接待员:GTTTGCCTTTGGGACTGGTGSox2: F: TGGACAGTTACGCGCACAT;接待员:CGAGTAGGACATGCTGTAGGTRex1: F: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT;接待员:ACCCCTTATGACGCATTCTATGTp16: F: GCTGCCCAACGCACCGAATA;接待员:ACCACCAGCGTGTCCAGGAAp21: F: GGCAGACCAGCATGACAGATT;接待员:GCGGATTAGGGCTTCCTCTp53: F: TAACAGTTCCTGCATGGGCGGC;接待员:AGGACAGGCACAAACACGCACC自动取款机:F: CTCTGAGTGGCAGCTGGAAGA;接待员:TTTAGGCTGGGATTGTTCGCTGAPDH: F: TCCATGACAACTTTGGTATCG;接待员:TGTAGCCAAATTCGTTGTCA

的信使rna是GAPDH规范化。标准化和褶皱的变化计算使用比较阈值δCt方法循环。学生的 测试是用于统计分析。所有的值表示为平均数±标准差。 值≤0.05被认为是显著的。

2.5。MicroRNA的表达

目标MicroRNA的表达在AF-MSC样本被RT-qPCR评估分析使用probe-based TaqMan MicroRNA化验。反转录进行使用TaqMan微rna逆转录工具包(美国应用生物系统公司);放大了使用TaqMan普遍PCR反应混合液(美国应用生物系统公司)根据制造商的建议。反应是在Finnzymes Thermocycler程序如下:16°C为30分钟,30分钟42°C, 85°C的5分钟。每个反应的产品cDNA用作qPCR模板。RT-qPCR进行Rotor-Gene 6000系统(Corbett生命科学)。在95°C的反应进行了10分钟,其次是40 95°C的周期为60年代15秒和60°C。RNU 48基因作为参考规范化所有实验数据。所有的反应都是一式三份。阈值周期(Ct)确定使用默认阈值设置,和相对量化的microrna的计算 方法。学生的 以及用于统计分析。所有的值表示为平均数±标准差。 值≤0.05被认为是重要的。

2.6。制备蛋白质和蛋白免疫印迹

AF-MSCs(约5×105)是由离心收获(500×g, 6分钟)与0.05% trypsin-EDTA胰蛋白酶化后,在冰冷的PBS洗两次,10卷resuspended溶解溶液(62.5毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8,100毫米德勤和2% SDS、10%甘油)。Benzonase(纯级,默克公司)添加到给最后一个2.5单位/毫升的浓度。细胞溶解产物通过针由同质化Nr 21冰然后离心机在20000 g×10分钟,4°C。上层清液是立即进行电泳或冻结在−76°C。蛋白质浓度测定使用商业RCDC化验(生物Rad)。溶菌产物被分离在7 - 15%聚丙烯酰胺梯度sds - page凝胶,然后转移到PVDF膜。过滤器是孵化与主抗体根据制造商的建议,然后与辣根peroxidase-conjugated (HPR)二级抗体(Dako Cytomation,斯特鲁普)在室温下1 h。乐队是使用增强化学发光检测(Amersham法玛西亚)根据制造商的指示。西方墨点法,以下使用抗体:DNMT1 EZH2来自细胞信号;H3K9me3来自北部; H3K27me3 and BMI1 were from Millipore; ATM, ATM (phospho S1981), and GAPDH were from Abcam; goat anti-rabbit or rabbit anti-goat HPR (horseradish peroxidase) linked secondary antibodies were from Dako Cytomation A/S.

3所示。结果

3.1。描述房颤的msc文化在使正常和Fetus-Affected怀孕

msc是独立与房颤的健康(N)捐助者(D1)和胎儿异常(P),如D2,胎儿中枢神经系统病理和大脑心室扩张;D3、循环障碍,增加了心;D4,称21三体综合症(唐氏综合征)。使用AmnioMAX msc是培养连续3 - 9通道™c100完全培养基。在每个通道,msc在80 - 90%融合山肩。在早期的段落(p3-4)、细胞培养AF来源形成和保持均匀的典型细长mesenchymal-type和纺锤状形态(图1(一))。msc的增殖达到最大的通道3(图1 (b))。章节5 - 6后,有一个效率的下降增殖细胞群。时间达到衰老之间的不同的文化。如图1 (b)一些捐助者样本,包括正常和房颤fetus-pathological妊娠(D1, D2),停止扩散(p5-6)早些时候,而其他人,慢扩散文化fetus-pathological妊娠(D3、D4),花了长时间达到衰老(p7-8)。形态变化过程中观察到的细胞被使,AF-MSCs文化从不同的捐赠者提出一个典型的msc的外观形态与不同比例的扁平细胞(图1(一))。细胞培养的对比图像使显示放大和扁平形态细胞与胞质粒度增加和频率与senescence-associated阳性染色β牛乳糖(SA -β加)通道(图1 (c))。这些senescence-associated变化发生在AF-MSCs样本(D3、D4)显示增殖水平相对较低。

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图1
msc的特点来源于正常和病理妊娠期间培养的房颤。(a)代表的形象最初纺锤状msc形态在早期(p3)和衰老的段落(p7-8)与40 x放大。(b)微分msc的增殖房颤的个人捐助者(D)在培养通道8。(c) Senescence-associatedβ牛乳糖染色末通道(p7-8);NS: nonstained细胞。代表四个独立的MSC准备的结果。

与此同时,流式细胞术分析来确定执行immunophenotype代表的一个主要参数表征的msc的文化。如图2(一个)正常妊娠的msc AF样品immunophenotype早期的段落特征,显示超过90%的细胞CD44阳性CD90和CD105超过75%,但负面CD34造血的标志。这些标记物的表达在衰老后期下降通道(大约27 - 15%、职责)。Fetus-pathological样本(图2 (b))通过3保持非常相似但变量水平的细胞表面标记CD44和CD105程度较低的间充质CD90标志。在衰老8通道,所有表型标记的表达下降约25%,虽然CD105的表达,参与细胞增殖,下降了约40%。

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图2
Immunophenotype和msc来自具备干细胞标记物的正常和病理妊娠期间培养的房颤。(a)的细胞表面抗原标记流式细胞术直方图代表msc获得房颤的正常妊娠(N)在通道3和已故的通道8。细胞CD44阳性染色,CD90、CD105抗体为阴性CD34抗体。适当的免疫球蛋白g同形像被用作控制。(b)的比例均值CD44, CD90、CD105阳性细胞在msc文化源自房颤的病理妊娠(P)段落3和8。(c)的表达Nanog,Oct4,Sox2,Rex1从AF的正常样本(N)和病理妊娠(P)在章节3中,分析了6和8 RT-qPCR和规范化GAPDH表达水平。结果提出了均值±SD ( 从每组)。 和 被视为重大的改变。

AF-MSCs证实干细胞起源,我们执行RT-qPCR的分析主要从健康的捐赠者AF样本转录因子( 与胎儿异常)和( )。Oct-4 Sox2,参与多能性和自我更新,Rex1,在维护msc增殖状态至关重要,在非常相似的表达水平在所有房颤在早期和晚期的段落(图样本2 (c)),而Nanog是相对较低的表达在fetus-pathological样品通道3。mRNA的表达具备干细胞标记显示在水平变化与可变性使Oct4表达fetus-pathological样本。在段末(p8), Nanog表现水平的增加和Rex1这些样本中发现了与通道6相比,虽然差异没有统计学意义。

3.2。Senescence-Associated分子msc文化的变化

5所示,在使细胞培养来自两个房颤来源,msc保持特征immunophenotype和具备干细胞等因素,但后期的增殖潜力是严重影响段落。基于msc文化不同的观察经历衰老过程中培养,组织我之前代表快速增殖细胞培养成为衰老(p5-6)和组II包括慢扩散和衰老的文化(p8-9)(图3(一个))。我们观察到msc衰老伴随着典型的形态学改变和细胞成为扩大和增强的SA -夷为平地β加活动(图3 (b))。相同数量的SA -(大约30%)β-gal-positive细胞中检测出组I和II p6和票数(表示晚通道),分别。来洞察msc衰老的分子特征,我们分析了古典senescence-associated标记的mRNA表达谱的变化,p16INK4A分子(p16)、p21WAF1 p21, p53,和ATM(共济失调毛细血管扩张突变蛋白激酶),两组的细胞培养在早期(p3)和衰老后期段落平行的监测细胞形态。

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图3
表征senescence-associated标记在msc文化修养。(一)微分扩散两组细胞培养的msc (I和II)在培养通道3,5,8 ( 为每个组)。(b) Nonstained (NS)和SA -β加阳性细胞在两组msc通道6和9的文化。(c)微分mRNA的表达senescence-associated标记msc文化(我gr和II gr)通过3和已故的通道由RT-qPCR决定。正常化GAPDH和褶皱表达差异与通道3δCt方法使用比较阈值计算周期。给出了数据均值±SD ( 从每组)。 , , 被视为重大的改变。

证明mRNA表达分析确定RT-qPCR,衰老AF-MSCs文化显示增加p16表达式(图3 (c))和更明显的变化(14倍和p3)在我组与组二世(约5.5倍和p3)。的水平p16表达与扩散能力呈负相关。令人惊讶的是,我们观察到的增加p21和p53表达更快衰老细胞从组织我和减少后期衰老慢文化从第二组通道与早期相比通道细胞。的表达分析自动取款机扮演一个角色在DNA损伤后细胞周期延迟显示的表达水平增加之间的正相关关系自动取款机和p53、p21在衰老文化集团我从第二组和消极的。数据表明,msc文化不同接受周期阻滞扩散效率的下降和衰老形态学的外观。

接下来,我们关注的表达式分析miR-21和mir - 17使用RT-qPCR评估的角色培养期间的microrna msc的命运。图中给出的数据4(一)显示mir - 17和差别明显对这些miR-21衰老细胞培养的组我和组II。我们观察到不同褶皱的变化mir - 17在差别表达范围2.7 - 2倍对这些组我和组II,分别降低miR-21表达非常相似的两组样品(2.3 -2.5倍,职责)。

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图4
微分microrna的表达和干细胞标记在msc文化使。RT-qPCR分析mir - 17和miR-21 (a)和Nanog Oct4、Sox2, Rex1 (b)细胞培养的两组(I和II)通过3和已故的通道。正常化校准器样本(a)或GAPDH (b)和褶皱表达差异与通道3δCt方法使用比较阈值计算周期。给出了数据均值±SD ( 从每组)。 和 被视为重大的改变。

为了评估可能的microrna在衰老msc和自我调节因素之间的联系,我们进行基本转录因子的比较RT-qPCR分析Oct4, Nanog, Sox2, Rex1样本组我和组II的msc文化在培养早期(p3)衰老的段落。如图4 (b),衰老的细胞群我造成的表达减少Oct4 Nanog和无意义的Sox2和Rex1水平的变化。第二组的msc显示Oct4的表达水平显著降低,Nanog, Sox2, Rex1衰老通过与在早期通过(p3)。同样,mir - 17和miR-21调节msc的增殖和衰老可能通过影响细胞周期机械组件,可能通过与转录因子的交互参与细胞增殖和自我更新。

3.3。分子和表观遗传变化与衰老相关的msc房颤的正常妊娠和胎儿畸形

接下来,我们分析了功能的表观遗传调控因素HDAC和DNMT细胞衰老过程。如图5(一个)DNMT1的水平,结构上对维护既存表示在增殖细胞中DNA甲基化,减少在msc文化团体I和II与细胞衰老的发病过程,成为几乎检测不到通道6(在我组)和8通道(组2)。此外,ATM分析在蛋白质水平显示之前msc文化状态进入增长逮捕典型的衰老。msc文化组我,磷酸化ATM蛋白(ATM-P)积累在通道6和8与p53的增长水平,而nonphosphorylated ATM发现段落4和6的明显减少,后期通过(p8)(图5 (b)),显示细胞周期阻滞后损害DNA双链断裂的形成。msc文化中二,更少的表情ATM-P ATM,在使逐渐减少,在p53表达明显下降的同时,同样明显的是被显示在图3 (c)。

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图5
表观遗传变异在msc使文化来源于正常和病理妊娠的房颤。从细胞溶解产物样品的健康(N)捐助者(D)和胎儿异常(P)受到免疫印迹分析监控使用表示抗体蛋白的表达。(a, b)代表墨迹的蛋白质从细胞培养的两组(I和II)在培养通道4,6,8和(c)从细胞培养来自房颤的正常妊娠(D1)和个人捐助者(D2-D4)携带胎儿异常。数据代表至少两个凝胶显示出类似的结果。

分析HDAC1和PRC2 polycomb组蛋白,EZH2和SUZ12样本组I和II DNMT1的表达谱相似和HDAC1(图5(一个))。更快的衰老细胞的组我,结构异染色质的标志,H3K9me3,显示在使表达水平降低了一个不变的水平相比在细胞组II(图5(一个))。如图5 (c)、减少DNMT1的水平和HDAC1在文章末发生在细胞培养来自个人捐赠者的AF样本(D)正常(N)和fetus-pathological (P)妊娠和个人文化的复制能力的程度。例如,在样本捐赠者D4(携带唐氏综合症),在msc衰老过程被推迟,DNMT1和HDAC1表达仍高于其他样品在同一通道(p8)。PRC2蛋白质的表达水平的变化相似,EZH2和SUZ12和BMI1 PRC1组件发现在房颤样品相同的捐助者,展示msc衰老过程(数据的含义5(一个)和5 (c))。

组蛋白的表达水平之间的相关性H3K27me3 EZH2,特别是trimethylates组蛋白H3在赖氨酸(K) 27日在衰老细胞被发现从fetus-affected AF样本,显示动态改变染色质结构在细胞衰老。这个马克积累早些时候发生和维持使更快的衰老文化样本D1。结果表明,表观遗传修饰酶,PRC2 PRC1复杂的蛋白质,和压抑的组蛋白修饰和microrna一起合作参与衰老过程AF-MSCs文化来自胎儿的健康和个人的捐助恶性肿瘤。

4所示。讨论

在我们之前的研究中,我们表明,AF-MSCs文化从正常怀孕的第二和第三阶段表现出干细胞的特征期货由特定的细胞表面标记物的表达及其multipotential分化的能力(28]。到目前为止,所知甚少如何AF-MSCs亚种群来自正常和fetus-affected捐助者改变在文化扩张。如图所示在这项研究中,一些msc文化源自AF叛逃怀孕期间使显示一些变化在他们的表型(CD44 +, CD90 +和CD105 +)和增殖潜力。msc从不同的捐助者提出一个典型的细长和纺锤状形态在早期文章的出现各种比例的增大细胞兼容形态进入衰老的细胞。AF-MSCs样本显示,扩散能力和个人间变化时间达到衰老被描述在先前的研究29日- - - - - -31日]。数据(24)支持在msc文化异质性的概念以及关于复制衰老。有证据退出msc孤立的长期增殖能力的差异从不同的捐赠者和供者年龄和msc增殖能力之间的负相关(13]。此外,扩散率在不同高度不同的AF样本非决定性的指数增长长度来分离衰老没有任何解释(13]。对增长不利,由于胎儿异常与其他几个研究,这表明不同寻常的增长失败有关胎儿非整倍性(32),非整倍体分析,以及妊娠年龄(33)较低的增长率比早期妊娠(怀孕后期的文化34]。

我们表明,种植不同的msc样本来自AF的正常和病理妊娠导致衰老和与形态学和分子特征表达不同,而早期的段落。在培养AF-MSC样本(p3 p8), senescence-associated标记的基因表达水平的改变(p16, p21、p53和ATM)是与人口增殖和衰老能力(根据SA -的百分比β-gal-positive细胞)。在更快的衰老msc文化中,p21,p53,自动取款机在文化表达明显增加,但减少延迟衰老(图3)。然而,两种文化含有较高含量的p16衰老标志。有争议的数据存在于衰老骨髓msc的表达式p21,p53,p16从所有这些[upregulation35]或仅p16(36)的表达式p53(37]。众所周知,细胞衰老主要是由p53 / p21和p16 /通路,p53、p21通路介导的复制衰老和DNA损伤反应中扮演重要角色,而p16 /复审委员会通路介导应激和过早衰老38]。基于我们的研究结果,我们建议这两个通路参与更快衰老msc、当p53诱导和稳定上游激酶磷酸化,包括ATM和相关的39- - - - - -41]。p21的随后p53上调转录激活Rb通过抑制细胞周期素E / Cdk2复杂,同时激活Rb抑制E2F靶基因的转录,如细胞周期蛋白和PCNA,导致一个长期的细胞周期阻滞(42]。另一个Cdk抑制剂p16,由Ets转录因子介导通过转录激活,激活Rb通过抑制细胞周期素D /到6复合物和积累在细胞衰老细胞造成生长迟缓和逮捕在G1 (21,43,44]。在AF-MSCs从第二组的衰老过程被推迟,p16调节,暗示p16 /复审委员会的参与途径和支持这个概念p16和p21扮演着不同的角色的启动和维护衰老细胞周期阻滞(45]。

它并不出人意料,DNMT控制细胞衰老。msc的增殖特性是由关键多能性基因的表达会使细胞周期调控,如p16和p21 [22),通过直接绑定Oct4和Nanog DNMT1的启动子,增强其表达维持DNA甲基化(23]。在我们的研究中,减少DNMT1 AF-MSCs衰老平行的差别,对这些基因的表达水平PRC2复杂的蛋白质,EZH2和SUZ12 upregulationp16和p21(数据3 (c)和5)。EZH2的差别的有效对这些更大的效果更快衰老AF-MSCs文化(图5)正值EZH2的观念也与复制衰老(46]。

microrna是一类小型和非编码rna的核苷酸一般年龄在18岁至25岁之间的降解目标基因表达在转录后的级别(47]。越来越多的证据表明,microrna导致伴随老化基因表达变化的许多人类细胞类型包括msc (11,48]。最近,mir - 17 (mir - 17 - 92集群成员)被证明是显著下调很多衰老模型系统(48),这表明它作为一种新型生物标志物细胞老化。mir - 17被证明目标基因参与细胞周期控制(49),包括p21 [48,50),通过E2F转录激活p53和镇压,因此激活cyclinD1 /到复杂[51,52]。这是与我们的结果一致,证明减少mir - 17(图表达4),发生与水平的提高p21和p53在文章末更快衰老文化(图3)。在衰老慢文化中,mir - 17行为可能通过调节E2F目标基因参与细胞周期控制。

miR-21作用的研究在许多领域,包括干细胞生物学和老化53]。在AF-MSCs miR-21已被证明是高水平表达,涉及潜在增殖和细胞周期阻滞的规定直接针对Sox2和抑制其表达或减少Oct4和Nanog表达式通过间接机制[54]。最近的研究(54]表明miR-21感应在自行车、presenescence细胞导致Sox2的表达减少,Nanog, Oct4和与细胞增殖率和减少细胞周期阻滞于G0 / G1。在我们的研究中,miR-21表达显著降低在msc衰老段落(p5-8)协调与降低Oct4、Nanog, Sox2(图4)。建议miR-21参与促进衰老通过瞄准Sox2 Sox2是基于数据(但不是Oct-4和Nanog) miR-21被确认为目标,在纺锤形AF-MSCs[消极监管54]。与我们的数据协议,Oct-4的表达式和Nanog p21的表达增加后期曾被报道在msc。相反,混战p21的段落msc抑制衰老,增加细胞增殖和具备干细胞标记物的表达54]。因此,表达下调表达Oct4和Nanog是指作为一个潜在的候选标记干细胞的衰老状态(22,23]。我们也观察到的表达减少Rex1在缓慢衰老msc文化协会明显减少Nanog, Rex1的转录激活因子,维持其表达式。

AF-MSCs的因果因素调节衰老过程可能包括表观遗传状态连续变化。Polycomb组蛋白,形成multimeric复合物PRC1 PRC2,已被证明是与复制衰老25- - - - - -27]。microrna的参与和活动/非活动组蛋白标记的细胞周期调节p21和p16基因的启动子区域的目标组蛋白甲基转移酶EZH1。反过来,抑制衰老msc导致脱甲基的EZH1 H3K27和激活p16表达式,它与我们的研究结果是一致的。在我们的研究中,我们演示了压抑的组蛋白修饰的变化,H3K9me3(下调)和H3K27me3(调节),在AF-MSCs文化扩张通道4到8。人们普遍认为的甲基化标记与基因沉默,但基因镇压H3K27me3兼性异染色质的形成有关,而镇压H3K9me2 / me3与本构(永久)异染色质55]。甲基化的H3K27 EZH1或EZH2与基因镇压通过polycomb组蛋白(46]。在增殖细胞,DNA主要是发现少浓缩的常染色质的状态,允许访问的转录和DNA复制机制。相反,衰老细胞的特点是人口打包兼性异染色质的存在,组织成结构命名senescence-associated异染色质焦点(SAHF) [56]。最近的研究的数据24)表明,DNA甲基化变化干细胞衰老与压抑的组蛋白标记(包括H3K9me3)而不是二价(H3K4me3和H3K27me3)进行修改。DNA甲基化资料显示一致的senescence-induced甲基化相关地区H3K27me3和H3K4me1 / me3标志,而包含H3K9me3 hypomethylation与染色质。DNA甲基化是显著富集基因,要么是——或下调后的段落57]。全球亏损H3K9me3和异染色质结构的变化被发现在msc细胞衰老的期货(58]。HDAC1在细胞衰老的因果作用通过改变染色质的结构是减少HDAC1水平和增长也逮捕了(59]。在这项研究中,我们定义了一个显著的减少HDAC1与衰老AF-MSCs过程(图的程度5)。因此,染色质的上下文中,chromatin-modifying酶和压抑的组蛋白修饰的定义涉及AF-MSCs命运通过染色质重塑。

总之,我们的研究表明,衰老过程msc在文化的扩张使包括改变细胞周期调节基因的表达,具备干细胞转录因子,microrna,表观遗传调节器必须考虑AF-MSCs治疗应用。

缩写

AF-MSCs: Amniotic-fluid-derived间充质干细胞
BMI1: B淋巴瘤Mo-MLV插入区域1
EZH1和2: 增强剂的Zeste组蛋白H3K27甲基转移酶
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
Oct-4: Octamer-binding转录因子4
中华人民共和国: Polycomb压抑的复杂
RT-qPCR: 定量实时聚合酶链反应
Sox-2: 性别确定区域Y-box 2
Suz: Zeste的抑制。

伦理批准

研究与人类羊水是生物医学研究的伦理委员会批准维尔纽斯地区,没有。158200-123-428-122。

相互竞争的利益

没有披露潜在的利益冲突。

作者的贡献

JūratėSavickienė设计研究,分析实验,写论文。桑德拉Baronaitėamniotic-fluid-derived干细胞隔离,表征,immunophenotype分析,为进一步分析和准备。AistėZentelytėRT-qPCR执行和流式细胞术。Gražina Treigytė做免疫印迹。Rūta Navakauskienė构思实验,有助于解释数据,修订后的手稿。

确认

这项工作是支持的研究委员会的立陶宛(项目MIP-57/2015)。