MBP浓度和表面压力的影响与朗缪尔影片中胆固醇

文摘

预测机制MBP绑定胆固醇有意义了解MBP参与横向膜组织。MBP的交互与胆固醇单层调查三个表面压力10毫米Tris-HCl缓冲与不同浓度的MBP。结果表明,π- - - - - -一个等温线转向分子面积更大的压力。通过分析π- - - - - -T曲线、表面压力增加。结果表明,子阶段中蛋白质浓度越大,越大表面压力的增加。此外,单层表面形态的变化和域的形成是由AFM。这些结果提供更直接的和令人信服的证据的MBP与胆固醇。MBP-cholesterol交互显示显著的浓度和表面压力的依赖,可能是由氢键。提供的日期可以帮助理解的分子机制的至少一个MBP影响胆固醇膜的横向组织。

1。介绍

胆固醇是一个重要的组成部分,中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(pn)髓鞘和充当信号分子的前体在中枢神经系统1]。此外,MBP的主要组件的维护和完整性的中枢神经系统髓鞘的形成。蛋白质之间的相互作用与脂质结构在各个领域中起着重要的作用[2]。大量的生物反应发生在接口的主要成分是蛋白质和脂类。lipid-protein交互的系统的调查已经进行使用生物膜模型朗缪尔电影air-subphase界面的平衡。朗缪尔电影平衡也被称为水(磅)技术。它是用来研究区和表面压力之间的关系在液体表面传播的电影。迄今为止LB技术往往是伴随着AFM确定单层的地形和域在不同的子阶段组成、表面压力,pH值,温度等等3]。

这里,简单的生物信息学方法被用来设置是否MBP,中枢神经系统髓鞘的主要结构蛋白之一,是胶粘剂胆固醇的能力。MBP的主要代理已经确认是中枢神经系统髓鞘的形成和维护完整性(4,5]。根据临床经验和最新研究,MBP被发现与髓鞘退化。多发性硬化(MS)攻击myelin-wrapped神经的中枢神经系统6]。MBP与170氨基酸残基水溶性蛋白质,分子量18.5 KDa的净正电荷19日在生理pH值(7,8]。维护包装神经元髓鞘通过维系少突细胞的细胞质膜MBP的主要生理作用[9]。总之,MBP本质上是一个非结构化(无序)的蛋白质,可以结合极性脂质,如磷脂和胆固醇。

值得注意的是,胆固醇是生物膜脂质中非常特殊,因为它是多环,有一个非常小的极性头组(-哦),并且不包含任何acyl-chain,允许生物化学变化(图1)。同时,胆固醇是不可或缺的重要组成部分pn和中枢神经系统髓鞘,在中枢神经系统,其主要作用是作为信号分子的前体,如oxysterols和刺激神经组织的类固醇(10,11]。各种实验数据测量单层MBP的吸引力和绑定或影响不同的脂质成分是由疏水链的疏水相互作用调制脂质酸性脂质头组和静电相互作用[12- - - - - -15]。最近的证据还表现,结合MBP cholesterol-containing膜影响形成的脂质microdomains [16]。因此,预测MBP可以结合胆固醇是非常重要和有意义的理解如何MBP参与横向膜组织的胆固醇。通过应用物理化学和chemoproteomic策略,小说cholesterol-protein相互作用在活细胞最近描述(17]。

由于胆固醇是髓鞘脂质膜的重要组成部分,其形成机制可以把互动MBP和胆固醇。然而,没有交互的胆固醇MBP已经详细调查。在这里,LB技术用于检测MBP的吸附胆固醇表面表面压力的函数,吸附时间,大部分MBP浓度。

获得的结果表明,有可能的交互。这些结果的研究提供一个新的认识至少一个可能的分子机制的细胞质髓磷脂单层膜的完整性和功能。

2。材料和方法

2.1。材料

MBP从牛脑提取和纯化的根据已建立的程序水溶性Deibler et al ., (18]随着Tris-HCl 10 mM, pH值7.2,准备工作溶液的浓度范围 M。胆固醇(纯度> 99%)购买以粉末形式从两代情极性脂质,Inc .(美国艾尔雪花石膏),并使用没有练习进一步净化程序。在单层膜的研究,胆固醇是溶解在氯仿/甲醇3:1 (v / v)混合物的最终浓度1毫克/毫升,作为传播解决方案一般20µl .所有实验水(18.2 M从微孔净化系统厘米)收购。

2.2。表面压力区等温线

所有实验KSV Mini-trough系统(芬兰赫尔辛基)的有效表面积槽 毫米²。测量分辨率mN / m槽容积为240毫升。

单层传播通过脂质溶液在10毫米三(羟乙基)amino-methane滴定与HCl pH值7.2。所需的脂类解决方案都需要在空气/子接口包含适量的MBP用汉密尔顿微量调节注射器。剩下15分钟为单层膜的溶剂蒸发后压缩的恒速10毫米/分钟/障碍。子阶段的温度保持不变,水的循环器浴。在每个实验之前,槽和障碍是用无水乙醇洗净,用超纯水清洗。

压缩的胆固醇单层发生直到15 mN / m的目标表面压力。表面之间的相互作用引起的压力变化的MBP子阶段与胆固醇单层连续记录作为时间的函数通过使用计算机控制的磅,直到表面压力平衡,表明吸附的结束。所有测量数据被重复三次最低确保再现性。

2.3。原子力显微镜(AFM)观察

AFM图像获得的在空气中:在室温下用spm - 9500 j3 AFM(日本岛津公司公司、日本)。AFM图像通过使用微型v型悬臂(奥林巴斯光学有限公司,日本)弹簧常数为0.06 N / m,长度为125米,厚度400海里。所有图片( 分)在空气中进行的扫描速率1 Hz。

3所示。结果与讨论

3.1。热力学相互作用的单层等温线

表面压力和分子区域(- - - - - -)等温线的胆固醇在缓冲层传播子阶段包含MBP在不同浓度(0、1.0、2.5、4.0和5.5 nM)测量 °C(在图2)。由此产生的π- - - - - -曲线表明单层的相行为在压缩的过程中,当分子包装逐渐增加。纯胆固醇单层的等温线,曲线是在协议与以前的工作[报道19- - - - - -21]。提出了图2,子阶段的MBP浓度的增加,曲线我们研究转向了更高的地区。也就是说,他们占据了更大的地区在给定表面压力比膜纯水表面传播,这意味着存在MBP诱发脂质构象的变化。类似于我们的先前的研究22),当添加到子阶段,MBP引起胆固醇单层的构象的变化。此外,曲线和表面形态的变化表明,有着很强的胆固醇和MBP分子相互作用。AFM观察MBP /胆固醇显示域在不同表面的压力,和单层表面压力增加时立即变得均匀。研究发现,吸附过程主要取决于之间的氢键hydroxylic组胆固醇和MBP,和MBP也可能影响胆固醇的单层膜的构象。

量化单层膜的相变过程,我们介绍了压缩模量的参数()。研究人员发表了,混合物在脂质层的存在产生更多的可压缩电影强烈依赖于脂质分子的大小和疏水性(23]。它已成为一个重要的参数描述的过渡地区,分析的基础上π- - - - - -等温线。这些实验值计算通过使用以下方程: 在哪里每个分子是单层的吗π是相应的表面压力24]。可以用来描述的阶段状态单层(= 12.5 ~ 50 mN / m,脂质增加,= 100 ~ 250 mN / m,脂质浓缩)[25]。另一个作用是用于比较不同单层的弹性模量。越高价值越有序单层膜(26]。

呈现在图的插图2,我们的变化与π层的MBP /胆固醇。纯单层的胆固醇,它展示了一个典型的浓缩单层的最大值超过800 mN / m(固相)。胆固醇形成单层水子阶段一直在研究各种工作(27]。在我们的例子中,压缩模量层混合MBP /胆固醇下降与MBP浓度(图3)。它可以得出的结论是,整合MBP的单层膜胆固醇下降原因值,单层膜变得更加无序。这种行为表明,MBP与胆固醇分子在空气/子接口。

3.2。定量分析的连续Compression-Expansion周期

为了研究混合连续单层compression-expansion周期的稳定性进行了空气/子界面(见图4(一),4 (b),4 (c))。结果连续滞后周期的胆固醇单层膜在不同浓度的MBP变量表面压力值如图4。的- - - - - -等温线的MBP /胆固醇混合单层完全转移到更高的领域这表明之间的交互MBP,胆固醇是强烈影响的浓度MBP的子阶段。通过分析compression-expansion周期的三个表面压力(5、15和30 mN / m),我们成立了扩张等温线向左移动略相对于压缩。原因这一现象表明,MBP /胆固醇混合单层显示了一个温和的磁滞行为几乎没有损失的材料到Tris-HCl子阶段(图4)。同时,纯粹的胆固醇不显示磁滞。这是显示在图4所有胆固醇/ MBP电影展示某种程度的滞后MBP浓度在不同吸附后,压缩曲线的电影发生在分子领域高于膨胀曲线的一部分。明显的损失的量化compress-expansion周期的%的条款是根据定义的

在和分子面积的值是第一个压缩曲线为不同的浓度和表面压力,分别。明显损失的价值是用于描述各种参数的影响,如表面压力和浓度的蛋白子阶段。的数值特征明显的展示在表1。

表中的数据1我们分析表明,MBP,表面的浓度越大压力,更明显的价值损失;然而,我们注意到明显的滞后损失非常小的三个面上的压力。最大值明显损失的3.34%,表明混合单层的微小变化将MBP浓度为5.5纳米的表面压力30 mN / m。这个结果表明更稳定的互动MBP和胆固醇在这个阶段。

3.3。亲和能力MBP到胆固醇单层

MBP的亲和能力到胆固醇单层是由磅实验在不同浓度的MBP的子阶段。图5(一个)显示表面压力的增加( ),胆固醇是分布在界面的初始表面压力15 mN / m。表面压力的增加意味着MBP插入胆固醇单层不同MBP浓度。与子阶段的MBP浓度的增加,表面压力的增加也会增加( )。高原后观察到6800年代,这表明MBP吸附在脂质胆固醇电影流程接口或在本体溶液(聚合)。图5 (b)应该强调这样一个事实:MBP吸附单层的能力很大程度上取决于MBP,单层的成分的浓度在air-subphase接口。

3.4。通过原子力显微镜表面形态探索

单层膜在空气/子阶段界面转移到平滑云母基板供AFM检测。我们的主要目标是检测MBP是否会导致胆固醇的形成单层的构象变化。最初的表面的脂质层是压力 , , mN / m和子阶段的MBP浓度0,1.0,2.5,4.0,和5.5 nM,分别。在数据6(一)和6 (b)准备的MBP,水已经被AFM可视化方法。显然这些颗粒形成的MBP分子。表面形态的变化相互作用引发的胆固醇单层MBP和AFM反映。图7表明形态学的图像混合单层变化显著的MBP浓度和表面压力。数据7(一),7(b)7(c)显示纯胆固醇的AFM图像层沉积在5日,15日和30 mN / m。有单相结构线张力形成的圆域模式5 mN / m的侧压力,最后显示密度均匀,表面压力的阶段30 mN / m。

子阶段的MBP的存在可能引起急剧变化的地形的单层视图。在MBP浓度1海里,子阶段的随机分布不规则的小单结构域(可以找到数据7(d),7(e)7(f))。这部电影越来越密度时,表面压力达到30 mN / m。图像的不同吸附表面的压力,虽然小,但很有意义。从AFM图像,可以推断出,混合单层的表结构不同于纯粹的胆固醇单层,表明公司的MBP在组织胆固醇膜扰乱胆固醇。我们还提出了图像为混合单层MBP浓度2.5 nM(子阶段的数据7(g),7(h)和7(我))。可以观察到的侧压15 mN / m, MBP单层吸附是随机分布的,和一些MBP分子相互聚集。MBP浓度增加到4海里,分散蛋白质粒子观察,其中大部分形成了近似形状的球冠(数字7(j),7(k)7(左))。我们可以分析这些MBP分子似乎总规模和增加,如图6。在更高的子阶段MBP浓度为5.5纳米,这些MBP分子聚集似乎连接在一起形成更大的结构(数据7(m),7(n)7(o))。你可以看到,在高度图(数字8和9)。

这个结果支持- - - - - -等温线和磁滞行为表明,胆固醇引起的单层的形态变化与MBP。作为氢键的形成被认为是参与交互的MBP胆固醇膜。

4所示。结论

我们的研究提供了实验证据之间的交互MBP和胆固醇。MBP的表面行为与胆固醇被应用水技术系统地研究。层的胆固醇是在含有不同浓度的亚幕MBP传播,并测量他们的曲线。的重要发现这项工作可以概括为以下三个方面。首先,- - - - - -将MBP绑定和滞后等温线表明,胆固醇是单层的表面吸附。其次,AFM图像的实验结果得到本研究证明胆固醇单层的构象变化引起的不同浓度的MBP子阶段。同时,形成MBP骨料之间通过互动的羟基胆固醇和MBP的氢键。最后,子阶段的MBP浓度影响MBP吸附的主要因素除了cholesterol-MBP氢键包括疏水cholesterol-MBP交互。因此,这项研究的结果提供细节的理解MBP-cholesterol之间的相互作用的分子机制。他们可能在中枢神经系统和pn提供有用和有意义的信号分子的前体。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。21402114),中央大学的基础研究基金(没有。GK201604004),中国陕西省自然科学基础研究计划(2016 jm2010)。

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