文摘
过去的十年中PPARγ研究已经有了极大的提高我们理解不同的结构和机械基地不同种类的PPAR的生理效应γ配体。的核心的发现这些发展使一类新的PPAR的设计γ配体,能够隔离中央PPAR的治疗效果γ调制,而显示PPAR的毒性明显低于上一代γ配体。本文考察了新兴框架在这些配体的设计和寻求团结与发展的原则新的PPAR类配体α和PPARβ/δ。重点是配体的绑定模式之间的关系,他们的影响力在PPAR转译后的修改,和基因表达模式。具体地说,我们鼓励设计和研究主要结合的配体ΩPPAR的口袋α和PPARβ/δ。在支持这一发展中,我们强调研究已经报道的配体,如果这个新框架的上下文中可能会进一步了解基因的项目由PPAR监管α和PPARβ/δ。此外,最近开发的药理工具,可以利用在寻找新的绑定模式的配体也。
1。介绍
的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)成员的一类转录因子调控基因转录是由配体调制绑定类也被称为核受体。到目前为止,所述的三个PPAR亚型PPARα,PPARβ/δ,PPARγ分别为(NR1C1 NR1C2, NR1C3) (1),多畴的蛋白质,每个由一个高度流动的n端结构域(域a / B), dna结合域(DBD,域C),铰链区(域D), C端配体结合域(精神的小黑裙),域E / F)。其中,氨基和c端域,分别包含ligand-independent激活函数1 (AF-1)和ligand-dependent激活功能2 (AF-2)(图1(一))[2,3]。PPARs主要是描述为代理通过与视黄heterodimeric复合物X受体(rxr) [4]。在绑定到DNA,每个PPAR的DBD: RXR异质二聚体通常与自己的过氧物酶体扩散国的反应元素half-site (PPRE)目标基因的启动子或增强子区域,例如,重复一致序列隔开一个nucleotide-a直接重复(图1(根据DR1)元素1 (b))[5- - - - - -7]。PPAR: RXR异质二聚体为特征宽容的,在这个意义上的配体结合的配体结合口袋(LBP)受体可以激活转录。因此,虽然9 -的绑定独联体视黄酸(图S1)或其他RXR RXR枸杞多糖受体激动剂可以积极调节目标基因,绑定的PPAR激动剂的枸杞多糖似乎发挥更强和主导作用的激活PPAR: RXR异质二聚体。连贯,绑定的受体激动剂受体可以激活转录协同8- - - - - -11]。
(一)
(b)
在规范化机制,引入一个PPAR激动剂的枸杞多糖导致辅阻遏物蛋白的释放复杂的绑定到apo-PPAR: RXR异质二聚体通过平台蛋白质如核受体辅阻遏物(NCoR),沉默中介类维生素a和甲状腺激素受体(SMRT)或SMRT和组蛋白deacetylase-associated蛋白质(大幅),包含或与组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac) [15- - - - - -18]。holo-PPAR: RXR复杂随后新兵共激活剂蛋白质如CREB-binding蛋白质(CBP),类固醇受体共激活剂1 - 3 (SRC1-3),中介复杂的亚基1 (MED1 TRAP220,或DRIP205),或PPARγ共激活剂1α(PGC-1α),进而导致招募其他核蛋白质共激活剂复杂,通常显示组蛋白乙酰基转移酶(帽子)活动。开关动作的hdac的帽子增加组蛋白乙酰化作用的改造,导致染色质组装所需的功能,multiprotein转录复杂(19- - - - - -22]。随后PPAR目标基因的转录过程称为transactivation完成。有趣的是,绑定的PPAR激动剂也能导致某些辅阻遏物的招聘蛋白质,如receptor-interacting蛋白140 (RIP140) [23,24]或TNFAIP3-interacting蛋白1 (TNIP1) [25),包含receptor-interacting域(rid)类似共激活剂中发现的蛋白质(26]。
与PPRE-mediated监管目标基因表达的PPAR: RXR异质二聚体,holo-PPAR单体也可以直接交互与其他转录因子和减弱他们的目标基因的表达机制称为transrepression [27- - - - - -33]。这从根本上不同的转录调控机制已被证明是参与,例如,PPAR激活的抗炎作用31日,32,34- - - - - -36]。
产生的蛋白质在PPAR目标基因的表达调控脂质中的关键角色和葡萄糖代谢(37- - - - - -39]。因此,PPARs尽可能吸引了大量关注的药理干预人类的代谢疾病。在过去的几十年,几位古典如一类(PPAR激动剂家庭α),glitazones (PPARγ),glitazars (PPARα/γ)已被批准用于治疗人类的代谢疾病。然而,许多这些药物已经被撤出市场由于严重的副作用,临床使用(例如,致癌作用在不同的组织,心肌梗塞,骨质密度,和体重)(40- - - - - -51]。虽然有效的改善患者的代谢参数选择,PPAR经典受体激动剂的相对失败代表安全的治疗方案可能造成人员在学术界和业界放弃PPARs进一步配体的发展目标。
然而,过去十年的结果,尤其是来自研究部分和PPAR nonagonistic配体的影响γ表明,经典受体激动剂引起的副作用和一些需要,PPAR的有利影响γ结扎是独立的机械的起源。在一起,这些结果形成一个新的配体设计范式的基础,一个关键的概念,与配体结合如何调节的发生(天车)的PPAR转译后的修改γ,进而导致特定的基因表达模式。这从PPAR的历史和相关概念γ配体最初发展进行了综述。然后我们公司将这些概念应用到历史和未来的配体PPAR的发展α和PPARβ/δ通过强调结果,重新配体,值得关注和进一步研究工具,可以揭示未知转录本的治疗相关性。
2。PPAR结构
除了大量的原子分辨率数据公共领域中存在的“分离”和整体的结构形式的小黑裙PPARs (E / F)领域,我们理解C和D的结构域,以及氟的第四纪组织域,是改善7,12,52,53]。然而少即是知道的结构布置高度移动的氨基端A / B域名AF-1 [54]。尽管如此,AF-1诱导转录的能力独立于AF-2和配体结合的证明55- - - - - -57]。A / B域的序列之间的差异也明显PPAR亚型和观察接头之间的变异(亚型)各亚型58- - - - - -61年]。连贯,AF-1地区已被证实能影响每个PPAR亚型的选择性调节目标基因的表达(3),而且转录激活诱导配体结合的程度(62年]。
PPAR具嬉皮精神的小黑裙的结构包括一个三明治的螺旋1 - 12 (H1-H12), 3 - 4β链(β1 -β4),和几个著名的循环,整个褶皱是类似于其他核受体(NRs)类固醇激素受体超家族。标准的PPAR螺旋编号方案,请参阅Uppenberg et al。63年]。的主要腔的小黑裙比在其他关系(~ 1300 A3(64年,65年中央H3)和包装。H3的两侧,腔是封顶的Ω循环(H2 - - - - - -H3循环)或H12和H11-H12循环。H3的两侧subcavities扩展沿其轴和H1-H2循环,此外有限的β片区域,H2 ,H5和类推,一方面,由H5和H7, H11,另一边。从使用的术语Waku et al。66年),这两个subcavities PPAR的枸杞多糖将称为Ω分别口袋和AF-2口袋里(图2)。与最近的PPAR文献进行比较γ,这些蛀牙大致对齐的区域称为备用或变构结合位点和orthosteric结合位点,分别为(67年,68年]。总的来说,枸杞多糖的PPARs可以视为T -或y形的,他们因此被分为三个武器69年];手臂我把手伸进AF-2口袋,而手臂II和III很大程度上构成了Ω口袋里。残留数据给出了本文参考UNIPROT规范亚型为每个已知的人类PPARs: hPPARα1 (Q07869-1), hPPARβ/δ1 (Q03181-1), hPPARγ2 (P37231-1) (1]。为比较文学与早期使用,例如,hPPARγ1编号,这些残留的数字在括号中是适用的。
H3,之间的接口Ω口袋和AF-2口袋,PPARs主机保守的半胱氨酸残基的地区。的半胱氨酸在所有三个PPARs (hPPAR是守恒的α:Cys276 hPPARβ/δ:Cys249, hPPARγ2 (γ1):Cys313(285))坐落H3和点之间的窄颈Ω口袋,AF-2口袋(图2)[1,70年]。虽然这半胱氨酸是PPAR明显亲核β/δ(71年- - - - - -75年)和PPARγ(66年,67年,71年,76年- - - - - -84年),最终在PPAR相应Cys276的亲核性α似乎超过了其邻国Cys275 [76年),位于H3的侧脸Ω口袋里。solvent-exposed一边H3, PPARα和PPARβ/δ包含额外的半胱氨酸(分别Cys278和Cys251),尚未建立的反应活性(图2)。
3所示。古典PPAR激动、对抗和超越
结构,辅阻遏物的分离蛋白复合物和协会共激活剂相关蛋白质复合体似乎H3收紧沟槽的形成,H4, H12,适合给定的绑定的rid共激活剂蛋白质,但这无法容纳稍长一些的rid的典型辅阻遏物蛋白(64年,85年- - - - - -88年]。H12的外表面是中央共激活剂的结合蛋白质,许多已知的PPAR配体已经被观察到,或者确实设计,稳定和守恒的氢键网络通过交互H12 AF-2口袋,涉及守恒的酪氨酸和组氨酸残基H5、H11、H12 [89年]。
访问AF-2口袋的绑定头组经典论争的配体也为配体的发展打开显示H12-mediated对立(90年]。这些配体通过扰动破坏H12 AF-2口袋氢键网络或通过引入sterically要求半个AF-2口袋里(86年,90年- - - - - -96年]。在PPARγ附近,交互与其他残留物,如Phe310(282)和Phe391(363),也被卷入这类敌对的配体的作用方式(97年,98年]。根据观察到的构象和折叠的H12几个可用的x射线晶体结构的配合物配体,它们似乎破坏稳定的H12对接上的小黑裙的核心,从而形成或稳定coactivator-binding槽(85年,88年,99年]。PPAR Phe310 / Phe391-interacting类的γ敌对的配体,更微妙的相互作用或替代绑定模式可能参与,进而影响H12[的构象的人群97年,98年]。
的一些报道敌对的配体显示逆激动,因为它们导致PPAR-mediated转录水平低于基底在给定模型系统或试验(91年,94年,95年,97年,103年]。在其他相似报道PPAR逆受体激动剂(104年- - - - - -106年),观察到的基质浅转录水平可能反映在此类配体的趋势加强互动的PPARs辅阻遏物蛋白质,如NCoR SMRT,相比apo-PPARs (85年,88年,93年,103年- - - - - -106年]。
考虑的小黑裙构象动力学,配体结合导致构象的变化具嬉皮精神的小黑裙),所观察到的核磁共振(NMR)谱(68年,86年,87年,97年,107年- - - - - -111年),hydrogen-deuterium交换耦合的质谱(HDX-MS) [68年,97年,101年,107年,112年- - - - - -117年)和分子动力学(MD)模拟86年,87年,96年,118年,119年]。在PPARγ这样的结构,分析了乐团已经表明,大型构象多样性apo-PPAR中观察到γ,特别是H12,强烈减少在与古典受体激动剂。相比之下,在更弱的受体激动剂治疗,部分,nonagonists H12仍然填充一些最小值(87年,107年]。前后一致地、高H-D汇率一直在观察H12 PPARγ对待一个反兴奋剂,相比apo-PPAR H12γ(97年]。值得注意的是,的运动Ω循环holo-PPAR复合体的构象的人群也被认为会影响H12 [78年,118年,119年]。
在过去的十年中,证据积累了临床使用PPAR的毒性α和PPARγ经典受体激动剂,如某些一类(40,41],glitazones [42- - - - - -46],glitazars [47- - - - - -51),以及PPAR的β/δ经典受体激动剂在啮齿动物(120年,121年]。结合的知识他们共同H12稳定的能力,经常观察到的不良影响这些配体可以理解为系统毒性的迹象。此外,当发现PPAR的研究γ证明古典激动不需要获得治疗相关转录结果(见部分5),最近针对PPAR配体发展γ旨在避免配体,强烈稳定H12 [97年,122年- - - - - -127年]。虽然这样的PPAR模配体γ正在成为众多(部分5。3),有一个短缺的PPAR相似的配体α和PPARβ/δ(见章节6.1和7所示。1)。
修改这一点,积累的经验与配体相互作用的功能影响H12,上面描述的,可以作为指导未来设计部分——nonagonistic PPAR配体。理想情况下,这些配体不应导致supraphysiological H12稳定,但可能实现,而寻求治疗相关的影响,例如,通过影响PPAR转译后的修改(天车)(部分4)。
4所示。PPAR转译后的修改
配体结合远非唯一事件影响的活动和生理角色PPARs一生中。PPARs是观察到,许多共价修改核环境中是很常见的,因此,也存在于其他转录因子和组蛋白蛋白质(128年,129年]。到目前为止,天车在PPARs包括O-phosphorylation O-GlcNAcylation,N乙酰化作用,N-SUMOylation,N泛素化(130年- - - - - -133年]。调查这些多功能天车的调节蛋白质功能是其他复杂铝对另一个的影响。这包括多功能天车之间的直接竞争的可能性O-phosphorylation和O-GlcNAcylation相同的丝氨酸,苏氨酸、酪氨酸残基(134年),以及多功能天车之间等N乙酰化作用,N-SUMOylation,N泛素化,争夺赖氨酸残基(135年- - - - - -139年]。铝也可以积极或消极的协同操作,作为在phosphorylation-dependent SUMOylations [140年- - - - - -142年)或在天车之间的串扰发生在赖氨酸或精氨酸残基,和附近的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化(143年]。
中发生的天车的氨基端域PPARs可以影响他们的ligand-independent和ligand-dependent调节基因表达(130年- - - - - -133年]。然而,尽管数据的影响存在于一些PPAR天车transactivation由配体结合的程度,所知甚少配体结合的程度会影响每个人的倾向PPARs向接受这样的多功能天车。从药物化学的角度来看,这个问题可能会特别感兴趣的天车发生在小黑裙),作为配体结合的影响的大小的构象种群的小黑裙,因此倾向的小黑裙进行一定的铝可以比遥远的地区,如n端结构域。另一方面,构象变化的小黑裙也可能导致改变interdomain联系人,反过来可以掩盖或公布遥远的多功能天车的网站。因此,转录的调制的结果由天车,发生在小黑裙可以是由微分coregulator招聘(116年,144年,145年)或通过改变interdomain联系人之间的PPAR的小黑裙,PPAR: RXR dbd [11,146年),或其N-termini。此外,这种变化在PPARs构象的数量可能会影响PPAR的启动子绑定:RXR-heterodimers [7,12,118年)或PPAR单体的transrepressive活动(28- - - - - -30.]。
大部分的知识PPAR天车源于PPAR的研究γ和PPARα,而铝发生在PPAR所知甚少β/δ(130年- - - - - -132年]。有趣的是,大量的共识天车网站的主要序列可以在所有三个PPARs使用天车共识网站映射算法如GPS-PAIL [147年)(N乙酰化作用),PhosphoNET [148年],PhosphoMotif仪[149年),或NetPhos [150年,151年)(O磷酸化)(图3)。同时,实验天车数据库数据,如PhosphoSitePlus [152年),包含几天车的记录(不限于磷酸化),其中一些发生在PPAR的小黑裙。其中,一些ligand-sensitive天车发生在PPAR的小黑裙已确定和研究实验,如PPAR的磷酸化γSer273, PPAR的乙酰化作用γLys268 / Lys293, PPAR的磷酸化αSer179 / Ser230(图3和部分5。1,5。2,6分别)。数据从研究获得这些多功能天车的指导下,他们的治疗相关性和配体的作用方式,影响他们的出现将在以下部分中讨论。
5。PPAR的新方向γ药理学的指导下配体绑定和铝之间的关系
中PPAR的有利影响γ由经典受体激动剂激活,如噻唑烷二酮类)用于治疗2型糖尿病(T2DM)病人和其他精神障碍与肥胖有关,两个重要的轴已经认识到:首先,改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量,其次,增加能量消耗在白色脂肪组织153年,154年]。虽然历史上的结构和机械基地为每个这些影响一直不清楚,上面介绍的多功能天车的发现和研究我们对各自的起源的理解有了很大的提高。
5.1。转译后的磷酸化的Ser273 PPAR (245)γ的小黑裙
识别后的2010年,一个共识网站供细胞周期蛋白依赖性激酶磷酸化5 (PPAR Cdk5)γ确实,蔡等人证明Cdk5磷酸化Ser273这天车在肥胖与胰岛素抵抗相关的老鼠和人类(116年]。作者也可以表明,肿瘤坏死因子(TNFα)诱导磷酸化,表明这天车与炎症状态之间的联系的肥胖老鼠。使用nonphosphorylatable Ser273Ala突变,蔡等人进一步证明Ser273磷酸化与减少的表达PPAR的子集γ目标基因,包括脂肪酶等和胰岛素敏感性有关的基因和脂联素116年]。这个发现的重要性被两个并发放大发现:首先,配体结合磷酸化在减少Ser273其次,配体的能力抑制Ser273磷酸化没有与诱导脂肪形成的能力或PPAR转录γ报告基因分析(116年,122年]。这些结果也符合观察其他工人之前,曾开发了PPARγ配体,可怜的PPAR转录的诱导物γ记者构造,但显示的孤立的啮齿动物细胞和insulin-sensitizing活动在活的有机体内(155年- - - - - -161年]。
蔡等人后来证明PPAR的选择性相互作用γ磷酸化在Ser273 (pSer273-PPARγ)coregulator蛋白质甲状腺激素receptor-associated 3 (Thrap3)构成致糖尿病的基因失调[162年]。相比之下,脱去磷酸PPARγ似乎与共激活剂SRC3 [116年,144年]。同一组进一步表明,在缺乏Cdk5,细胞外signal-regulated激酶(ERK)可以直接使磷酸化Ser273 PPARγ而这磷酸化也同样被PPARγ配体。在这项工作,银行等人还透露Thr296 PPAR Cdk5磷酸化的小说网站γ(图3)[163年]。
综上所述,上述研究结果充分表明,PPAR的抗糖尿病的作用的一个重要组成部分γ配体不像经典受体激动剂与他们的力量,而是Ser273磷酸化的抑制(116年]。的背景下,潜在的威胁生命的副作用观察PPAR的临床使用γ经典受体激动剂如glitazones [42- - - - - -46相比),强烈稳定H12 [114年,115年),这些发现为PPAR推出了一个新时代γ靶向药物治疗学治疗代谢疾病,重点已经转向有效的Ser273磷酸化抑制剂的发展,显示很少或没有古典激动[123年,127年,164年- - - - - -166年]。
上述发现被李et al。结果称赞,他证明了与PPAR Cdk5之间的交互γ增强了PPAR的互动γ与辅阻遏物蛋白质NCoR [144年]。这种效应也观察到adipocyte-specific NCoR基因敲除小鼠,它们显示pSer273-PPAR水平下降γ(144年]。在一起,这些发现表明,PPAR的抑制γ与NCoR可能的抗糖尿病的模式的一个必要方面PPAR的行动γ配体(参阅部分5。2)。有趣的是,郭等人最近证明了最优PPAR的镇压γPPAR的,但不是α和PPARβ/δNCoR和SMRT利用辅阻遏物复杂组件的G蛋白通路抑制因子2 (GPS-2) [167年]。
5.2。PPAR转译后的赖氨酸残基的乙酰化作用γ的小黑裙
PPAR之间的相互作用γ与NCoR也被研究的另一个核心ligand-sensitive天车,即Lys268的乙酰化作用(Lys238 mPPARγ1)(145年,168年]和Lys293 [145年),位于H2 -β1循环,接近Ser273,Ω分别为循环(图3)。羌族等人证明了这两个赖氨酸残基的乙酰化作用促进了PPARγ绑定NCoR,这种相互作用的存在进一步加强HAT-containing共激活剂蛋白质CBP (145年]。使用Lys-Gln突变体来模拟赖氨酸乙酰化作用,作者还发现Lys293的乙酰化作用,但这不是Lys268与Ser273磷酸化(145年]。这些结果因此平行前面演示的李等人增强互动的Cdk5 NCoR-bound PPARγ(144年]。
有趣的是,PPAR的治疗γ与罗格列酮抑制Ser273磷酸化,也会导致脱乙酰作用Lys268和Lys293(在其他赖氨酸(168年烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的+-)依赖脱乙酰酶Sirtuin蛋白1 (SirT1) (145年,169年,170年]。PPAR的SirT1-mediated脱乙酰作用γ第一次被汉人所示et al .,也证明了PPAR谁γ过度或troglitazone(图S1)治疗可能下调SirT1通过抑制PPAR的绑定γ/ SirT1复杂SIRT1启动子(171年]。尽管如此,羌族等人进一步证明SirT1-mediated脱乙酰作用Lys293特别是提升PPAR之间的交互γ与coregulator公关领域锌指蛋白16 (Prdm16) [145年),进而调节产热的,褐色脂肪组织——(蝙蝠)相关基因在白色脂肪组织(窟)[145年,172年,173年]。之间的联系的进一步支持Ser273磷酸化的抑制和脱乙酰作用Lys293,王等人最近表明,治疗3 t3-l1-derived脂肪细胞与Cdk-inhibitor roscovitine(图S1)促进了PPAR的离解γ从其与NCoR SirT1 Prdm16,以及随后BAT-related基因的表达,如解偶联蛋白1 (Ucp1)[174年]。类似的结果与nonphosphorylatable PPARγSer273Ala突变(174年]。相比之下,羌族等人观察到,虽然Ser273Ala突变和nonacetylatable Lys268Arg / Lys293Arg双突变体可以在瑞士3 t3细胞分化诱导脂联素,只有Lys268Arg / Lys293Arg双突变体的upregulation引起的Ucp1相对于野生型PPARγ(145年]。事实上,PPAR之间的相互作用γ乙酰化和磷酸化状态Ser273似乎复杂;市长等人发现,短期高脂肪饮食(HFD)导致PPAR增加γ乙酰化作用和Ser273磷酸化adipocyte-specific SirT1基因敲除小鼠(ATKO)。然而,尽管长期HFD(15周)导致PPAR的进一步增加γ乙酰化作用,它是伴随着减少Ser273磷酸化。一致,ATKO老鼠显示相应增加一套insulin-sensitizing基因的表达,从而更好的保护防止- HFD代谢的影响,相对于野生型小鼠(175年]。
如前所述,PPAR的治疗γ与罗格列酮结合AF-2口袋和Ω口袋里,导致脱乙酰作用Lys268和Lys293145年,169年,170年]。然而,尽管Lys268的距离和Lys293的配体结合Ω口袋里,Ohno等人证明了几个部分和nonagonistic PPARγ绑定到的配体Ω口袋,抑制Ser273磷酸化(116年),几乎没有影响的upregulation棕色脂肪细胞的标记Ucp1在老鼠身上,而罗格列酮(173年]。相比之下,部分激动剂替米沙坦(图S1)[176年,177年),也可以抑制Ser273磷酸化(178年),已被证明适度上调Ucp1(179年,180年]。此外,尽管它在PPAR绑定模式γ枸杞多糖是未知的,部分激动剂天然产品formonetin(图S1)[181年]显示相同的能力182年]。总之,这些结果表明,PPAR结构机制γ配体可以影响的乙酰化状态Lys268 / Lys293和upregulation BAT-related基因在窟,需要进一步研究[183年,184年]。
5.3。交互模式的影响和绑定PPAR的化学计量学γ枸杞多糖Ser273磷酸化和Transactivation
鉴于各种经典受体激动剂、部分和PPAR nonagonistsγ都是有效的,例如,胰岛素增敏剂,观察到毒性经典受体激动剂在临床使用强调需要检查这些配体类的交互PPARγ枸杞多糖,为了建立交互模式可能会有利于理想的效果,如Ser273磷酸化的抑制。在这种背景下,从技术,如x射线晶体学数据和HDX-MS证明PPAR之间的主题γ配体能够抑制Ser273磷酸化是绑定的Ω口袋里,在那里他们与互动β片区域,H2 ,的Ω循环,或H3 (101年,114年,185年]。通过分析绑定模式的2-aminopyridine罗格列酮(图的尾巴S1)Ω口袋里,和随后的配体设计,Bae等人表明,与地区之间交互H3,残留312 - 313(284 - 285),以及β3 -β4循环,残留368 - 370(340 - 342),是有利于Ser273磷酸化的抑制101年]。值得注意的是,该地区部分与探针重叠集群P4和P3,确定在一种溶剂中PPAR的映射γ枸杞多糖由许凤et al .,变化的研究也揭示了一些其他可能的配体相互作用的网站Ω口袋里(186年]。一致,不同的配体的合成起源显示上述通用交互模式和抑制Ser273磷酸化,如MRL24 [116年],BVT.13 [116年],nTZDpa [116年],mbx - 102 [116年],GQ-16 [115年],F12016 [187年),和伊马替尼112年)(图S1)。此外,不同人种的一系列天然产物(188年PPAR)绑定γΩ口袋,其中一些已经被证明是抑制Ser273磷酸化,例如,ionomycin [189年],pseudoginsenoside F11 [190年],amorfrutin 1 [191年,白屈菜赤碱(192年)(图S1)。
PPAR的配体的设计γΩ口袋是复杂的PPAR的潜力等γ枸杞多糖同时港口多个配体。因此,尽管PPAR绑定一个配体γΩ口袋里观察结晶学已经在早期的PPAR研究[193年),多个配体已经被观察到占领的枸杞多糖与配体复合物:受体的化学计量学2:1 (10,66年,80年,194年- - - - - -198年),3:1 (66年,199年]。此外,商等人最近发现从PPAR电子密度数据γcocrystals先前认为的化学复合物,对应于共晶壬酸配体(200年]。这样的乘客脂肪酸,可能来自于细菌的PPAR蛋白质表达,也被观察到具有PPARβ/δcocrystals [201年,202年]。
随着代谢传感器,PPARs适度强烈激活中链脂肪酸(MCFAs) [199年,203年),长链单链不饱和脂肪和多不饱和脂肪酸(MUFAs /欧米)和他们的一些代谢产物(65年,204年- - - - - -209年),以及含氧的- nitro-fatty酸(76年- - - - - -78年,80年- - - - - -82年]。后两个配体基团共价结合的成员中央半胱氨酸残基,Cys313 PPAR的(285)γ枸杞多糖。在PPARγ报告基因化验,程度transactivation MCFAs和MUFAs峰值在某些链长度(199年,203年,可能反映了配体:受体结合几何图形和-stoichiometries给定的脂肪酸。此外,同时绑定15-oxoeicosatetraenoic酸(15-oxoETE,图S2)和5 -羟色胺代谢物5-methoxyindole醋酸(MIA,图S2在水晶阶段)已经被观察到。值得注意的是,最大的转录活动引起15-oxoETE(10的组合μ和米娅(100米)μPPAR M)γ报告基因分析是罗格列酮(1引起的大约两倍μ米),而15-oxoETE或米娅,在同一浓度,只有诱导大约一半的活动罗格列酮(66年]。
PPAR的并行,而治疗γ与壬酸或二十二碳六烯酸(DHA)(图S1)抑制Ser273磷酸化199年)、治疗与油酸和棕榈酸(图的混合物S1)[116年),仅与棕榈酸(210年)和二十碳五烯酸(EPA,图S1)[211年),似乎促进这种多功能天车。有趣的是,在后者中,DHA诱导脂联素在100的高表达μ比200μ米(211年]。
考虑到配体配体的合成起源、BVT.13 [159年,212年)(图S2)是PPAR观察到绑定γ1:1化学计量学在水晶阶段,主要与H3互动而不是H12 [12,114年,159年]。虽然HDX-MS实验并没有表明BVT.13治疗稳定H12 apo-PPAR相比显著γ(114年),转录响应BVT.13罗格列酮的60 - 80%,PPARγ报告基因分析(114年,159年]。BVT.13也是一个Ser273磷酸化抑制剂(116年]。相比之下,10μ的配体GW0072(图S2),这似乎也只绑定到Ω口袋里,显示最高20%的转录激活引起的罗格列酮(1μPPAR M, 100%)γ报告基因分析。虽然数据的能力GW0072抑制磷酸化的Ser273不可用,GW0072 PPAR离解NCoR引起的γ(193年]。然而,值得注意的是GW0072 (10μ米)没有诱导的表达脂肪酶和脂肪酸结合蛋白4 (FABP4 / aP2)在10 t1/2细胞6天后,而罗格列酮(1μM)强烈调节后6天(193年]。
负面的例子协同绑定的多个配体合成的起源也被报道。配体T2384(图S2)在coregulator招聘化验显示两相的响应曲线,降低招聘的共激活剂MED1 (DRIP205)和增加招聘的辅阻遏物NCoR更高浓度(197年]。也观察到类似的两相的coregulator招聘模式的部分激动剂替米沙坦(176年]。
PPAR的多个结扎的现象γΩ口袋高配体浓度由绑定一个平行的配体在多种构象,观察到的情况,例如,SR1664(图S1)[97年,101年]。在水晶阶段,SR1664首次显示绑定在一个构造类似于经典受体激动剂,在其相互作用Phe310(282)似乎防止功能作为受体激动剂(97年,98年]。Bae等人后来也证明SR1664结合Ω口袋里(图2(d)),这种绑定模式可能更重要的Ser273磷酸化的抑制(101年]。
总的来说,这些结果描述一个复杂的绑定多个相同或不同的配体分子是可能的,可能导致或正面或负面协同transactivation。上面描述的集体努力也说明,虽然抑制Ser273 PPAR的磷酸化可能需要与区域的互动γΩ设计的口袋,一个共识药效团nonagonistic Ser273磷酸化抑制剂尚未牢固确立。
5.4。pSer273抑制剂的临床应用
有趣的是,代谢性疾病并不是唯一的条件,有可能被部分或矫正nonagonistic PPARγ配体。在微阵列分析调控基因的小鼠,nonphosphorylatable Ser273Ala PPARγ突变,蔡等人透露,两个基因参与髓鞘形成,成神经细胞differentiation-associated蛋白质AHNAK (Ahnak/ desmoyokin) (213年)和髓磷脂含蛋白脂质蛋白(Plp1)(214年),也积极监管(116年]。PPARγ被发现在高浓度多发性硬化(MS)患者的脑脊液(215年),建议在神经保护中发挥作用和remyelination216年,217年]。尽管集群包含Ahnak和Plp1被PPAR没有强烈的调节γ配体和Ser273Ala突变(116年),这些研究结果表明,PPAR的抑制剂γSer273磷酸化也可能是有用的治疗炎症相关的神经退行性疾病。
这种双重治疗潜力是PPAR的例证γ部分激动剂chs - 131(从前INT131, T0903131、T131 AMG131,人物S2)[156年,218年,219年]。而chs - 131(1 - 10毫克/天)在临床试验中显示的有前景的结果面向代谢疾病的治疗NCT00952445(220年),NCT00631007(221年]),后来被用于治疗复发缓和(名RRMS)[女士222年]。IIb阶段在2016年,在完成6个试验首次治疗名RRMS患者,Coherus生物科学公司报道,CHS131减少累积充当(CE)和T2病灶,以及皮质体积损失在治疗组(NCT02638038)[223年,224年]。在前者,metabolism-oriented试验,存在剂量依赖的相关性,但不太严重的副作用观察(220年),比较CHS131 PPARγ经典受体激动剂吡格列酮(图S2血液稀释和水肿等)参数。没有观察到骨脱钙与chs - 131,虽然研究没有动力统计评估这种影响与吡格列酮(221年]。在名RRMS试验中,没有严重的副作用被注意到在使用有效剂量(3毫克/天)223年,224年]。罗格列酮的基因表达数据的背景与弱的部分激动剂MRL24,报道了崔et al。116年),这些临床观察也可以解释为支持PPAR的认为观察到的副作用γ经典受体激动剂来源于他们引起更广泛的基因集。
在本文的上下文中,明显的临床疗效和安全性chs - 131是特别感兴趣的,因为作为PPARγ配体,chs - 131可能部分经典受体激动剂根据其特征观察各种PPAR的转录激活γ报告基因化验(15 - 40%的罗格列酮的影响)(218年,219年,156年]。这可能表明,更完全nonagonistic配体可能显示更好的安全配置文件。事实上,两个研究报告,结构修改chs - 131能大大降低配体生产过程transactivation能力,在不牺牲PPAR的亲和力γ(218年,225年]。
最后,根据最近的一项研究表明,一个未来的PPAR无毒抑制剂的临床应用γSer273磷酸化可能还包括使用佐剂化疗,pSer273-PPAR水平上升的情况下γ通过细胞毒性药物,造成DNA损伤,导致减少对化疗的敏感性(226年]。
6。在PPAR天车和配体之间的关系绑定α
可用的数据PPAR天车之间的关系αC端域(D-F)和配体结合是有限的,但包括两个报告描述了蛋白激酶C (PKC)调解的PPAR的磷酸化α配体结合的倾向及其影响给予要么transactivation(目标基因的转录PPRE-mediated)或transrepression [227年,228年]。由于早期结果链接PPAR的表达α的PKC在鼠肝229年),Blanquart等人证明了PPAR的磷酸化α在Ser179和/或Ser230 PKC增加基底和ligand-induced目标基因的转录等肉碱palmitoyltransferase 1 (CPT1)和PPARA在人类肝癌细胞系(227年]。相反,药物抑制PKC或使用nonphosphorylatable Ser179Ala / Ser230Ala双突变体,减少了PPAR的能力α经典受体激动剂如WY14643 (pirinixic酸)和GW7647(图S3)诱导这些目标基因的表达,增加基底和ligand-induced PPARα纤维蛋白原的基础表达β链的介导transrepression (FGB) (230年,231年)在HepG2细胞(227年]。同样的,可折较链等人也可以证明PPAR的PKC抑制或使用α双突变减脂多糖(LPS)诱导表达促炎核因子NF-kappa-B (NFκB)目标基因诱导一氧化氮合酶在小鼠巨噬细胞(间接宾语)。的transrepression LPS-induced伊诺PPAR的表达式也观察到在治疗α受体激动剂GW9578(图S3)和3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme(β)还原酶抑制剂辛伐他汀(图S3)。作者进一步证明而transrepression伊诺表达式是PPAR依赖α对于这两种配体,预处理小鼠巨噬细胞和中性粒细胞与辛伐他汀LPS-induced也干扰能力,免疫沉淀反应PKCα使一个通用的目标如组蛋白磷酸化H1的在体外分析(228年]。尽管如此,结合较强的观察在上游抑制PPAR transrepressive效果α磷酸化用PKC抑制剂,transrepressive PPAR的影响α治疗WY14643、GW7647或GW9578, DMSO控制相比,可能表明配体结合本身,至少在一定程度上,降低了PPAR的倾向α磷酸化的PKC。
从结构上看,PPARαSer179位于铰链区,靠近PPARαdbd, Ser230位于H2 -β1循环,相似的目标在PPAR Ser273 Cdk5磷酸化γ(图3)。因此,上述结果可以表明,H2 -β1循环是一个地区的一般利益ligand-sensitive天车的PPAR的小黑裙。
有趣的是,在以后,罗伊的独立研究et al .,这是证实,辛伐他汀也是PPARα配体( )(232年]。在这项研究中,作者还进行了分子对接的辛伐他汀δ内酯的PPARα枸杞多糖,发现它绑定到Ω口袋里,与Leu331和Tyr334互动β3所示。随后,这些残留的定点诱变(Leu331Met Tyr334Asp) PPAR和评价α报告基因分析显示,辛伐他汀无法激活转录通过Leu331Met / Tyr334Asp突变。值得注意的是,类似的结果mevastatin及其6-hydroxylated ring-opened普(图模拟S3)[232年]。但是,他汀类药物的倾向δ内酯转换为3,5-dihydroxy酸(图S3)通过水解或代谢233年- - - - - -236年)提出了一个问题:是否PPAR的观察效果α他汀类药物治疗源于绑定的完好无损δ5-dihydroxy酸内酯,3日,或两者兼而有之。
不过,罗伊等人表明,与辛伐他汀治疗小鼠星形胶质细胞导致upregulation生成3 (NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)是依赖于营地反应元件结合蛋白(分子)的表达式是反过来由PPAR监管α(232年]。由PPAR的转录调节分子α似乎发挥核心作用海马神经元可塑性和小鼠的空间记忆的巩固237年]。这些结果表明PPAR潜力α靶向配体,调节分子的表达治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默病(238年,239年]。
总之,需要更多的研究来阐明是否两个在PPAR PKC磷酸化网站讨论α参与观察到的效应,在多大程度上他们的磷酸化是敏感配体绑定和绑定模式这样的配体是什么。然而,总的来说,这些结果说明,改进我们对配体之间的相互作用的理解绑定模式,天车,结合生理效应可能是仪器利用PPAR的治疗潜力α配体的转录资料不一定分享经典受体激动剂。
6.1。PPARα配体与选择绑定模式
据报道,到目前为止,很少有配体显示替代PPAR绑定模式α枸杞多糖。在水晶阶段,伯纳德等人观察到,虽然一个分子的构象类似于其他PPAR WY14643绑定α经典受体激动剂,第二个分子绑定到下一个小说网站Ω循环(图4)。这个绑定模式强烈稳定Ω循环,观察到在水晶阶段和MD模拟(119年]。特别感兴趣的背景下研究可能的PPAR PKC-mediated磷酸化αSer230上面所描述的那样,MD模拟还表明,绑定第二分子WY14643稳定了Ser230-containing H2 -β1循环(图3)[119年]。
最后,在开发的Ωpocket-binding PPARγ配体BVT.13 [159年,212年)中所描述的部分5。3三个额外的配体,BVT.762 BVT.763,化合物5 d(图S3),也显示绑定PPARα( ,20μM, 19μ分别为M)和PPAR诱导转录α报告基因分析与 ,3.8μ2.5米,μ米,分别212年]。尽管没有数据可用PPAR在绑定模式α枸杞多糖对PPAR或其影响α天车,PPAR BVT.13的绑定γΩ口袋里表明,这些配体结构可能感兴趣的PPAR在配体的发展αΩ口袋里。
7所示。PPARβ/δ天车和配体模绑定模式
我们所知,只记录实验确定日期PTM-like PPAR的修改β/δ小黑裙是包含在一个策划PhosphoSitePlus数据库中的条目。这个条目表示免疫组织化学和质量spectrometrical PPAR的检测β/δ显然在Thr252磷酸化、Thr253 Thr256 H3的核糖体蛋白S6激酶alpha 3 (RPS6KA3),也称为p90核糖体S6激酶2 (RSK2) [240年]。因此,不存在任何进一步的细节在这些多功能天车的函数或配体的敏感性。结构、部分埋本地化的Thr252 Thr253, Thr256的确提出了一个问题:他们是否合理的多功能天车的网站。不过值得注意的是,RSK2报道与人类的雌激素受体的重叠区域α(她α残留326 - 394,包括H1, H1-H3循环,H3, H4, H5) [241年]。
7.1。PPARβ/δ配体与选择绑定模式
在研究PPARβ/δ配体,显示绑定模式以外的古典受体激动剂也被描述。希勒等人报道的一系列有说服力地绑定部分受体激动剂,其中一些是转录的有趣的是可怜的诱导物。和复合化合物34岁的化合物13日14(图S4)取代放射性配体 ,分别3海里,10纳米。在一个细胞报告基因分析、复合34和复合13显示一个 和一个 ,最大激活,分别为29%和37%。化合物14的转录激活观察,另一方面,低于报告基因分析的灵敏度阈值(~ 20%)。相比之下,经典的兴奋剂GW501516(图S4)显示一个 和一个 (98%最大激活)在同一化验。PPAR的晶体结构β/δ在复杂的与原来的大规模筛选(高温超导),GW9371(图S4, ,61%最大激活),周围的配体结合H3, tetrahydroisoquinoline一部分突出到AF-2口袋(242年]。相反的极性相互作用共同羧酸头GW0742等经典受体激动剂(图组S1),远芳基环GW9371似乎显示主要是疏水相互作用与周围残留,其中Tyr437 H12(数字5(一个)和5 (b))。化合物13和复合14是结构性的类似物的GW9371氢的5-position tetrahydroisoquinoline环(图5 (b)蒂尔球)取代了甲酸或2-oxyacetic酸,分别(见图S4)。,就像作者说的,取代基的引入这些可能影响造成的膜透性配体(242年),也有可能减少争胜活动相比,复合13和14 GW9371欠的庞大AF-2 pocket-binding半个,这可能会导致他们显示H12-mediated对立(见部分3)。
(一)
(b)
(c)
凯尔等人描述一系列的配体,与H12互动的程度要小于上述GW系列,绑定在一个u型构象Cys249(例如,化合物6,图5 (c)和图S4)。广泛的结构活性关系的所有三个PPARs作者建立的,在这个背景下相关配体化合物11 j(图S4),它显示一个 有22%的PPAR的激活β/δ报告基因分析(100%被GW501516设置为最大可激活)。重要的是,化合物11 j也显示PPAR的高选择性β/δ在其他PPARs243年]。
全基因组分析的PPAR的转录调控β/δ在myofibroblasts对待经典受体激动剂如GW501516或l - 165041(图S4),或PPARD核,Adhikary等人证明了不同的转录模式PPAR之间的反应β/δ目标基因,包括个人的配体可诱导性(244年]。如果应用于模等配体化合物14(上图)或化合物11 j,分析同样可以显示不同的监管模式治疗的相关性。总之,化合物14和化合物11 j代表价值的药理工具比较薄弱的部分的转录作用受体激动剂和那些积极稳定PPAR的经典受体激动剂β/δH12。
8。药理工具和最新进展PPAR在配体的发展Ω口袋
8.1。PPARγ
已经观察到,虽然PPAR的治疗γ与配体结合的共价中央半胱氨酸残基,Cys313(285),如GW9662 [71年]或T0070709 [83年)(图S2),限制了访问AF-2口袋(即。,antagonizes the action of classical agonists), it does not inhibit the subsequent binding of an additional ligand in theΩ口袋里(68年,101年]。这一现象与众多以前的观测PPAR的容量γ枸杞多糖同时容纳多个配体,在部分讨论5。3。因此,药理和生理(重新)的解释治疗PPAR的影响γ与这类拮抗剂应该反映干扰从配体结合的可能性Ω口袋里的共价修饰受体(68年]。认为这种干扰可能是药物相关的观察证实,在相似的协同激活观察同时绑定多个MCFAs [199年,203年),第二个配体PPAR的绑定γ对待GW9662 PPAR产生更强的反应γ报告基因分析,观察到单独的配体(246年]。经典的PPARγ受体激动剂MRL20(图S2)也得到了证实保留其激活PPAR的能力γ治疗后与GW9662或T0070907通过绑定Ω口袋里的姿势是明显不同的68年从未经处理的PPAR的结晶学观察的姿势γ(PDB ID: 2 q59) (114年]。因此,解决“单面”对抗GW9662和T0070907 Brust等人最近设计类似这些配体,与笨重团体到突出Ω口袋里,阻塞MRL20的绑定67年]。
另一方面,持续的配体结合的能力Ω口袋里的PPARγ对待GW9662或T0070907也开放的可能性使用共价改性蛋白质作为筛选新模型Ω口袋绑定。事实上,Ohtera等人开发了一种方法来筛选天然产物提取库的能力测试分数PPAR合作激活转录γ报告基因分析,在与GW9662 cotreatment [246年]。这使得作者识别methoxyphenylcinnamic酯配体,并进一步结合其结构与GW9662生产混合部分激动剂,化合物5(图S2),绑定共价Cys313(285)和可能占领了Ω口袋(由分子造型)246年]。化合物5抑制PPAR的能力γSer273磷酸化并没有调查。在以后的研究中,英国宇航系统公司等人准备一系列的类似物显示通过x射线结晶学的GW9662共价结合Cys313(285),以及占领Ω口袋里(101年]。这些配体的设计将一个芳基H3之间在特定地区的一部分,β3,β4(见部分5。3)。最有前途的配体,SB1405 SB1453(图S2),被证明是有效的抑制剂Ser273磷酸化和实践缺乏古典激动[101年]。这些结果表明,共价PPARγ部分激动剂,l - 764406(图S2),报道Elbrecht等人(1999年84年),也可能是抑制Ser273磷酸化的能力。在他们的研究中,英国宇航系统公司等人也准备了N甲基GW9662模拟,SB1404(图S2)[101年),鉴于其边际占领Ω口袋里的上下文中可能有趣的筛查活动类似于上述Ohtera等人[246年]。在激酶抑制剂的设计247年,248年Serafimova等人,和米勒等人利用的可逆性4-addition硫醇盐的高度激活的亲电试剂,如丙烯腈(249年]。使用此策略,金等人最近准备和调整一系列可逆共价和PPAR的选择性抑制剂γSer273磷酸化(250年]。在最近的一份报告中,张成泽et al ., PPAR的晶体结构γ在复杂的最有前途的配体,SB1495(图S2),主要证明SB1495绑定Ω口袋里,稳定了β片区域,H2 ,和Ω循环(251年]。鉴于其共价,可逆的行动模式,配体如SB1495可能因此为更多临床有效,然而PPAR的无毒抑制剂γSer273磷酸化。
8.2。PPARα和PPARβ/δ
GW9662,目标Cys313 PPAR (285)γ,据报道也共价修改PPARα和PPARβ/δ(71年]。在PPARα无功,Cys275似乎比其邻国Cys276 [76年],它对应于Cys313 PPAR (285)γ。的侧链Cys275还指出更直接Ω比Cys276口袋。不管他们的位置,这两个半胱氨酸残基可以积极利用PPAR亲电子配体的设计αΩ口袋里。
PPAR领域的β/δ,另一方面,一些成员5-trifluoromethyl-2-sulfonylpyridine类的共价拮抗剂,如GSK3787 [72年],CC618 [73年),和复合3774年)(图S4)已报告。虽然这些配体不同PPAR的选择性β/δ与其他PPAR亚型和反应速率与Cys249 [74年),PPAR的治疗β/δ与这两种配体导致的形成Cys249 5-trifluoromethyl-2-pyridyl硫醚(75年]。虽然芳基一半追加到PPARβ/δCys249比半个附加到PPAR体积更小γCys313通过治疗GW9662、T0070907或SB1404,仍然抑制活化的PPAR这个修改β/δ的经典受体激动剂头组绑定到AF-2口袋里,比如GW501516或GW0742(图S4)[72年- - - - - -74年,252年]。治疗PPARβ/δCC618或GSK3787独自在记者没有诱导转录基因化验(72年,252年]也没有治疗GSK3787引起共激活剂的招聘MED1 (TRAP220) TR-FRET-based试验(252年]。在一个类似的试验,治疗GSK3787然而导致温和,但统计上显著的离解的辅阻遏物NCoR SMRT apo-PPAR相比β/δ(252年]。是否PPARβ/δ共价改性在Cys249仍有能力绑定其他的配体Ω口袋里还有待调查。更重要的是,这种类型的多个结扎的转录效应也是未知的。因此,识别的配体结合PPARβ/δΩ口袋里,其他筛选方法比Ohtera et al。246年)在前一节中描述可能需要考虑。
为此,PPAR的最近的研究γ有强调,19F NMR代表了一个强大的技术来研究氟有机配体的结合,AF-2口袋和Ω口袋里(68年,107年]。克里斯曼等人也证明了几类的绑定的影响nonfluorinated配体的PPAR的构象变化γ可能具有19F NMR,共价修饰后mutagenetically引入半胱氨酸残基与三氟丙酮H3和H12探测器(87年]。因此,在筛查中配体结合Ω口袋里的PPARβ/δ共价修饰配体的5-trifluoromethyl-2-sulfonylpyridine类,处理的相对距离Cys249 5-trifluoromethyl-2-pyridylthioether的配体结合Ω口袋里表明19F NMR-based分析可能是可行的。
9。结论
在此,我们描述了从近年来发现和集体努力,促进了更清楚的认识到PPAR的药理学γ——理解PPAR已经有重要的影响γ针对进一步治疗和药物开发。这些成就都发生在一个框架,集成了配体结合的研究,天车,蛋白质-蛋白质之间的关系,结合对转录的影响。总的来说,获得的结果在这个框架表示兴趣转移,远离古典PPARγ受体激动剂诱导supraphysiological unselective转录激活水平,nonagonistic——和其他不在经典里的配体的发展,更多的选择性影响基因表达模式调制天车的发生。许多这些新的配体中的共同主题是PPAR的绑定γΩ口袋里。我们有冒险证明这些新兴的应用原则PPAR的研究α和PPARβ/δ可能提供新见解,例如,通过识别ligand-sensitive天车和其对基因表达的影响的研究模式,但也通过应用已知的配体选择绑定模式的分析上下文。这样的努力所产生的数据将为新一代的发展奠定基础的药物针对PPARα和PPARβ/δ。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
我们想感谢当前和过去的同事合作富有成果和实验和方法论的工作。挪威研究理事会是慷慨资助电视感激地承认通过KOSK H (197708), KOSK II (207053), BIOTEK2021(224811),和FRIPRO-FRINATEK (230470)。
补充材料
配体的化学结构中描述PPAR的上下文γ,PPARα,PPARβ/δ中描述他们的顺序出现在数字S1-S4补充材料。(补充材料)