文摘

糖尿病是一种multiorgan障碍影响了许多类型的结缔组织,包括骨头和软骨。高葡萄糖可以加快自噬在髓核细胞(NP)。在我们目前的研究中,我们调查是否过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPAR -γ在NP)途径涉及到自噬调控细胞在高葡萄糖条件下。后NP细胞治疗与不同的高葡萄糖浓度为72小时,自噬的速度增加。此外,PPAR的水平γ、Beclin-1 LC3II明显增加,p62比对照组明显降低。然后,与高葡萄糖+ PPAR NP细胞治疗γ受体激动剂或PPARγ分别拮抗剂。自噬和Beclin-1和LC3II水平增加,但当PPAR p62下降γ使用了兴奋剂。相反,自噬和Beclin-1和LC3II水平下降,而当PPAR p62增加γ对手是补充道。这些结果表明,自噬诱导通过PPAR高葡萄糖在NP细胞γ端依赖途径。

1。介绍

下腰痛是非常普遍,占生活质量低,和人们普遍认为背部疼痛与腰椎椎间盘变性(LDD)之间的关系。虽然协会仍然是有争议的强度(1,2),椎间盘的恶化(试管)最终可能导致退行性疾病症状的发展如椎间盘突出,脊椎狭窄和退行性脊椎前移。

许多证据表明,糖尿病(DM) LDD的病因学是很重要的。据报道,有一个更高的退行性椎间盘疾病发病率比non-DM人群DM患者[3)和DM患者与non-DM患者手术预后较差(4]。

减少数量的可行的髓核(NP)细胞在糖尿病被认为是椎间盘变性最初的诱因之一。在体外研究中,高葡萄糖证明加速自噬(5,细胞凋亡6),和衰老7在成年鼠NP细胞剂量和时间的方式。细胞凋亡与衰老的试管会导致可行的细胞的减少。自噬的作用相对比较复杂。最初,自噬可以促进细胞存活和避免细胞凋亡在应激反应,在细胞内的细胞器和分子通过溶酶体途径。然而,当自噬是长期、蛋白质和细胞器基本体内平衡和细胞生存必不可少的退化,从而导致细胞死亡。但在NP细胞自噬的机理高葡萄糖仍不清楚。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)是一种调节配体依赖性转录因子的基因在细胞分化和各种代谢过程至关重要。PPARs家族在哺乳动物中包括三个亚型:PPARα,PPARβ/δ,PPARγ(8]。激活PPARα引起脂质代谢和能量调节体内平衡,而PPAR的激活β/δ增强脂肪酸的新陈代谢。另一方面,PPAR的激活γ导致胰岛素抵抗的改善,其次是葡萄糖代谢。

PPARγ在白色和褐色脂肪组织表达,大肠、脾。大量的证据牵连到PPARγ在多种疾病中起着重要的作用,包括肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化(9- - - - - -11]。但到目前为止,PPARγ从未被报道在NP细胞和椎间盘变性在以前的文献。

给PPAR的角色γ在葡萄糖代谢和高葡萄糖在椎间盘变性的作用,我们认为高葡萄糖条件通过PPAR诱发自噬γ在我们目前的研究端依赖途径。

2。方法

2.1。细胞的准备

椎间盘(给)从forty-four-year-old女性患者接受transforaminal椎体间融合术手术,因为腰椎间盘突出症。据Pfirrmann椎间盘变性是三级分类。阀瓣是仔细解剖显微镜下获得只有NP在无菌条件下组织。然后,收获NP组织被尽可能小(< 1 mm3)与0.25% II型胶原酶消化4 h,和70微米的过滤一场空。洗后用磷酸盐(PBS)两次,NP细胞在培养瓶培养与DMEM低糖培养基补充10%胎牛血清(的边后卫)和1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL) 37°C调湿大气二氧化碳(95%,5%)。媒介改变了两三天后。当细胞达到80% -90%融合,他们(通道1)分裂一次,增加到80% - -90%再次融合。3通道后的细胞用于后续实验。

2.2。细胞培养

3通道后的细胞在DMEM培养包含5.6毫米(正常控制)、葡萄糖0.1或0.2米,补充10%胎牛血清,1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL)和二氧化碳维持在5% poly-L-lysine涂覆盘子。药物干预glucose-induced细胞的变化,细胞葡萄糖培养基转向0.2米和0.2米葡萄糖培养基与25嗯/ L T0070907或罗格列酮(Selleck化工、中国上海),分别。

2.3。免疫印迹

NP细胞蛋白质收获量化利用里帕(Beyotime、上海、中国)phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)为1%。蛋白质浓度化验由BCA试剂盒(美国马,生物技术)。蛋白质样本12%聚丙烯酰胺凝胶电泳在sds - page和转移到一个聚乙二烯二氟化物膜(millipor)。屁股被封锁在室温下1 h和脱脂奶粉5% TBST缓冲区。之后,膜主要抗体孵育LC3II /我(CST, 1: 1000);Beclin1 (CST, 1: 1000);PPARγ(Proteinteck,1: 500);p62 (CST, 1: 10000);一夜之间和GAPDH (Abcam 1: 10000)在4°C和HRP-conjugated二级抗体(CST, 1: 2000)在室温下。乐队是可视化使用ECL衬底(ThermoFisher)和分析ImageJ软件。蛋白表达是规范化控制GAPDH水平。

2.4。实时聚合酶链反应

与PBS洗后,用试剂盒从NP细胞总RNA提取试剂(美国加州英杰公司)按照制造商的协议,其吸光度260/280 nm检测评估RNA质量。1.8 - -2.0的吸光度被认为是好的。互补脱氧核糖核酸合成使用上标™RT试剂盒和gDNA橡皮擦(豆类、志贺、日本)从1 ug RNA。PCR扩增,10 ul的反应体积包括5 ul 2电力SYBR绿色PCR反应混合液(ABI,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),每个引物0.25 ul, 1 ug cDNA, 3.5 ul无菌蒸馏水。收集周期阈值(Ct)值和规范化管家GAPDH基因。2方法被用来计算每个目标基因的相对mRNA水平。PPAR的引物γ5′-TACTGTCGGTTTCAGAAATGCC-3′(向前)和5′-GTCAGCGGACTCTGGATTCAG-3′(向后)。

2.5。荧光显微镜

NP细胞培养和成长24-well板80%的融合。适量的病毒流体包含打包pL-CMV-TO-GFP-HLC3B(由自己)添加到培养基中。NP细胞孵化6 h在37°C。包含病毒的媒介取代DMEM补充10%胎牛血清(penicillin-streptomycin的边后卫)和1% (Gibco BRL)和NP细胞培养另一个30 h 37°C。然后,这些转染NP细胞作为细胞培养的部分中描述。最后,在NP细胞自噬被荧光显微镜观察和评估。自吞噬率的计算是通过自我吞噬细胞的数量超过总数的10倍的镜头。

2.6。统计数据

所有实验至少重复三次。数据意味着±SD(标准差)。SPSS 21.0是用于所有数据的统计分析。比较的数据都使用了单向方差分析测试。被认为具有统计显著性差异 。

3所示。结果

3.1。高Glucose-Induced在NP细胞自噬

NP细胞被分成三个组作为对照组,0.1米高葡萄糖组和0.2米高葡萄糖组根据血糖浓度(5.6毫米、0.1米和0.2米)。评价高葡萄糖的作用在NP细胞自噬,我们不仅下使用GFP-LC3B显示自噬细胞示踪技术检查和比较LC3, Beclin-1, p62表达NP细胞在所有三组的免疫印迹。Beclin-1和microtubule-associated蛋白1轻链3 (LC3)所需的自噬小体的形成和成熟,自噬的重要步骤之一。p62蛋白质称为autophagy-specific衬底可以退化LC3-II一起。受损的自噬是伴随着p62积累。当自噬发生GFP-LC3B会形成斑点。点越多,越自噬。通过使用GFP-LC3B示踪技术,NP细胞自噬 %, %, %在对照组,0.1葡萄糖组,分别为葡萄糖和0.2(图1)。自噬增加的速率随着葡萄糖浓度的增加。和免疫印迹分析显示增加表达式Beclin-1 LC3-II和减少表达式中p62 NP细胞治疗高葡萄糖浓度与对照组相比(图2)。LC3-II / LC3-I表达增加的比率在高葡萄糖条件下。此外,它也表明,Beclin-1的表达,LC3-II, p62几乎改变了葡萄糖浓度的方式。

3.2。PPARγ在NP细胞和调节表达高葡萄糖

尽管PPARγ在很多组织已经确认被表达,它从未被研究过在NP细胞。为了评估是否NP细胞也表达了PPARγ和PPAR高葡萄糖的作用γ表情,实时聚合酶链反应和免疫印迹。通过聚合酶链反应和免疫印迹检测,PPAR的存在γ发现在NP细胞RNA和蛋白质含量。与对照组相比,它表明,PPAR的表达γ增加了NP细胞治疗高葡萄糖和PPAR的增加γ内容几乎平行的葡萄糖浓度(图的标高3)。

3.3。PPARγ在NP细胞活化诱导自噬

考虑到高葡萄糖不仅诱导自噬调节PPAR的表达γ在NP细胞,PPAR应该由我们γ应该有一个与NP细胞自噬在高葡萄糖。为了更好地理解这种关系,PPARγ受体激动剂和拮抗剂被添加到0.2米高葡萄糖培养基。然后LC3、Beclin-1 p62表达式的NP细胞被免疫印迹检测和比较。免疫印迹分析显示增加表达式Beclin-1 LC3-II和减少的表达中p62 NP细胞PPAR对待γ受体激动剂相比,0.2米高葡萄糖条件(图4)。相反,Beclin-1 LC3-II下降和表达式的表达中p62增加NP细胞PPAR处理时γ拮抗剂(图5)。

同样,NP细胞自噬也利用GFP-LC3B追踪技术,当受体激动剂或拮抗剂添加(图6)。这表明,自噬在NP细胞增加,自我吞噬的速度 %受体激动剂时补充道。虽然自吞噬的速度下降 %拮抗剂时补充道,几乎是一样的,在对照组(图7)。

4所示。讨论

葡萄糖是一种重要的几乎所有的生物燃料。它曾经被认为导致电子传递链和氧化磷酸化的说明和完整的有氧葡萄糖代谢ATP生成一组常见的代谢途径。但是现在,众所周知,葡萄糖不仅可以在多个代谢途径提供能源供应,而且还参与许多重要的代谢产物,如细胞生长和功能。近年来,证明高葡萄糖调节自噬在许多细胞,如足细胞、肾小管上皮细胞,NP细胞(5,12,13]。

与以前的结果是一致的,我们的研究结果强调高葡萄糖可以显著提高在NP细胞自噬。我们发现Beclin-1 mRNA和蛋白水平和LC3B高葡萄糖治疗后增加。Beclin-1和LC3B所需的自噬小体的形成和成熟,这是最重要的步骤之一,自噬。我们还发现,p62蛋白质减少在高葡萄糖。p62 autophagy-specific衬底,可以退化LC3-II一起。p62表明自噬受损的积累。这些发现表明,自噬在NP细胞激活高葡萄糖治疗和自噬流量是有效的。GFP-LC3B示踪技术也提供了类似的结果。自噬发生时,GFP-LC3B形成斑点在细胞质中。越点代表了更高层次的自噬。 Our results showed that NP cells under 0.1 M and 0.2 M glucose resulted in more green spots than control, which revealed that glucose can certainly activate the autophagy in NP cells. However, the pathway of autophagy in NP cells under the high glucose condition is unclear.

PPARγ核激素受体,由一个agonist-dependent激活域、DNA结合域,agonist-independent激活域。这是葡萄糖代谢途径之一涉及到能源体内平衡的控制,炎症,增殖,分化14]。据报道,PPARγ表达不仅在脂肪组织(15,16),而且在乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺(17]。然而,是否PPARγ表达在人类NP和它如何影响NP细胞尚不清楚。

在这里,这是第一次人类NP细胞识别,给出了PPAR的表情γ通过实时聚合酶链反应和免疫印迹。此外,PPAR的表达γ被发现调节在高葡萄糖治疗和PPAR的增加γ几乎是成正比的葡萄糖浓度。有趣的是,PPAR的变化模式γ在NP细胞在我们的研究中随雪旺细胞报道金正日et al。18]。在他的研究结果显示,慢性高葡萄糖条件保留正常PPAR在雪旺细胞水平。金和美国之间的差异可能是由于不同的细胞类型,葡萄糖浓度,和时间的治疗。

没有最终结论PPAR是否γ可以激活或灭活自噬(19]。在我们目前的研究中,PPARγ还发现有一个高葡萄糖条件下与NP细胞自噬和PPAR的增加γ内容与自噬的程度有关。但无论PPAR的增加γ上游或伴随自噬现象的高葡萄糖需要进一步研究。为了更好地理解PPAR之间的关系γ和NP细胞自噬在高葡萄糖条件下,PPARγ受体激动剂和拮抗剂加入DMEM 0.2葡萄糖。我们的研究结果显示,PPARγ受体激动剂增加了NP细胞自噬和拮抗剂(T0070907)相反。根据这些发现,我们认定PPARγ是自噬的上游和PPAR吗γ激活可能会进一步诱发自噬在NP细胞在高葡萄糖条件下。

总之,高葡萄糖治疗可能上调PPARγ在NP细胞,进一步激活自噬。还需要进一步的观察来发现PPAR的特定的信号分子γ与自噬诱导高葡萄糖NP。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

长江三峡和刘Shuhao同样co-first作家这个工作。