文摘

PPARγ是一个关键的调节葡萄糖的体内平衡和胰岛素敏感。PPARγ必须二聚化与其二聚的伙伴,视黄素X受体(RXR),结合DNA和相关辅活化因子如p160家庭成员或PGC-1吗α调节基因的网络。了解认可辅活化因子功能异质二聚体PPARγ/ RXRα并确定的拓扑组织复合物,我们进行了结构研究使用PPAR的小角x射线散射γ/ RXRα在复杂的调控基因的DNA和TIF2受体相互作用域(去掉)。解决方案结构揭示出一个不对称的整体结构由于DNA的重要角色定位的异质二聚体和显示不对称绑定TIF2异质二聚体。

1。介绍

PPARγ核受体家族的成员,脂肪细胞分化的关键调节器和参与葡萄糖体内平衡和胰岛素敏感(了1,2])。PPARγ一起CCAAT / enhancer-binding蛋白质已被确认为驱动脂肪细胞分化的关键转录因子(了3])。PPARγ绝对是需要白色和棕色脂肪细胞的发展。几个PPARγcoregulators也被证明能影响这个分化(综述[积极的还是消极的4])。

PPARγ通过绑定激活不同的配体包括天然脂肪酸衍生品和非甾体类药物和治疗的目标积极抗糖尿病药如罗格列酮(综述(5])。此外,cdk-5 PPAR的磷酸化γ参与新陈代谢的基因导致管制的(6]。

PPAR的行为γ是由2亚型可变剪接的结果。PPARγ2是28个氨基酸氨基端一端(图1(一)),主要是脂肪细胞表达细胞,而PPARγ1是广泛表达。有趣的是,PPARγ2是活跃在十倍比PPAR ligand-independent转录激活γ1 (7,8]。

PPARγ其他核受体是一个模块化的蛋白质与DNA结合域(DBD)和一个配体结合域(精神的小黑裙)。它是活跃的异质二聚体视黄素X核受体(RXR)。PPAR / RXR异质二聚体识别特定DNA序列称为PPAR响应元素(PPRE),由不完善直接重复隔开一个核苷酸(根据DR1)和一个扩展的5′half-site hexanucleotide [8]。根据DR1的不对称和5′侧翼序列有助于PPAR的选择性绑定。PPAR结合5′hexanucleotide和5′侧翼地区,而RXR结合3′half-site。充分活跃,PPARg2 / RXR必须与辅活化因子包括p300 / CBP p160成员,PGC-1α,以及Med1(了9,10])。这些辅活化因子本身就是高度管制在转录和转录后的水平。

从结构上看,我们的大多数当前的知识分子的作用机制的基础关系,是基于孤立的DNA和配体的x光和核磁共振结构绑定域名。各种NR的小黑裙的晶体结构和共激活剂肽显示守恒的绑定模式辅活化因子的关系。受体激动剂配体引发构象变化的NR的小黑裙允许富亮氨酸互动主题(LXXLL主题)共激活剂中形成一个序列α螺旋交互通过电荷夹和疏水相互作用在小黑裙表面(11- - - - - -13]。辅活化因子如p160或PGC-1α包含几个LXXLL图案(NR框)参与特定的绑定关系,和其他转录因子。TIF2 (NCoA2 p160成员)3 NR盒子中发现中央域与NRs和称为受体相互作用域(去掉)(图1(一))。第三个主题是优先结合PPARγ(14]。

广泛的研究已经完成在PPAR结构关系γ小黑裙单体或二聚体和提供了各种配体引起的构象变化的信息。长篇PPAR的结构γ/ RXR复合物也研究了x射线晶体学(15)和小角x射线散射(粉煤灰)[16,17),尽管n端结构域(元)是不可见的电子密度图。剩余问题的识别方式由PPAR共激活剂领域γ/ RXRα复合物。了解如何被PPAR TIF2掉γ/ RXRα的拓扑组织复杂,我们进行了结构分析在溶液中PPAR的一枝γ/ RXRα小黑裙与TIF2掉和PPAR复合物γ2 / RXRα全身或耗尽的n端结构域(ΔNTD)绑定到PPRE TIF2去除蛋白质。

2。材料和方法

2.1。克隆、蛋白质表达、纯化

的HsPPARγ小黑裙(203 - 477),HsPPARγΔNTD(135 - 505)和HsTIF-2(632 - 772)被表示为hexahistidine融合蛋白。HsRXRα小黑裙(223 - 462)和HsRXRαΔNTD(130 - 462),被克隆到pACYC nontagged质粒编码蛋白质。核受体是coexpressed形成大肠杆菌BL21 (DE3)细胞。全身HsPPARγ2(1 - 505)和HsRXRα(1 - 462)在Sf9昆虫细胞coexpressed N-ter hexahistidine国旗标签融合蛋白,分别。PPAR / RXR二聚体和共激活剂TIF-2摆脱被亲和色谱法和凝胶过滤净化描述(16,18]。配体(CD3254PPAR RXR和罗格列酮)中添加2倍过度饱和的受体。DNA (GAAACTAGGGTAAAGGTCAG / CTTTGATCCCATTTCCAGTC)增加了1.2倍过量的二聚体,和复杂的是gel-filtrated Superdex售价(16/60或10/300,通用电气医疗集团)。PPAR / RXR / TIF2复合物,TIF2添加多余的2倍和gel-filtrated Superdex售价(16/60或10/300,通用电气医疗集团)。蛋白质样本集中使用Amicon超离心过滤单元(微孔)。蛋白质的纯度和均匀性进行评估,sds - PAGE和复杂的形成是由本地监控页面。最后缓冲PPAR / RXR小黑裙是三羟甲基氨基甲烷20毫米液pH值7.5,氯化钠200毫米,德勤5毫米和PPARγ/ RXRα/ DNA复合物三羟甲基氨基甲烷20毫米液pH值7.5,氯化钠75毫米,75毫米氯化钾,MgSO₄4毫米,甘油5%,和皮套裤2毫米。

2.2。超速离心法均衡沉降

沉降平衡实验,样品将在12000 rpm和系统首次允许平衡前12小时吸光度资料比较在不同的时间以确保系统达到了平衡。利用非线性最小二乘分析,这些数据集是安装使用单一的组件模型和几个均衡模型Sedphat程序。

2.3。电喷雾电离质谱分析。

电喷雾质谱在分析,样本脱盐Zeba旋转脱盐列上(皮尔斯)150毫米醋酸铵(pH值8.0)。谱测量进行了电喷雾飞行时间质谱计(MicrOTOF,力量Daltonic,德国)。纯度和均匀性的蛋白质质谱验证了在变性条件(在2 pmol /样本稀释μL在1:1 water-acetonitrile混合物(v / v)与1%甲酸酸化)。质量测量的非共价复合物进行醋酸铵(200毫米;pH值8.0)。样本稀释8 pmol /毫升在前面的缓冲区,不断注入到ESI离子源3毫升/分钟的流量通过哈佛注射泵(哈佛装置模型11)。认真执行接口的优化参数获得最佳灵敏度和光谱质量而不影响非共价复合物的稳定性。特别是,毛细管出口(CE)从60到150 V与真空界面压力的2.3 mbar和设置为80 V。

2.4。粉煤灰的实验和数据处理。

同步加速器x光解决方案散射数据收集在X33 beamline(谜底,汉堡)19使用皮拉图斯山)探测器的sample-detector距离2.7米,覆盖范围的动量转移Å⁻¹(,在那里散射角和吗纳米是x射线波长)在8帧(每15秒),以检查可能的辐射损伤。所有散射测量进行了10°C与自动填充,和样本测量在几个浓度。

一枝实验也进行了在SWING beamline苏蕾同步加速器(温度、法国),使用一个厘米²低噪声Aviex CCD探测器定位在距离2.107米的样品。示例解决方案在一个恒温石英毛细管的直径1.5毫米和10在真空室壁厚,定位。50帧的每个收集2 s,平均透射强度归一化,随后使用图像分析软件狐步舞(SWING beamline苏蕾同步加速器)。

粉煤灰的平均数据和处理标准程序使用博智[20.]。向前散射和回转半径评估使用纪尼埃近似假设在很小的角度()强度表示为。这些参数也被计算从整个使用间接变换包GNOM散射模式(21),还提供了粒子的最大尺寸分布函数和距离。低分辨率的形状分析溶质进行使用从头开始程序DAMMIF [22]。原子的散射模型计算使用程序CRYSOL [23)的预测理论散射模式或符合实验数据通过调整排除体积和水化层的对比。程序SASREF [24)是用于分子PPAR的刚体模型γΔNTD / RXRαΔNTD / DNA复杂,基于PPAR的晶体结构γ/ RXR (PDB ID: 3 dzy)。对于这两个从头开始和刚体分析,多个运行进行验证解决方案的稳定性,和最典型的重建是选择使用程序DAMAVER [25]和SUPCOMB [26]。

3所示。结果与讨论

3.1。描述的PPARγ/ RXRα复合物

PPARγ/ RXRα小黑裙或完整的蛋白质在两个步骤copurified描述(16,18]。DNACyp4A1调节基因增加了1.2倍超额长篇异质二聚体和复杂的进一步纯化,分析凝胶过滤。为了研究绑定PPAR TIF2掉γ/ RXRα15 kDa TIF2碎片(632 - 772)包含三个LXXLL图案和相互作用关系(图1(一))添加到异质二聚体,并通过凝胶过滤进一步纯化。分析了复合物凝胶过滤后,通过sds - page和本地电泳证实复合物的形成和同质性(见补充图1网上http://dx.doi.org/10.1155/2012/701412)。的化学计量学TIF2 / PPAR清除掉γ/ RXRα复合物决心使用分析超速离心法(AUC)和电喷雾电离质谱(质)方法,研究已证明其效率的共价复合物(27,28]。质PPAR nodenaturing条件下进行了实验γ/ RXRα小黑裙在TIF2掉的存在。(图获得的分子质量1 (b))符合一个复杂的由一个TIF2掉每异质二聚体分子。质量峰对应于自由PPAR的存在γ/ RXRα小黑裙是由于复杂的部分离解ESI离子源。均衡沉降AUC实验也进行了描述协会的PPAR TIF2掉γΔNTD / RXRαΔNTD / DNA在解决方案以及其分子质量(图1 (c))。Mw 114 kDa的分子质量优秀的协议114.3 kDa的期望值。两个测量表明,只有一个TIF2分子结合PPAR清除掉γ/ RXRα异质二聚体。

3.2。拓扑的PPARγ/ RXRα小黑裙和TIF2掉/ PPARγ/ RXRα小黑裙复合物

的化学计量学观察TIF2掉每异质二聚体与晶体结构的关系,必将LXXLL肽(11- - - - - -13],显示2肽受每个单体的二聚体。这就提出了一个问题:PPAR TIF2掉的绑定模式γ/ RXRα不对称地一个单体或涉及两个NR框的两个亚基。为了解决这个问题我们用一枝,结构性方法来描述多畴的蛋白质和复合物。我们分析了粉煤灰的招聘由PPAR TIF2掉γ/ RXRα小黑裙。

作为参考,散射PPAR的概要文件γ/ RXRα小黑裙单独收集(图2(一个))。单分散的PPAR集中解决方案γ/ RXRα小黑裙)测量,结构参数包括回转半径()和最大的粒子尺寸从实验计算从异质二聚体散射模式(表吗1)。一个对称pair-distribution函数观察(图2 (b))表明球状复杂。实验一枝散射是安装的数据资料计算从晶体结构(PDB ID: 3 h0a)使用CRYSOL [23与粉煤灰)和在协议参数测量异质二聚体的小黑裙(17,18]。

接下来我们分析了TIF2 / PPAR清除掉γ/ RXRα复杂的小黑裙。的值和从距离pair-distribution函数计算TIF2掉更大(表1)比典型值预期球状蛋白质表明TIF2扩展。TIF2掉折叠的迹象,我们使用Kratky交涉,强调从高偏差行为的散射强度。单独的Kratky阴谋TIF2掉(图2 (c))显示了一个不断增加曲线表明一个展开的蛋白质。TIF2掉/ PPARγ/ RXRα小黑裙复杂,它对应于一个部分折叠蛋白质的钟形曲线与折叠高分子,因此建议一个诱导分子的折叠在复杂的形成。绑定TIF2掉的异质二聚体导致的增加(由8的),(到65年)(表1)。大的差异和PPAR的相比γ/ RXRα小黑裙表明TIF2扩展和部分无序。这也观察到的非对称剖面pair-distribution函数与一个尾巴在高值(图2 (b)),对应于细长的分子与对称pair-distribution函数球状PPAR / RXR小黑裙。

珠模型分子的信封,来源于一枝数据,计算了PPARγ/ RXRα小黑裙和TIF2掉/ PPARγ/ RXRα小黑裙(图3)。它对应于一个对称的球状的小黑裙二聚体(图的形状3 (c))。相比之下,TIF2摆脱复杂,明显不对称比小黑裙二聚体是观察(图3 (d))。在类比TIF2掉和SRC-1掉复合物RAR / RXR和RAR为(16,29日),我们可以推测分子信封的球状区域对应于小黑裙)二聚体和非对称扩展TIF2掉尾巴。大不同的结构参数TIF2摆脱复杂的小黑裙相比二聚体和复杂的分子信封表明TIF2掉是PPAR灵活高度不对称γ/ RXRα只有一个LXXLL图案。重要的是,数据排除模型中两个LXXLL图案PPAR的绑定到每个子单元γ/ RXR异质二聚体。初步一枝PPAR的研究γ/ RXRα绑定到PGC-1α与类似的消除提供了类似的结果和值表明在这两种情况下两种不同的体系结构复合物与辅酶a摆脱类似的不对称地绑定到PPAR通过LXXLL主题只有一个亚基。有趣的是,它已经表明,NR2 PGC-1的主题α就足以有完整的PPAR转录反应吗γ/ RXRα(14]。而对于TIF2,它已经表明,第三优先缠绕PPAR LXXLL图案(14)和LXXLL图案的组合需要一个完整的转录反应(30.]。然而一枝数据符合PPAR的晶体结构γ/ RXRα小黑裙(PDB ID: 3 h0a),揭示了一个共激活剂PPAR肽结合紧密γ和一个共激活剂RXR肽松散α穷人的电子密度和高B因子肽绑定到RXR(平均B因子肽绑定到RXR 116.2相比平均绑定到PPAR的辅酶a肽B因素γ31.6)。这些观察表明,PPAR TIF2掉绑定不对称γ在通过一个LXXLL异质二聚体亚基。

3.3。解决方案的结构PPARγ2 / RXRα/ Cyp4A1根据DR1复合物

PPARγ/ RXRα没有DNA已被证明是细长的,没有interdomain互动(17]。在复杂和理想化的DNA,第一个原子分辨率积分PPAR的结构γ/ RXRα通过x射线晶体学(15)确认有关孤立结构信息域(11,31日,32),还显示一个interdomain PPAR的小黑裙之间的联系γ的DBD RXR [13),虽然功能相关限制在一个单一的点突变。展开,n端结构域是不可见的电子密度图。我们以前测量了一枝PPAR的概要文件γ2 / RXRα绑定到一个理想化的根据DR1 [16),表明,在溶液中构象不同观察晶体结构的异质二聚体展示一段不对称形状没有额外interdomain dbd和之间的联系通过铰链连接区域以外的小黑裙。我们现在PPAR的解决方案的结构特点γ2 / RXRα全长或截断被忽略和绑定到一个自然PPRECYP4A1。实验的结构参数计算散射模式(数据4(一)和4 (b)表中给出)1揭示了一个扩展的形状复杂。与完整的PPAR长度γ复杂,结构参数更大(Å和Å),表明不同的分离被忽视的热带病。低分辨率模型重建从头开始从相应的散射实验模式。最典型的从头开始PPAR模型γ2Δntd / RXRαΔNTD /CYP4A1PPRE呈现在图4 (c)清楚地显示单独的DBD和LDB的域类似复杂的结构观察和理想化的根据DR1观察其他NR形成。对于PPARγ2Δntd / RXRαΔNTD / PPRE,其原子结构精制对粉煤灰水实验数据(图4(一))。域的位置是由刚体模型调整使用可用的高分辨率的晶体结构复杂(PDB ID: 3 dzy)。刚体模型得到的细化同意的从头开始模型,从叠加图4 (c)。精致的结构揭示了非对称形状的小黑裙二聚体位于5′末端的DNA(图4 (d)),一个不对称已经观察到其他形成了一枝[16]。

长篇PPAR的散射模式γ2 / RXRα在复杂/ PPRE TIF2掉也监控。的增加和(表1)TIF2掉交互的长篇异质二聚体类似于观察到的复杂的小黑裙的二聚体,建议用类似的方式绑定的小黑裙二聚体,没有额外的交互TIF2掉的长篇复杂。解决方案研究的DNA复合物与整体受体也提供证据1共激活剂/受体二聚体的化学计量学。每一个异质二聚体只绑定一个共激活剂通过PPAR蛋白质,这优惠绑定被关联控制,而不是空间排斥。然而,其他领域TIF2可能会涉及额外的相互作用的受体TIF2桥已被证明的氨基端和c端受体域雌激素受体(33]。

4所示。结论

的解决方案结构功能异质二聚体PPARγ2 / RXRα绑定到自然根据DR1调控基因和TIF2掉揭示非对称的不对称诱导DNA目标的NR二聚体的位置的小黑裙在目标的5′末端DNA和TIF2的不对称的招聘模式。积分PPAR的扩展在溶液中构象γ/ RXRα绑定到DNA是承认和维护期间共激活剂绑定。TIF2掉,这本质上是无序的,部分折叠PPAR绑定γ但保留一段构象复杂。功能性DNA是强加的不对称绑定结果导向与复杂的代数余子式的共激活剂的一侧DNA,允许与其他调控蛋白的交互,从而导致特定和控制NR-mediated基因转录。以外的其他领域TIF2掉可能与异质二聚体,应该进行进一步的研究来描述如此大的复合体的拓扑。在分子水平上更好地理解PPAR的规定γ/ RXRα的辅活化因子将有利于治疗代谢疾病的治疗的新方法。

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

作者感谢卡罗尔Peluso-Iltis技术援助,伊莎贝尔Kolb-Cheynel (IGBMC杆状病毒设备)产品在昆虫细胞中,凯瑟琳Birck (IGBMC结构生物学和基因组平台)帮忙分析超速离心法实验,艾德琳页面(IGBMC蛋白质组学平台)的质谱分析,和阿拉斯泰尔McEwen批判阅读的论文。他们感谢皮埃尔Roblin和苏蕾的员工SWING beamline(温度、法国)寻求帮助。这项工作得到了全国中心任职(CNRS),国家卫生研究所et de la医学研究院(INSERM),法国的基础设施集成结构生物学(FRISBI),协会倒说是关于癌症(弧),联合倒拉医学研究院(农场),和IGBMC设施。

补充材料