文摘
阿霉素(阿霉素)可能导致充血性心力衰竭,这很大程度上限制了阿霉素的临床使用。小分子核糖核酸(microrna)密切参与DOX-induced心肌病的发病机制。这里,我们旨在调查mir - 152对DOX-induced小鼠的毒性。研究这个,我们使用了一个腺相关病毒载体过度表现mir - 152小鼠6周之前阿霉素治疗,使用剂量模拟中使用的浓度诊所。阿霉素注射,mir - 152显著减少小鼠心脏和心肌细胞。阿霉素治疗后,小鼠mir - 152超表达心中少开发心脏功能障碍,氧化应激,炎症和心肌细胞凋亡。此外,我们发现mir - 152超表达减弱DOX-related氧化应激,炎症、心肌细胞和细胞损失,而mir - 152降价导致氧化应激,炎症,在心肌细胞和细胞损失。从力学上看,这种效应mir - 152依赖于核转录因子的激活(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2)对阿霉素的反应。值得注意的是,Nrf2缺乏阻止mir - 152的保护作用与DOX-related心脏损伤的老鼠。总之,mir - 152防DOX-induced毒性通过Nrf2信号通路的激活。 These results suggest that miR-152 may be a promising therapeutic target for the treatment of DOX-induced cardiotoxicity.
1。介绍
阿霉素(阿霉素),quinone-containing蒽环霉素,是有效治疗严重的白血病和恶性淋巴瘤(1]。然而,心肌细胞损失和充血性心力衰竭,受损的临床使用阿霉素(2]。机制DOX-induced毒性是复杂的,但越来越多的证据表明,氧化应激和炎症密切相关(3,4]。
可用实验室证据表明,活性氧(ROS)和随后的脂质过氧化反应后三个小时内可以检测到人心阿霉素治疗(5- - - - - -8]。此外,核转录因子kappa-B (NF -κ早期观察阿霉素B)活化的小鼠的心(9]。活性氧的积累和炎症引起caspase-3激活,导致心肌细胞凋亡10]。因此,抑制这些改变会对DOX-related心脏毒性的治疗具有重要意义。
核转录因子(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2)编码多个抗氧化和解毒酶基因(11]。在生理条件下,Nrf2结合Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1)和Cul3泛素连接酶。刺激,Nrf2从Keap1释放出来,结合抗氧化反应元素,导致Nrf2-dependent抗氧化基因的转录11]。减少Nrf2表达观察DOX-treated心里,恢复Nrf2表达式通过药理代理人可以减弱DOX-induced小鼠的毒性(12]。因此,我们推测,激活Nrf2可能很大程度上拯救DOX-triggered毒性。
小分子核糖核酸(microrna)绑定到3 - - - - - -翻译区(3 - - - - - -UTR)有针对性的基因和导致降解的蛋白表达13]。microrna已报告规范Keap1-Nrf2通路的激活14,15]。mir - 200 a可以目标Keap1 mRNA和促进Keap1的退化,导致防止DOX-induced Nrf2激活小鼠的毒性(16]。mir - 152家族一直与免疫调节的过程,细胞生长和增殖17]。mir - 152超表达改善心肌细胞生存能力和防止低氧诱导细胞损伤体外(18]。此外,mir - 152 upregulation抑制血管紧张素II-induced心肌细胞凋亡(19]。之前的一项研究发现,mir - 152保护神经元损伤通过upregulation Nrf2信号通路通过针对突触后密度蛋白- 93 (20.]。这些观察提出了这样的可能性,mir - 152将防止DOX-triggered通过调节Nrf2毒性。在这项研究中,我们发现mir - 152目标Keap1激活Nrf2和保护老鼠从DOX-induced毒性。
2。材料和方法
2.1。抗体和试剂
抗体NF -κB (ab16502),核纤层蛋白B (ab16048), Nrf2 (ab62352),伯灵顿(ab32503) caspase3 (ab13847) cleaved-caspase3 (ab2302) Keap1 (ab119403)和GAPDH (ab181602)提供的Abcam(英国剑桥)。鼠标3-nitrotyrosine (3 nt)酶联免疫试剂盒(ab116691)和4-hydroxynonenal (4-HNE)蛋白加合物从Abcam工具包(ab238538)收购。阿霉素(# D1515)和2 ,7 - - - - - -dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)提供的σ。CardioTACS原位细胞凋亡检测设备是获得微孔(美国Billerica的)。S0131丙二醛(MDA)、谷胱甘肽测量包(S0053)和总超氧化物歧化酶活性(SOD, S0101)获得Beyotime生物技术研究所(上海,中国)。
2.2。动物和治疗
动物的协议,涉及使用制度动物研究委员会批准武汉大学人民医院。一个腺相关病毒(AAV9)系统携带mir - 152或9 miR-scramble cTnT下启动子是由Genecopia(上海,中国)。过度表现mir - 152在心中,老鼠(男,年龄:9 - 11周) 病毒基因组的aav9 - mir - 152或由一个尾静脉注入所述AAV9-miR-scramble [21,22]。这些老鼠注射一剂强力霉素(15毫克/公斤)在6周后AAV9感染。我们使用生理盐水(NS)解散阿霉素。动物观察阿霉素注射后5天;在那之后,动物被牺牲了。心脏Nrf2损耗是通过尾静脉注射AAV9携带Nrf2小发夹rna (shNrf2)或炒成分( 病毒基因组/鼠标)cTnT启动子(Genecopia)。
2.3。血液动力学
足够的和1.5%异氟烷麻醉后,心被切除和压力-容积导管(美国米勒仪器)是通过一个顶端刺插入心室测量心脏功能。血流动力学测量进行了分析使用一个IOX软件(EMKAtech)。
2.4。RNA提取和实时rt - pcr
从心脏总RNA提取样品或培养的心肌细胞。反转录反应进行使用PrimeScript RT试剂盒(# RR036B,豆类,大津,日本)。SYBR绿色PCR反应混合液(04887352001,罗氏公司)是用于检测PCR扩增产品。目标基因的mRNA水平正常化GAPDH。mir - 152的水平被发现使用一个一体化的™microrna qPCR工具包(Genecopia)。
2.5。免疫印迹分析
心样品或细胞溶解细菌培养心肌细胞里帕裂解缓冲。等量的蛋白质在10% sds - page凝胶分离,然后转移到PVDF膜(微孔、钙、美国)。膜是孵化与主抗体(稀释,1:1000)在一夜之间在4°C。之后,这些乐队孵化与适当的辣根peroxidase-conjugated二级抗体和可视化使用增强化学发光试剂(美国麦迪逊Promega)。信号被ImageJ量化软件(美国大力神Bio-Rad)。GAPDH是用作内部控制。CelLytic™核™提取工具包(NXTRACT-1KTσ)被用来提取核蛋白质在我们的研究中。
2.6。NF -κB和Nrf2激活试验
转录因子激活心里和细胞样本提取检测使用TransAM®NFκB活化分析工具和TransAM®Nrf2激活分析工具。这两个包是dna结合蛋白elisa简化转录因子激活的研究,从积极的主题。
2.7。生化检测
新鲜心脏样本或培养心肌细胞在冷盐水,均质和上层的分数是收集检测心肌肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、白细胞介素- 6 (il - 6)、il - 10和干扰素-γ(IFN -γ)。肿瘤坏死因子-α鼠标酶联免疫试剂盒(# BMS607-3)、il - 6鼠标酶联免疫试剂盒(# BMS603HS)和il - 10只老鼠即时ELISA™工具(# BMS614INST)被英杰公司提供。干扰素-γ(鼠标)酶联免疫试剂盒提供的Biovision(上海,中国),用于检测心肌干扰素-γ。评估氧化损伤,减少谷胱甘肽(GSH),和氧化谷胱甘肽(GSSG), MDA, 4-HNE, 3 nt是根据标准程序检测到。
反映心脏损伤后强力霉素治疗,乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和心肌肌钙蛋白I (cTnI)是根据标准程序检测到。LDH细胞毒性试验装备(C0016)获得Beyotime生物技术研究所和肌酸激酶测定设备(A032-1-1)是由南京建成生物工程研究所提供的(中国南京)。cTnI化验设备从生活中得到诊断,Inc .(西切斯特,PA)。
2.8。细胞凋亡检测
心石蜡切片是沾终端原位缺口末端标记(TUNEL)染色评估心肌细胞凋亡。我们还检测心肌细胞凋亡蛋白酶3活动使用半胱天冬酶3活动分析工具包(C1116 Beyotime)。
2.9。细胞和治疗
新生大鼠心肌细胞(医疗保险)是根据前一个孤立的方法(23,24]。这些细胞被分为四组:PBS + miR-scramble, PBS + mir - 152,阿霉素+ miR-scramble,阿霉素+ mir - 152组。心肌细胞是使用微米mir - 152 (50 nmol / l)或争夺控制48小时,然后孵化与阿霉素5μg / ml或同样体积的PBS 24 h。微米mir - 152和争夺控制生成Ribobio技术(广州)。在医疗保险击倒mir - 152,这些细胞受到mir - 152缓蚀剂(50 nmol / l, Ribobio技术)48小时。来验证假设,炎症反应是二级mir - 152抑制ROS生产后,医疗保险是用特异性的活性氧抑制剂预处理(N-acetyl-L-cysteine NAC 5更易/ l) 12小时。来验证假设,mir - 152通过激活Nrf2施加保护,细胞治疗siNrf2 (50 nmol / l) Nrf2敲下来。siNrf2由表达载体,炒siRNA被用作非特异性控制。细胞生存能力是由细胞计数分析(CCK-8;Dojindo分子技术,罗克维尔市,美国)根据制造商的指示。
2.10。细胞内ROS和过氧化物检测
分光光度法测定细胞内活性氧的水平使用DCFH-DA染色(25]。医疗保险与DCFH-DA反应(10μmol / l) 30分钟在37°C在黑暗中。然后,PBS的细胞被洗了三次,荧光强度是决定使用一个微型板块读者(美国VT Biotek仪器)。我们使用超氧化物阴离子分析工具包(# CS1000,σ)检测过氧化物水平根据标准程序。
2.11。线粒体呼吸复杂我活动和ATP水平检测
心肌线粒体呼吸复杂我发现心中MitoCheck复杂我活动分析工具。ATP浓度测定采用ATP测定工具包(Beyotime、上海)根据制造商的协议。
2.12。荧光素酶检测
Keap1 3 - - - - - -UTR记者质粒(包含mir - 152 -结合位点)被Genecopia生成,然后转染医疗保险。心肌细胞治疗与微米mir - 152 (50 nmol / l)或争夺控制48小时。后来,Keap1 3 - - - - - -通过Promega工具包UTR荧光素酶活性进行了测试。
2.13。统计分析
所有的数据显示为 。双尾未配对的 - - - - - -测试进行了检查两组之间的意义。使用单向方差分析比较多个组进行了事后Bonferroni事后分析数据满足方差齐性要求。统计学意义是接受的价值 。
3所示。结果
3.1。mir - 152水平下调DOX-Treated心里和心肌细胞
调查的参与mir - 152在DOX-related心脏损伤的发展,我们对其水平的心DOX-treated老鼠。心脏mir - 152含量显著减少剂量和时间礼貌阿霉素后曝光(数字1(一)和1 (b))。使用医疗保险,我们还发现,阿霉素治疗剂量和时间的表达减少mir - 152细胞(数字1 (c)和1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。过度的mir - 152减毒DOX-Induced心脏损伤,改善心脏功能
解决mir - 152的功能在DOX-related贲门损伤体内,老鼠 病毒基因组aav9 - mir - 152或通过尾静脉注射AAV9-miR-scramble过度表现mir - 152的心。所显示的图2(一个),心肌mir - 152表达的减少引起的阿霉素成功恢复了老鼠的心aav9 - mir - 152注入(图2(一个))。5天的阿霉素注射后,小鼠mir - 152表达表现出更高的身体重量和长度heart-to-tibal比率比老鼠AAV9-miR-scramble注入(数字2 (b)和2 (c))。此外,DOX-treated mir - 152中老鼠表现出缓解心脏损伤,可以在减少血浆CK, LDH,和cTnI(数据2 (d)- - - - - -2 (f))。阿霉素注射导致减少射血分数(EF)、最大心室压力对时间的一阶导数(+ dP / dt), dP / dt,心输出量。然而,这些病理改变后,减毒mir - 152超表达小鼠(数字2 (g)- - - - - -2 (j))。mir - 152也减少了τ的高程维斯在DOX-treated老鼠(图2 (k))。我们还发现心率和发现mir - 152不能影响降低心率在应对阿霉素(图2(左))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
3.3。mir - 152减毒DOX-Treated小鼠心肌炎症和氧化损伤
阿霉素,心肌TNF -α、il - 6和MCP-1 mRNA水平显著增加(数据3(一个)- - - - - -3 (c))。然而,这些病理海拔下降mir - 152注射后在小鼠(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。在数据显示3 (d)- - - - - -3 (f),mir - 152的超表达显著降低心肌细胞因子蛋白的水平,减少与TNF -中找到α,il - 6、il - 10和干扰素-γ(数据3 (d)- - - - - -3 (g))。接下来,我们发现的DNA结合NF -κB和发现mir - 152显著降低升高NF -κ(图B激活DOX-treated的心3 (h))。DOX-induced核易位NF -κ补充B也抑制了mir - 152(图3(我))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
接下来,我们发现在小鼠心肌氧化应激。MDA升高3 nt、4-HNE和响应阿霉素被mir - 152抑制小鼠(数字4(一)- - - - - -4 (c))。阿霉素注射GSSG谷胱甘肽的比例降低,总超氧化物歧化酶(SOD)活性和mir - 152 (downregulations被封锁的人物4 (d)和4 (e))。进一步检测表明,过氧化氢酶(CAT)的mRNA水平下降,SOD1, SOD2,血红素加氧酶1 (HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶1 (Gpx1)和NAD (P) H:醌氧化还原酶1 (NQO1)被mir - 152恢复DOX-treated老鼠(图4 (f))。减少Nrf2蛋白表达对阿霉素治疗也恢复了mir - 152(图4 (g))。mir - 152显著增加的减少Nrf2激活DOX-treated心(图4 (h))。我们下一个评估线粒体呼吸复杂我活动和ATP的水平。复杂我活动的线粒体ATP含量显著降低阿霉素小鼠相比,控制老鼠和显著增加了mir - 152(图S1A-B)。除此之外,mir - 152大幅下降的百分比TUNEL-positive DOX-treated心里核(图4(我))。西方的分析显示,mir - 152伯灵顿的蛋白表达和降低cleaved-caspase3 DOX-treated心里(数字4 (j)和4 (k))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
3.4。mir - 152减毒DOX-Related体外心肌细胞损伤
探索mir - 152体外的影响,我们用微米mir - 152感染的医疗保险或争夺控制。DOX-induced心肌细胞炎症积累和NF -κB激活mir - 152超表达组比对照组明显改善(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。mir - 152补充很大程度上减少ROS的产生,超氧化物和MDA DOX-treated细胞(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。减少心肌细胞的生存能力提高后mir - 152超表达(图5 (h))。相比之下,mir - 152年医疗保险导致炎症积累,抑制ROS和过氧化物生产,从而影响细胞的生存能力,即使没有任何刺激(数字5(我)- - - - - -5(米))。来验证假设的炎症反应是二级生产ROS mir - 152抑制后,使用了南汽。NAC预处理废除炎症和NF -的积累κB激活mir - 152抑制所致(数字5 (n)- - - - - -5 (p))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
(m)
(n)
(o)
(p)
3.5。mir - 152提供了通过激活Nrf2心脏保护
的数据在我们的研究中发现mir - 152可以目标3 - - - - - -UTR Keap1,减少Keap1信使rna在细胞mir - 152超表达(数字6(一)和6 (b))。值得注意的是,Keap1蛋白表达下调,Nrf2表达调节mir - 152 -过表达细胞(图6 (c))。我们还发现Nrf2的mRNA水平,发现mir - 152并不影响的mRNA水平Nrf2在心肌细胞(图6 (d))。此外,几个关键Nrf2-dependent基因的mRNA表达,包括HO1 NQO1, SOD1,和SOD2显著恢复mir - 152 - overexpressing细胞(图6 (e))。接下来,我们测试是否Nrf2激活是至关重要的对DOX-related mir - 152诱导心肌细胞保护心脏损伤。细胞治疗siNrf2实现Nrf2击倒,和Nrf2损耗被西方墨点法(图确认6 (f))。正如所料,mir - 152失去了对DOX-related保护心肌细胞损伤,所反映的TNF -α信使rna, NF -κ激活,ROS生产、MDA含量和细胞生存能力(数据6 (g)- - - - - -6 (k))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
进一步验证假设mir - 152对其保护通过激活Nrf2的老鼠,我们老鼠心肌Nrf2撞倒了,发现没有等离子cTnI差,EF、心脏肿瘤坏死因子-α水平、谷胱甘肽(GSSG和caspase3活动之间miR-scramble +阿霉素+ shNrf2和mir - 152 +阿霉素+ shNrf2组(数字7(一)- - - - - -7 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
mir - 152的表达和势函数DOX-related心脏损伤是未知的。张等人的研究表明,mir - 152密切参与的凋亡效应tanshinone花絮在心肌细胞(19]。mir - 152通过糖酵解促进了受损的新生儿心脏的再生(26]。然而,听起来相当不同声音的upregulation mir - 152表达心肌失败导致心力衰竭的病理生理学(27]。这里,第一次,我们证明了阿霉素mir - 152表达减少,补充和mir - 152导致心脏保护的DOX-induced在老鼠和心肌细胞毒性。更具体地说,我们的数据表明mir - 152有能力减弱心肌炎症和氧化损伤和心肌细胞凋亡,从而防止心脏功能障碍在老鼠身上。这些发现积极建议补充mir - 152可能是一个有用的方法来防止DOX-related心脏损伤。
DOX-induced心肌病发生主要通过心肌细胞中活性氧的生成(28]。这种机制分离DOX-induced心肌病从其抗肿瘤的活性。阿霉素可以与过氧化氢反应产生氢氧自由基,因此反应蛋白质和脂质,从而导致细胞损伤(29日]。在这里,我们还发现,阿霉素ROS增加,超氧化物和MDA生产和减少在老鼠和心肌细胞抗氧化活动。然而,这些病理改变主要是减毒,mir - 152治疗,这意味着保护mir - 152可能是部分由氧化损伤的改善。此外,NF -κ观察阿霉素B活化的小鼠的心脏,和阿霉素也可能诱发心肌炎症4,9]。一致,心脏NF -κB激活和mRNA水平的炎症因素被发现增加阿霉素治疗,但阻止mir - 152的补充,伴随着心脏功能障碍的改善。这些研究结果与先前的研究一致30.]。使用NAC,我们发现ROS损耗废除炎症和NF -的积累κB激活mir - 152抑制造成的,这表明炎症反应是二级ROS的产生mir - 152 -心肌细胞不足,这也符合最近的一项研究发现,炎症反应并不是主要的生物因素和次要ROS生产期间急性阿霉素损伤(31日]。DOX-induced活性氧的积累导致了细胞色素c的释放之后,caspase-3活化和细胞凋亡10]。在目前的研究中,我们观察到显著提升伯灵顿和cleaved-caspase 3表达阿霉素注射后与对照组相比。相反,我们发现mir - 152下降的百分比TUNEL-positive核和伯灵顿和cleaved-caspase 3表达的蛋白表达DOX-treated心。这些研究结果表明,改进后的心脏功能mir - 152补充部分是依赖心肌炎症的衰减,氧化损伤和细胞凋亡。
Nrf2密切参与DOX-related氧化损伤的发展和心肌细胞凋亡。降低DOX-induced Nrf2表达式和活动观察急性心肌损伤(22),和恢复Nrf2药理剂减毒DOX-induced毒性(12]。最近的研究表明,miRNA-induced Keap1的沉默是一项新策略来调节Nrf2激活。miR-7可能目标Keap1并激活Nrf2信号在人类神经祖细胞分化[32]。mir - 141激活Nrf2信号通过瞄准和沉默Keap1保护细胞免受ultraviolet-induced氧化应激(33]。据报道,mir - 152保护神经元损伤通过upregulation Nrf2信号通路通过针对突触后密度蛋白- 93 (20.]。这项研究的结果表明,mir - 152是一个直接和具体Keap1-targeting microrna的,可以调节Keap1-Nrf2级联的心。在心肌细胞中,迫使mir - 152超表达抑制Keap1 3 - - - - - -UTR记者荧光素酶活性和表达下调Keap1 mRNA和蛋白表达,从而导致Nrf2激活。来验证假设mir - 152通过激活Nrf2发挥心脏保护,我们耗尽Nrf2表达心中,发现mir - 152失去了心脏保护DOX-related心脏损伤Nrf2-deficient心里,表明mir - 152提供的保护依赖于Nrf2的激活。因此,mir - 152超表达提供了一个新策略来保护DOX-related心脏受伤的心。
在这项研究中,我们没有提高补充mir - 152是否会促进肿瘤的生长。我们也没有提升mir - 152是否补充妥协强力霉素治疗水平。这些都是我们研究的局限性。
总之,我们发现mir - 152是一种新型活化剂Nrf2 DOX-related心脏损伤的设置。心脏mir - 152沉默Keap1 Nrf2激活,导致的衰减心肌炎症,氧化应激和细胞凋亡。这个信号级联小说提供了一个潜在的治疗目标DOX-related心脏损伤的治疗。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这个项目是基础研究基金支持的中央大学(2042019 kf0059, 2042020 kf0046)。
补充材料
图S1改变线粒体呼吸复杂我活动和ATP的水平。(一)线粒体呼吸复杂我活动( )。(B) ATP水平( )。价值观代表了 。 与NS + miR-scramble,# 与阿霉素+ miR-scramble。(补充材料)