藏花酸发挥其抗炎财产LPS-Induced RAW264.7细胞可能通过调制MEK1 /物/ NF -之间的串扰κB /伊诺途径和Nrf2 / HO-1途径

文摘

藏花酸与类胡萝卜素骨架的主要生物活性成分栀子,一个典型的有着悠久历史的中国传统医学在东南亚。藏花酸是常见的食用香料,染料,食品着色剂。最近的药理研究暗示藏花酸可能具有强大的抗炎作用;然而,潜在的分子机制尚未完全阐明。在目前的研究中,监管藏花酸对氧化还原平衡系统的影响研究在脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞。结果表明,藏花酸剂量依赖性抑制LPS-induced一氧化氮产量和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)RAW264.7细胞中表达。分子数据显示,藏花酸发挥其抗炎性质通过抑制MEK1 /物/ NF -κB /伊诺通路和激活Nrf2 / HO-1通路。MEK1 shRNA-knockdown (KD)和ERK1证实MEK1的激活和抑制物介导藏花酸的抗炎效果。此外,下拉试验和计算分子对接表明藏花酸可以直接绑定到MEK1和JNK1/2。它是注意到KD和淘汰赛(KO)HO-1基因阻止这一行动。更详细的数据显示HO-1ko了导出的抑制κB -α藏花酸。这些数据表明,藏花酸发挥其抗炎性质通过调制之间的串扰MEK1 /物/ NF -κB /伊诺途径和Nrf2 / HO-1途径,强调HO-1作为主要的球员。因此,目前的研究显示,藏花酸可以作为一个潜在的候选人负责其抗炎和chemopreventive redox-balancing调制效应,增强其效力在随后的临床应用在不久的将来。

1。介绍

栀子被广泛种植在中国、日本、韩国、印度和北美(1]。作为一个传统的和至关重要的草药,栀子记录在中国药典,与多个清算热量和排毒功能,减少发热和头痛,导致利尿,冷却的血液,消除肿胀(2,3]。大量的药理研究发现栀子可以具有不同的药理活性在hepatochemoprevention [4,5),神经保护(6),抗炎监管(7,8),和抗血栓形成的心血管介入[1,9,10),此外,它也广泛应用作为一个优秀的天然着色剂。藏花酸,如主要的天然着色剂栀子,已被应用在许多领域,如棉花、纺织品、饮料和食品。藏花酸的有益特性和药理作用也被报道之前,包括chemopreventive影响肿瘤(11- - - - - -13,神经退化14- - - - - -16)、心血管疾病(17,18),肝损伤(19,20.)、糖尿病(21- - - - - -23),和结肠炎疾病(24]。分子机制研究表明,藏花酸的生物活性可能归因于其抗炎能力(14,25]。然而,抗炎能力的潜在的分子机制尚未完全阐明。

一氧化氮(NO),一个高度活性气体信号分子,参与多种生理和病理过程在许多器官系统包括神经、免疫、心血管(26,27]。生产的不正是由一氧化氮合酶(NOS)。号有三个同功酶:两个既定的表达形式,内皮NOS(以挪士)和神经元NOS (nNOS)和诱导形式(间接宾语)28]。值得注意的是,高层伊诺表达式与各种炎症和慢性疾病,如中风、脱髓鞘疾病,癌症,神经退行性疾病(28,29日]。因此,识别伊诺抑制剂被认为是一种很有前途的方法来防止急性和慢性炎症状态。

核因子红细胞2相关因子2 (Nrf2) /血红素加氧酶1 (HO-1)信号通路中起着至关重要的作用在保护细胞不受氧化应激刺激,它可以维持细胞内氧化还原内稳态通过调节自噬等各种途径,ferroptosis, pyroptosis,细胞凋亡30.]。最近的分子证据显示Nrf2 / HO-1信号通路发挥重要作用在生物活性化合物的抗炎特性(31日,过度的HO-1巨噬细胞可以显著抑制促炎细胞因子的生产LPS刺激和增加抗炎反应(32]。进一步在活的有机体内数据显示,IL-10-mediated保护LPS-induced脓毒性休克小鼠明显减毒通过cotreatment HO-1抑制剂,锌原卟啉(33),老鼠和人类缺乏HO-1表达的表型发展慢性炎症状态(34,35]。这些数据暗示存在一个关键的抗氧化和抗炎之间的联系,和激活Nrf2 / HO-1可能是强有力的和有前途的新的分子目标治疗炎症相关的疾病。此外,Nrf2 / HO-1通路之间的串扰和炎症通路进行一些研究,和HO-1候选人连接这些通路(36,37]。然而,这个相声不深入研究,缺乏深入的分子证据。

因此,在目前的研究中,分子机制的抗炎和抗氧化作用藏花酸完全调查shRNA-KD和CRISPR-Cas9-KO技术的应用在LPS-induced炎症RAW264.7细胞,尤其是藏花酸的作用在氧化还原平衡调制,Nrf2 / HO-1通路之间的串扰和炎症通路,和它的目标细胞外受体。

2。材料和方法

2.1。材料和细胞培养

藏花酸是由Tairui捐赠生物技术有限公司(河南南阳,中国)。藏花酸是由高效液相色谱纯化纯度为98%,它可以溶解在DMSO溶液(0.1%最终浓度培养基)。有限合伙人(大肠杆菌血清型055:B5)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。AZD6244、SB202190 SP600125, U0126来自MedChemExpress(美国新泽西州蒙茅斯结)。抗体伊诺,phospho-ERK1/2 phospho-p38激酶,phospho-JNK, ERK1/2 p38激酶,物,和我κB -α从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA)。GAPDH和p65来自圣克鲁斯生物技术,Inc .(圣克鲁斯、钙、美国)。抗体HO-1, Nrf2来自Abcam(美国Cambridge, MA);2 ,7 - - - - - -二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)从Beyotime生物技术研究所(Beyotime,广州,中国)。胎牛血清(的边后卫)从生物产业(基布兹拜特Haemek,以色列)。小鼠macrophage-like RAW264.7细胞从写明ATCC购买(罗克维尔市,医学博士,美国)和培养37°C的5%的股份有限公司₂气氛杜尔贝科修改鹰的媒介(DMEM)包含10%的边后卫。因为的边后卫包含许多化合物,如有限合伙人和生长因子,影响巨噬细胞的生物学特性(38- - - - - -41),在无血清条件下我们完成了所有的实验。

2.2。细胞生存能力分析

细胞MTT试验测定的可行性。短暂,RAW264.7细胞被播种在96孔板和治疗各种藏花酸浓度24 h。随后,上层是丢弃,50μl (MTT的解决方案是添加到每个。在37°C细胞孵化一个额外的4 h在黑暗中。添加酸性异丙醇是为了溶解甲瓒晶体和光学密度(OD)测定在570 nm标仪(美国马热科学)。生存能力是由比较处理的OD细胞与未经处理的细胞。

2.3。下拉试验

Crocetin-Sepharose 4 b珠准备如前所述[42]。简单地说,藏花酸(5毫克)耦合CNBr-activated琼脂糖4 b珠子(75毫克)在一夜之间耦合缓冲区4°C根据制造商的指示。5卷的混合物被耦合缓冲然后离心机在4°C 110 g为3分钟。5卷0.1米的沉淀是resuspended Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)与2 h在室温下旋转。洗涤三次后0.1米醋酸缓冲(pH值4.0)包含0.5 M氯化钠,混合物进一步用0.1 Tris-HCl (pH值8.0)缓冲区包含0.5 M氯化钠。RAW264.7细胞溶解产物(500 g / mL)是一夜之间在4°C的环境与琼脂糖4 b珠子或琼脂糖4 b crocetin-coupled珠子(100μl, 50%浆)反应缓冲区(NP-40)。珠子被洗了5次洗涤缓冲。每个特定的蛋白质被免疫印迹检测到抗体。

2.4。分子建模

藏花酸的建模TLR4-MD2、MEK1 JNK1/2, Keap1-Nrf2蛋白质(PDB码:5 ijb 1 s9j 3 v3v,和3 wn7)进行使用分子操作环境™软件(MOE,版本2012.10,化学计算Group Inc .) (43]。首次添加氢原子,原子电荷力场。对接的藏花酸蛋白激酶是由使用MOE-AS EDock 2013软件42]。

2.5。建设和转染短发卡RNA(成分)

三个短发卡RNA(成分)干扰序列定位鼠标HO-1 MEK1, ERK1, Nrf2,和消极的控制序列(NC)的设计、合成和克隆到pLKO。1的向量。DNA测序后,three-plasmid-based慢病毒包装系统(向量plasmid-psPAX2-pMD2.G)是使用慢病毒转染HEK293T细胞包。质粒是暂时性的转染到HEK293T细胞使用Lipofectamine 3000 DNA转染试剂(美国马热科学)。包含病毒收获的上层清液和添加PGE8000在一夜之间最后一个孵化的浓度为5%,然后在7000 g离心20分钟在4°C超速离心法(美国马热科学)。RAW264.7细胞孵化与慢病毒至少36 h成功感染。嘌呤霉素添加筛查活细胞,干扰被免疫印迹检测效率。

2.6。建设HO-1CRISPR敲除基因的系统

Single-guide RNA (sgRNA)针对鼠标HO-1基因(NM_010442.2)设计利用CRISPR设计网站(http://crispr.mit.edu在公共领域)。控制sgRNA序列(5 - - - - - -TGCGAATACGCCCACGCGATGGG-3 )设计目标lacZ基因大肠杆菌(44]。lentiCRISPR-v2向量从Addgene购买(猫。52961;美国Cambridge, MA)。表达sgRNA RAW264.7细胞,寡核苷酸的寡核苷酸5 - - - - - -CACCG-20 nt和底部寡核苷酸5 - - - - - -AAAC-20 nt-C-3被BsmB1退火和克隆到lentiCRISPR-v2向量(美国新英格兰生物学实验室,波士顿,MA)。流动的步骤(病毒包装、病毒感染和嘌呤霉素筛选)在shRNA-KD作为描述。随后,单克隆细胞被挑出,培养成块,和淘汰赛效率被免疫印迹检测。

2.7。测量一氧化氮(NO)和细胞内活性氧测定

一氧化氮在培养基中稳定存在亚硝酸盐(NO₂-),可以化验使用格里斯试剂(WI麦迪逊,美国)。根据制造商的手册,RAW264.7细胞( 细胞)被播种到每个12-well板块。preculture 24 h后,细胞被饿死的无血清培养系统在另一个2.5 h消除的边后卫的影响。细胞被接受或不藏花酸1.5 h 40 ng / ml有限合伙人暴露前12 h。一氧化氮释放到培养基的水平决定通过测量吸光度在530纳米微型板块读者。

细胞内活性氧(ROS)生成的细胞研究使用DCFH-DA作为检测和量化intracellular-produced过氧化氢的化合物(45]。总之,RAW264.7细胞被镀在96孔板和用藏花酸预处理2 h有限合伙人(40 ng / ml)暴露前12 h。DCFH-DA培养基添加到,最后一个20的浓度μ一个额外的30分钟。荧光强度是衡量在一个励磁(485海里),用荧光发射波长(530海里)Multilabel计数器(优秀),并表示为DMSO车辆的比例控制在有限合伙人的缺失。数据是 三个独立的实验。

2.8。核内蛋白提取和免疫印迹分析

核提取准备根据制造商的手册(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。收获细胞细胞溶解在缓冲在冰上10分钟然后在17000 g离心10分钟在4°C。冰核颗粒在缓冲resuspended B 40分钟然后在17000 g离心10分钟在4°C。上层清液含有核提取存储在-80°C到使用。

蛋白质浓度决心通过染色法测定工具包(Beyotime,广州,中国)。蛋白质提取10% sds - page分离和转移到PVDF膜(Amersham法玛西亚生物技术,小都,英国)。膜被封锁在室温下的1 h和5%脱脂奶粉,然后孵化与每个初级抗体在一夜之间在4°C和进一步孵化1 h和HRP-conjugated二级抗体。结合抗体ECL系统探测到光民视觉专业机器。

2.9。统计分析

ImageJ和Prism 5.0利用进行定量分析。所有的结果和数据被表示为三个独立的实验 的实验。一个统计的概率 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。藏花酸抑制LPS-Induced没有释放,伊诺表达式

藏红花素和藏花酸是主要的天然色素与功能性力量共存于栀子黄。据报道,藏红花素施加强大的抗炎作用的抑制伊诺表达式(46]。因此,有必要明确藏花酸的抗炎活性(结构如图1(一))。首先,藏花酸对RAW264.7细胞的生存能力的影响与MTT试验进行。如图1 (b),发现在细胞生存能力没有显著差异处理藏花酸浓度的0,10、20和40μg / ml,活细胞的数量明显减少了80μ克/毫升( )。因此,10和20的浓度μg / ml选择继续在以下研究。在图1 (c),40 ng / ml的有限合伙人成功刺激RAW264.7细胞中不表达;与10或20预处理μ克/毫升的藏花酸抑制LPS-induced没有释放。此外,伊诺的表达,没有的病原反应的酶,也被检测到。如图1 (d)伊诺表达式被发现的剂量依赖性抑制LPS-stimulated细胞藏花酸治疗后( )。这些结果表明,藏花酸具有抑制活动没有生产和伊诺表达式。

3.2。藏花酸抑制核转录因子的激活kappaB (NF -κB)

到目前为止,转录因子核因子kappaB (NF -κB)经常报道直接绑定到的启动子区域的保守序列伊诺基因可以调节其转录效率(28,29日,47- - - - - -49]。因此,NF -κB被选中在随后的研究中发现,转录因子是藏花酸的目标。首先,治疗的时间进程与20μ克/毫升的藏花酸进行调查的影响我的表达κB -α和p65。如图2(一个)40 ng / ml有限合伙人被发现显著降低我的表达κB -α在30分钟和60分钟( )和恢复在120分钟基底表达式;cotreatment 20μ克/毫升的藏花酸维持细胞质的高表达我κB -α在30分钟,但不是在60分钟和120分钟。此外,核p65的表情被藏花酸处理显著抑制60分钟,只与LPS刺激,而这一行动在120分钟消失了。有限合伙人的时间进程结果治疗只和cotreatment藏花酸表明LPS刺激的时间点在细胞模型和转录因子的作用是与先前的研究一致。

验证在NF -藏花酸的抑制作用κB通路,藏花酸治疗的剂量课程进行确认其效果的关键因素这一途径,细胞质中我的表情κB -α和导出κB -α。获得的结果在图2 (b)表明,有限合伙人增加我的磷酸化κB -α和减少我的蛋白质水平κB -α( ),和cotreatment藏花酸摄入量有关阻止这个过程。进一步确认核转录因子p65易位,均检测到核易位。根据这两个转录因子的作用时间点在图2(一个),结果表明,与藏花酸预处理可以剂量依赖性抑制p65 LPS-induced核易位(图2 (c))。这些结果显示,藏花酸抑制伊诺的表达通过阻断LPS-induced我κB -α磷酸化和p65易位。

3.3。藏花酸块LPS-Induced伊诺表达式通过增加MEK1 / ERK1磷酸化但抑制物磷酸化

MAPKs发挥重要作用在有限合伙人或植物化学的刺激伊诺RAW264.7细胞中表达;因此,有必要检测蛋白激酶级联crocetin-induced没有抑制作用及其活动更好地阐明底层机制。首先,选择几种典型的蛋白激酶抑制剂在接下来的实验中,应用包括AZD6244 SB202190,和SP600125 MEK1/2的抑制剂,p38激酶,分别和物。如图3(一个),预处理物抑制剂可以明显减少LPS-induced伊诺表达式( ),MEK抑制剂仅略有减少,和p38没有影响,这暗示只有物是必不可少的LPS-induced伊诺表达式。进一步调查coeffect藏花酸在这个过程中,20μg / ml藏花酸coadded在细胞蛋白激酶抑制剂治疗。令人惊讶的是,如图3 (b)预处理,MEK抑制剂消除藏花酸的抑制作用伊诺表达式( )。这些结果表明,藏花酸可以抑制伊诺的表达通过调节MEK的磷酸化和物。

此外,调查的实际影响藏花酸物的蛋白激酶通路,MEK, p38,一系列的免疫印迹检测。如图3 (c)藏花酸只显示剂量依赖性抑制作用LPS-induced磷酸化物( ),但是没有显著影响MEK和p38的磷酸化。这个结果引起了我们的好奇心,我们推测这一现象的原因是,MEK抑制剂与藏花酸不同目标或共同对抗竞争。随后,shRNA技术应用于击倒(KD)的基因表达MEK1和ERK1消除这些潜在的可能性。有趣的是,他获得了相同的结果,MEK抑制剂治疗(图3 (b));MEK1击倒(MEK1-KD)和ERK击倒(ERK1-KD)恢复LPS-induced伊诺表达式由藏花酸抑制治疗, (图3 (e))。这些结果表明,上述可能性并不是不重要的原因藏花酸对MEK通路的影响;也许其抑制剂的治疗时间很长一段时间的原因。因此,与藏花酸预处理15-60分钟被选为免疫印迹,而不是先前的90分钟(图3 (c))。如图3 (d),发现ERK的磷酸化是显著增加后30分钟内藏花酸治疗,和藏花酸也增加了表达p-ERK剂量依赖性的方式( )。

此外,调查之间的关系MEK1 / ERK1和物,物抑制剂用于ERK1-KD细胞。结果表明,物抑制剂可以明显抑制ERK1-KD伊诺的细胞系的表达方式存在剂量依赖的相关性, (图3 (f)),这表明,物起到了至关重要的作用在LPS-stimulated伊诺表达式,并通过诱导藏花酸发挥其抗炎效果MEK1 /物磷酸化ERK1磷酸化和随后的抑制。

3.4。藏花酸发挥其抗炎效果通过激活Nrf2 / HO-1信号通路

据报道,Nrf2 / HO-1通路的激活参与了NF -的衰减κB易位和伊诺表达式(50,51]。调查的影响藏花酸之间的串扰Nrf2 / HO-1和NF -κB /伊诺途径,是否这个相声至关重要的抗炎特性,基因击倒和基因敲除技术已被执行。如图4(一)4-16 h时间进程的结果显示,总Nrf2及其下游的抗氧化蛋白的表达显著增加了HO-1藏花酸治疗( ),但不是通过NQO1,而有限合伙人治疗;30 - 120分钟的时间进程结果显示表达式的细胞质和核Nrf2被藏花酸诱导显著治疗( )。此外,藏花酸被发现激活Nrf2 / HO-1通路显著剂量依赖性的方式。

验证Nrf2 / HO-1通路的重要作用crocetin-inhibited伊诺表达,两者兼而有之Nrf2和HO-1基因被撞倒了。如图4 (b),两个重复KD的基因Nrf2和HO-1构造( ),结果显示,击倒的HO-1和Nrf2基因可以很大程度上降低藏花酸的抑制作用LPS-induced伊诺过度, (图4 (b))。此外,CRISPR / Cas9系统是用于构造HO-1基因敲除(KO)细胞模型,进一步证实了这一行动。如图4 (c)的结果,HO-1ko细胞显示的是相似的HO-1kd细胞(图4 (b))。此外,HO-1在炎症信号通路的作用。如图4 (d),藏花酸显著抑制了导出的表达式κB -α( ),但这种效应可以逆转HO-1-KO细胞。此外,藏花酸显著抑制物的磷酸化,这效果也可以检测到在HO-1-KO细胞( )。这些结果加强直接Nrf2 / HO-1和NF -之间的串扰κB /伊诺途径和突出HO-1的重要作用在这个相声。

上述数据表明,藏花酸可能发挥其抗炎效果通过Nrf2 / HO-1信号通路的激活,和HO-1是一个重要的链接来调节RAW264.7细胞接受藏花酸的氧化还原平衡。

3.5。藏花酸的直接绑定证明和对接模型MEK1, JNK1/2 Keap1-Nrf2, TLR4-MD2

JNK1/2,我们的数据表明,MEK1 Keap1, Nrf2潜在目标藏花酸抑制炎性信号。因此,我们调查是否藏花酸直接绑定到它们,使用bead-bound拉试验,验证了作为一个有效的筛查工具在我们之前的研究42]。总之,藏花酸加上CNBr-Sepharose 4 b珠子,然后孵化与蛋白质溶解产物提取RAW264.7细胞。绑定蛋白提取和离心机的发现后与相应的抗体免疫印迹洗好的衣服晾出去。如图5(一个),MEK1和JNK1/2被检测到复杂的琼脂糖4 b beads-crocetin-proteins,绑定22.7%和95%利率相比,细胞溶解产物控制,而只有JNK1/2略发现仅在琼脂糖4 b珠子。同时,Keap1 Nrf2内源性抑制剂,主要展示了一个强大的结合Crocetin-Sepharose 4 b珠子结合率为194.6%,只有12.5%的绑定与Nrf2率检测抗体,虽然Keap1和Nrf2都没有发现仅在琼脂糖4 b珠子。这些数据表明,藏花酸能够直接与蛋白激酶MEK1和JNK1/2绑定。此外,Keap1约束力更强比Nrf2活性,建议藏花酸可能直接结合Keap1的修改然后释放Nrf2 Keap1-Nrf2复杂。

如补充图所示。3,计算对接分析数据显示,有三个氢键结合的藏花酸TLR4-MD2复杂,这是不一样的约束力有限合伙人。这个结果表明,藏花酸可能无绑定竞争力有限合伙人阻止LPS-induced炎症。知道藏花酸结合MEK1、JNK1/2 Keap1-Nrf2复杂,藏花酸绑定到这些蛋白质的计算机建模,使用材料和方法描述的软件。结果提供了有趣的信息,五藏花酸之间形成的氢键和Arg201 Glu201, Tyr125, Lys175, MEK1 Asp635残留物,附近配置磷酸腺苷的口袋(图5 (b))。如图5 (c)藏花酸之间形成三个氢键,Lys358 JNK1/2 Asp362残留物,配置一个磷酸腺苷的口袋里的一部分。进一步分析数据显示,藏花酸可以直接绑定到MEK1磷酸腺苷网站145年和146年和358年氢键结合JNK1/2。Keap1-Nrf2复杂,藏花酸之间形成三个氢键和His552 Asp579, Keap1 Asp573残留,没有配置Keap1催化域的一部分(补充图。3B)。这些对接结果进一步支持我们的下拉藏花酸之间绑定数据和MEK1 JNK1/2。

4所示。讨论

藏花酸是之前在其他研究报告为一个有效的抗炎剂(25,52]。然而,分子机制尚未完全阐明,尤其在细胞外藏花酸受体的影响和炎症通路之间的串扰和其他途径。在目前的研究中,藏花酸的抗炎特性的分子机制LPS-stimulated RAW264.7细胞模型在深度调查。结果表明,藏花酸发挥其抗炎性质主要是通过MEK1 / ERK1 /物/ NF -κ(图B /伊诺途径1)。进一步的分子数据由应用程序shRNA-KD和CRISPR-Cas9 KO技术证实藏花酸的抗炎效果,更有趣的,KD和KOHO-1基因抑制这一行动(图4)。加上藏花酸Nrf2激活的分子数据,本研究发现之间的串扰Nrf2 / HO-1通路和MEK1 / ERK1 /物/ NF -κB /伊诺通路,HO-1中扮演着重要的角色在藏花酸的监管效果保持氧化还原平衡(数字3和4)。图的详细分子机制进行了总结6。

不,作为一个主要的炎性介质,扮演了一个重要的角色在肿瘤形成的扩张和炎症反应,并建议伊诺的差别没有生产过剩或对这些基因的抑制是一个必要的目标炎症及其相关并发症的预防和治疗。到目前为止,几项研究,体外和体内,表明藏花酸具有较强的抗炎活性通过抑制癌细胞没有或伊诺(46,53]。然而,藏花酸对上述两种炎症介质的影响在原始细胞模型中尚未完全研究[25]。在目前的研究中,人们发现藏花酸的抗炎特性取决于其抑制和进气阀打开。

增殖蛋白激酶活化诱发多种炎症基因的表达调控核转录因子NF -κB (54,55]。在目前的研究中,具体使用的这些蛋白激酶抑制剂,只有物和MEK1 / ERK1相关的抗炎活性藏花酸(图3)。进一步的数据通过使用MEK1 / ERK1-KD细胞和物抑制剂暗示的磷酸化物藏花酸的作用是至关重要的,物是下游MEK1 / ERK1,与其他先前的研究是一致的(54,56,57]。总之,据报道,dual-specificity蛋白磷酸酶(DUSP)可以脱去磷酸苏氨酸和酪氨酸残基的激活MAPKs循环,从而使得他们(56]。MEK1 /激活ERK1可以增加DUSP2可以限制的转录物磷酸化(57]。更有力的证据已被证明通过使用琼脂糖4 b珠子和下拉试验找出直接绑定的证据藏花酸MEK1 JNK1/2。我们的结果(图5(一个))认为藏花酸可以直接绑定到MEK1 JNK1/2。此外,计算藏花酸MEK1和JNK1/2(数据的对接5 (b)和5 (c))也进行了分析,提供了一些有趣的结果之间的绑定信息藏花酸和氨基酸残基的羟基MEK1 JNK1/2。

众所周知,Nrf2 / HO-1抗氧化抗炎过程中信号通路起着至关重要的作用。有限合伙人可以刺激更高层次的ROS生成,细胞因子和趋化因子Nrf2-KO细胞(58,59]。几项研究已经报道Nrf2 / HO-1 NF -之间的串扰κB /伊诺。Nrf2-knockout老鼠信使rna和蛋白质水平的进气阀打开,增加和减少Nrf2的激活导致伊诺(58,60]。Nrf2或HO-1 gene-deficient小鼠肺炎球菌脑膜炎表现出更高水平的HMGB1和进气阀打开61年]。在这里,数据显示,藏花酸可以激活Nrf2 / HO-1通路(图4(一)),这可能归因于藏花酸之间的直接绑定和Keap1-Nrf2复杂(补充图。3B)。Nrf2-KD、HO-1-KD HO-1-KO抑制可以减弱crocetin-mediated伊诺抑制活动(数据4 (b)和4 (c))。更多细节图所示4 (d)藏花酸增加了HO-1的表达这是导致我的稳定性κB -α(图4 (d))。这个结果也在另一项研究[复制62年]。这些数据暗示这一行动的藏花酸部分归因于Nrf2 / HO-1通路的激活,尤其是HO-1的感应。此外,一系列的研究推测,伊诺的规定由Nrf2 / HO-1抗氧化信号通路源于其抑制活性氧的生产能力可有效激活MAPKs [63年]。然而,如补充图所示。1,藏花酸被发现剂量依赖性抑制LPS-induced ROS生产,但与不同浓度的NAC治疗,一种常见的活性氧清除剂(64年),没有影响LPS-induced伊诺表达式。这些结果表明之间没有显著相关性crocetin-mediated伊诺抑制活性和减少crocetin-mediated ROS生产。因此,需要进一步的研究来阐明分子机制深入底层ROS的关系,Nrf2 / HO-1和NF -κB /伊诺。

先前的审查表明,藏花酸的免疫调节活动可能是由于直接针对toll样受体(通常)和后续的监管等多种转录因子NF -κB和AP-1 [65年]。因此,要确认是否藏花酸与LPS竞争绑定TLR4发挥其抗炎性质,计算对接分析基于TLR4-MD2的结构复杂(PDB ID: 5 ijb)和藏花酸。(补充图的数据3)表明,藏花酸是停靠在TLR4-MD2不同领域的复杂的有限合伙人,这表明藏花酸可能没有竞争力的绑定与LPS TLR4-MD2复杂。此外,另一个证据是,击倒地没有影响crocetin-caused HO-1感应(补充图。2)。这些数据进一步证实,藏花酸发挥其抗炎效果没有目标地,和强有力的胞外受体藏花酸目标需要更详细的探索。

5。结论

在目前的研究中,人们发现藏花酸发挥其抗炎性质通过抑制MEK1 /物/ NF -κB /伊诺途径和激活Nrf2 / HO-1途径;直接MEK1 /物/ NF -之间的串扰κB /伊诺通路和Nrf2 / HO-1 crocetin-treated存在的途径是细胞,这是必不可少的藏花酸的抗炎作用;HO-1是关键链接上面的相声。因此,藏花酸可以作为氧化还原平衡调制器准确地安排其抗炎和chemopreventive效应通过其监管行动之间的串扰NF -κB /伊诺途径和Nrf2 / HO-1途径。

数据可用性

作者确认所有数据的结果是可用的。所有相关数据在论文及其支持信息文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这部分工作是国家重点支持的研究和发展项目(2019 yfc1604903),中国自然科学基金(31101268),湖南省自然科学基金(2019 jj40132),湖南农业大学和双一流的建设项目(SYL201802025) Si秦。

补充材料

补充1。补充图1:活性氧的作用LPS-induced伊诺表达式。(一)藏花酸能抑制LPS-induced ROS生产。细胞培养和治疗进行描述的材料和方法。(B) NAC (ROS拾荒者)不能抑制LPS-induced伊诺表达式。RAW264.7细胞治疗NAC (5 - 15μ米)1 h无血清培养系统在饥饿之前另一个2.5 h,然后暴露于40 ng / ml有限合伙人额外12 h。伊诺的表情被检测到免疫印迹分析。给出的数据 至少一式三份测试。 和 与LPS-treated细胞。

补充2。补充图2:地参与伊诺和HO-1表达式。(一)RT-qPCR测试基因可拆卸的效率。(B)地参与LPS-induced伊诺抑制但没有参与crocetin-induced HO-1超表达。NC和TLR-4-KD细胞用藏花酸预处理(20μg / ml) 1 h,然后暴露于40 ng / ml有限合伙人额外12 h。HO-1和伊诺表达式使用相应的抗体免疫印迹分析探测到。给出的数据 一式三份测试。 和 与LPS-treated细胞。

补充3。补充图3:对接模型藏花酸TLR4-MD2和Keap1-Nrf2复杂。(A)有三个氢键结合的藏花酸TLR4-MD2复杂,这是不一样的约束力有限合伙人。Keap1-Nrf2复杂(B),三个氢键之间形成藏花酸和His552 Asp579, Keap1 Asp573残留,没有配置Keap1催化域的一部分。

引用

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