文摘

NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis促炎的程序性细胞死亡通路,在中风后功能结果起着至关重要的作用。我们先前描述的有利影响姜黄素对通过调节小胶质极化stroke-induced神经元损伤。然而,姜黄素对小胶质pyroptosis的影响仍然未知。这里,中风是建模在老鼠大脑中动脉阻塞(MCAO) 60分钟,用姜黄素治疗(150毫克/公斤)腹腔后立即再灌注,紧随其后的是日常管理7天。姜黄素改善白质(WM)损伤和脑组织损失21天卒中后和改进的感觉运动功能3、10和卒中后21天。此外,姜黄素的数量显著降低gasdermin D+(GSDMD+)Iba1+和caspase-1+Iba1+小胶质细胞/巨噬细胞卒中后21天。在体外脂多糖(LPS)和ATP主要治疗被用于诱导pyroptosis小胶质细胞。免疫印迹显示pyroptosis-related减少蛋白质,例如,GSDMD-N, caspase-1裂解,NLRP3, il - 1β,地震后在体外或在活的有机体内姜黄素治疗。从力学上看,在活的有机体内和在体外研究证实,姜黄素抑制NF -的激活κB通路。小干扰rna转染NLRP3撞倒了显著增加小胶质pyroptosis姜黄素的抑制作用和促炎反应,两者兼而有之在体外和在活的有机体内。此外,立体定位显微镜下注射AAV-based NLRP3成分显著提高感觉运动功能和减少WM姜黄素治疗后病变MCAO老鼠。我们的研究表明,姜黄素减少stroke-induced WM损伤,改善功能结果,和减毒小胶质pyroptosis,至少部分,通过抑制NF -κB / NLRP3信号通路,进一步支持姜黄素作为一个潜在的治疗中风的药物。

1。介绍

中风仍然是死亡和长期残疾的主要原因与缺血性中风占全世界大约85%的病例。与溶栓闭塞血管的再通/血栓切除术治疗是首选治疗急性缺血性中风。然而,许多这些治疗缺血性中风患者没有资格,因为狭窄的治疗时间窗和脑出血的风险。尽管广泛的努力在过去的几十年中致力于神经保护治疗和抢救死亡的神经元,以及康复方法修复大脑右半球大脑的发展,没有取得重大进展在中风的治疗和临床康复1]。白质损伤的主要病理生理过程在缺血性中风2]。白质损伤在中风患者,脱髓鞘和轴突丧失完整性特征,是一个长期的赤字感觉运动和认知障碍的重要原因(2,3]。令人信服的证据表明,内生或intervention-dependent白质维修,包括remyelination,轴突保存,oligodendrogenesis,能扭转结构破坏,重建神经回路,并最终恢复功能(4,5]。因此,一个新的治疗目标白质恢复可能是一个有前途的战略来提高临床中风后恢复的结果。

白质损伤和修复是极大地影响卒中后脑部炎症(6]。神经炎症,其特点是招聘的外围免疫细胞,胶质激活,释放细胞因子和趋化因子,启动后几分钟内急性缺血性中风发作和卒中后持续长时间7]。脑部炎症引起的神经细胞死亡卒中后触发一连串的事件最终导致二次损伤,加重白质破坏。

小胶质细胞/ macrophage-triggered炎症反应起着重要的作用在二级白质损伤和随后的白质卒中后修复(8,9]。小胶质细胞、居民免疫细胞在中枢神经系统(CNS),被激活的反应微环境的变化,并进行形态学和功能的改变8- - - - - -10]。例如,活化的小胶质细胞可以大大改变其表型(所谓的“小胶质极化”)与缺血性中风的发展(9]。在急性期,小胶质细胞/巨噬细胞极化对早期抗炎和防护表型,紧随其后的是一个慢性有害的促炎的类型在疾病的后期。促炎的小胶质细胞可以分泌促炎细胞因子和加剧少突细胞细胞死亡和髓鞘脱失,从而加重白质损伤(11]。相比之下,抗炎介质,促进remyelination极化小胶质细胞可以产生有益的,从而促进白质修复(12]。此外,小胶质pyroptosis,一种促炎细胞程序性死亡,还参与stroke-induced炎症反应(13]。Pyroptosis依赖inflammasome激活,是由细胞质传感器其为病原体蛋白质的分子模式的绑定(pamp)或有关分子模式(抑制)14]。Inflammasome复合物通常由包含pyrin域的nod样受体(NLRPs)适配器凋亡speck-like蛋白质包含卡(ASC),而且还存在。通常,寡聚化NLRP3 ASC和pro-caspase-1激活NLRP3 inflammasome,导致caspase-1乳沟。随后激活caspase-1 pro-IL-1劈开β和pro-IL-18成熟的il - 1β和地震,分别14]。此外,激活caspase-1还劈开GSDMD GSDMD的氨基端片段(GSDMD-N)。激活GSDMD把等离子体膜,内膜脂质结合,并最终形成膜孔,导致细胞内il - 1的释放β和地震并导致促炎反应15]。新出现的证据表明,NLRP3 inflammasome-mediated小胶质pyroptosis起着至关重要的作用在脑部炎症和卒中后功能恢复16,17]。例如,melatonin-treated液有效地提高功能恢复通过抑制脑缺血后小胶质pyroptosis。因此,抑制inflammasome-dependent小胶质pyroptosis可能白质卒中后修复的新战略。

姜黄素(7-bis 4-hydroxy-3-methoxyphenyl 1, 6-heptadiene-3, 5-dione)是主要的curcuminoid姜黄和已经被证明可以直接通过多种机制发挥对脑缺血保护作用,例如,抑制线粒体凋亡[18和内质网应激19和刺激神经发生20.]。我们组(21)和其他(22]表明,姜黄素治疗已经间接的神经保护作用通过改变小胶质细胞/巨噬细胞极化的炎性表型抗炎状态。然而,姜黄素的影响在卒中后小胶质pyroptosis和白质完整性尚未探索。

在这项研究中,我们评估了卒中后的姜黄素能否防止白质损伤在动物大脑中动脉闭塞模型的瞬态/再灌注(MCAO / R)。详细的抑制性影响姜黄素治疗小胶质inflammasome激活和pyroptosis检查在活的有机体内和在体外。从力学上看,NF -姜黄素的影响κB途径激活和下游影响NLRP3 inflammasome进行调查。

2。材料和方法

2.1。动物

成年雄性C57BL / 6 j小鼠(8 - 10周,体重第23 - 25 g)购买的查尔斯河实验室(中国,北京)。老鼠被安置在温度( )- - -和湿度(40 - 60%)控股的笼子里有12小时的光暗周期,提供食物和水随意。进行了动物实验的动物伦理委员会建议北京康复医院,首都医科大学(批准ID: 2019 bkky - 08 - 012;8月2日,2019)。都是努力减少动物痛苦依照制度动物保健和使用委员会的指导方针(IACUC)。老鼠被随机分配到骗局,MCAO +车辆,MCAO +姜黄素组( )。所有小鼠被用于多个结果的研究,包括梗塞体积,神经行为测试,白质损伤和蛋白质表达。

2.2。短暂性脑缺血模型和立体定位显微镜下注射

大脑中动脉闭塞瞬态/再灌注(MCAO / R)模型是由管腔内的闭塞的右大脑中动脉(MCA) 60分钟(11]。在操作期间,老鼠30%与1.5%异氟烷麻醉O2/ 70% N2混合物。一个商业单丝(美国602156 pk5re Doccol)插入正确的MCA的起源从右侧颈总动脉(CCA)和保存在MCA 60分钟。直肠温度维持在 °C整个手术用温控加热垫。二维激光散斑成像(Perimed AB, Jarfalla,瑞典)是用来评估区域脑血流量(rCBF),和动物rCBF减少不到70%的preischemia基线水平被排除在外。虚假的老鼠相同的麻醉和手术,但没有MCA闭塞。

AAV-shRNA-NLRP3和负控制nonsequence-specific效果设计和合成了GeneChem(上海,中国)。AAV-shRNA-NLRP3列在表的核苷酸序列1。C57BL / 6 j小鼠(8周)收到一个显微镜下注射AAV-shRNA-control或AAV-shRNA-NLRP3混合物(1μL ( 病毒基因组/μL)同侧皮层缺血性病变,如前所报道(23]。显微镜下注射的坐标如下:0.3毫米前囱前,3毫米侧,2毫米深(美联社:0.3 ML: 3,深度:2)和1.9毫米后,前囱3毫米侧,2毫米深(美联社:-1.9 ML: 3,深度:2)。注射完成后10μ0.1 L微量调节注射器的速度μL / min,显微注射器注射后放置10分钟,然后撤回。评估的影响NLRP3 pyroptosis在缺血性中风小鼠模型,老鼠接受了MCAO操作,AAV显微镜下注射后2周,分为以下四组( ):MCAO + shRNA-Con +车辆,MCAO + shRNA-Con +姜黄素,MCAO + shRNA-NLRP3 +车辆,MCAO + shRNA-NLRP3 +姜黄素组。

表1
AAV-shRNA-NLRP3和AAV-shRNA-Con的核苷酸序列。
2.3。药物制备和治疗

姜黄素原液(美国Sigma-Aldrich)准备在5 M氢氧化钠,pH值7.4(与1 M盐酸调整),并进一步在0.9%生理盐水稀释在活的有机体内研究[21]。姜黄素(150毫克/公斤)或车辆管理腹腔后立即再灌注,不断注入对缺血性中风后7天。相同浓度的溶剂作为车辆控制。为在体外研究姜黄素的原液稀释培养基。主要与姜黄素(12.5小胶质细胞治疗μ米)或车辆24小时在一起有或没有有限合伙人(美国100 ng / mL,σ),然后用ATP刺激(美国σ1毫米),另一个3个小时。姜黄素的剂量选择基于现有文献[21]。

2.4。除胶测试

除胶测试是用来评估姜黄素的影响( 每组)触觉反应和感觉运动不对称缺血性中风后21天,如前所述[21]。简而言之,左前肢的触觉刺激的胶带( 厘米2),调查人员,盲实验小组,记录联系和删除录音的时间最多120秒/试验。术前训练的老鼠进行了三天,和测试进行presurgery和3,10,缺血性中风后21天。

2.5。梗死体积测量

MCAO后三天,2、3、去除氯(TTC)染色进行评估梗塞体积。简单地说,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p)和人类牺牲了。大脑进行解剖和切成6 1毫米厚的部分。部分被沾染了TTC 2%盐水如前所报道(21]。梗死体积进行了分析使用ImageJ软件和计算的百分比(%) 。

2.6。检测脑组织损失

Microtubule-associated蛋白2 (MAP-2)免疫染色进行评价脑组织损失。在手术后21天,老鼠( 每组)与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p),用0.9%的生理盐水灌注transcardially。大脑被移除和4%多聚甲醛固定(PFA)一夜之间在4°C,然后脱水20%到30%蔗糖的解决方案。连续冠状部分(20μ米)被削减,冷冻切片机(德国徕卡)。部分洗在磷酸盐(PBS)和孵化10%正常山羊血清(ZSGB-BIO,中国)在室温下为60分钟。部分被孵化与兔子anti-MAP-2抗体(1:1000年,AB221693 Abcam)一夜之间在4°C。与PBST洗涤后,样本进一步孵化驴anti-rabbit IgG-CFL 488 (sc - 362261 1: 100年,圣克鲁斯)在室温下2小时。所有样品都是激光共焦显微镜下检查(尼康、日本)。脑组织损失的分析和计算方法与梗死体积的测量方法一致。

2.7。组织准备和Luxol快蓝染色(局部反馈)

大脑切片沾Luxol快速蓝色(局部反馈)根据制造商的指示显示白质(WM)受伤。总之,日冕部分被孵化与局部反馈的解决方案(Solarbio,北京)在室温下12-20小时。洗水后,部分被对待Luxol差异化的解决方案(碳酸锂溶液)15秒,其次是70%的酒精30秒。部分被洗,脱水和显微镜检查覆盖。胼胝体和纹状体的图像与光学显微镜(日本奥林巴斯)。

2.8。免疫荧光染色和分析

小胶质细胞的pyrocytosis被双重免疫荧光染色法检测。总之,大脑部分固定在4% PFA, PBS洗,permeabilized 0.25% Triton-X100 PBS。与10%阻塞后正常山羊血清(ZSGB-BIO,中国),部分被孵化的主要抗体混合物兔子anti-Iba-1抗体(1:500年,ab178846 Abcam),鼠标anti-GSDMD抗体(1:50,sc - 393581, Santa Cruz) /鼠标anti-caspase-1抗体(1:50,sc - 392736, Santa Cruz) 36小时在4°C,然后孵化溶液混合的鸡尾酒鼠标anti-rabbit IgG-CFL 594 (sc - 516250 1: 100年,圣克鲁斯)和mouse-IgGκBP-CFL 488 (1: 50, sc - 516176, Santa Cruz)在室温下为4个小时。样本与4复染色,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国南部生物技术)和获得激光共焦显微镜(日本尼康)。大脑部分与ImageJ自动化分析处理软件,和量化的阳性细胞实验分组是不可见的。阳性细胞的数量在皮层(CTX),胼胝体(CC)和纹状体(STR)计算每平方毫米从三个随机微观领域(200 x放大)8节(9张)( 每组)。

2.9。主小胶质细胞培养和细胞模型

主小胶质细胞被孤立于整个大脑的新生儿C57BL / 6 j小鼠P1-P2和培养如前所述24]。最初的文化10天后,小胶质细胞被摆脱,收集,并孵化DMEM / F12培养基(美国生活技术Gibco) 10%胎牛血清(美国生活技术Gibco)和1%链霉素/青霉素(Gibco,生活技术,美国)。小胶质细胞被维持在37°C下5%的股份有限公司2和处理车辆或姜黄素(12.5μ米)的存在与否,有限合伙人(美国100 ng / mL,σ)和孵化24小时。LPS刺激+ ATP, ATP(美国σ1毫米)对LPS刺激后3个小时了。小胶质细胞收集27小时后初始播种信使rna和蛋白质分析。细胞实验进行独立的三倍。

2.10。小干扰rna转染NLRP3

小核RNA)针对鼠标NLRP3用于NLRP3沉默。小干扰rna和胡言乱语NLRP3控制(数控)合成了基因制药(苏州、中国)。核的顺序是5 - - - - - -CGGCCUUACUUCAAUCUGUTT-3 (向前)和5 - - - - - -ACAGAUUGAAGUAAGG CCGTT-3 (反向)。无意义的顺序控制核是5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 (向前)和5 - - - - - -ACGUGACACGUUCG GAGAATT-3 (反向)。简单地说,小胶质细胞被播种在24-well盘子和培养在完全培养基没有链霉素/青霉素。细胞是暂时性的转染NLRP3 siRNA或负控制使用Lipofectamine 3000(表达载体)。转染24小时后,用姜黄素(12.5细胞被刺激μ米)或有限合伙人(100 ng / mL) 24小时,其次是ATP(1毫米),另一个3个小时。

2.11。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)

基本小胶质细胞总RNA提取试剂盒的试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议(25]。涡流,细胞细胞溶解的试剂盒试剂。氯仿随后添加到细胞溶解产物相分离成一个水相、有机相,和异丙醇用于RNA降水。用75%的乙醇清洗后,RNA与RNase-free溶解水和进一步量化使用NanoDrop(美国热费希尔科学)。

总RNA反向转录成cDNA iScript互补脱氧核糖核酸合成工具(美国Bio-Rad大力神,CA)在最后一卷20μl .定量实时PCR(存在)顺华兴EvaGreen Supermix (Bio-Rad)上执行7500年的快速实时PCR平台(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。GAPDH是用作内部加载控制。目标基因的表达是规范化GAPDH基因和报告为2−ΔΔCT(25]。总结了引物序列表2(表达载体)。

表2
目标基因的引物实时PCR。
2.12。免疫印迹

peri-infarct区域和主要的脑组织小胶质细胞用于免疫印迹分析如前所述[11]。小胶质细胞总蛋白质含量在里帕提取缓冲(Beyotime,中国)补充与蛋白酶/磷酸酶抑制剂(罗氏)。脑组织peri-infarct地区是均质和细胞溶解在冰冷的里帕缓冲溶液对蛋白质提取。蛋白质的浓度测定采用BCA蛋白质化验设备(热费希尔)根据制造商的指示。每个样本提取当时与10%或12% sds - page凝胶电泳分析,涂抹到PVDF膜(Bio-Rad),和阻塞无脂牛奶(10%,Bio-Rad)。PVDF膜被孵化一夜之间在4°C的主要抗体(表3)。洗后,膜被孵化1小时在室温下与二次检测辣根peroxidase-labeled抗体anti-mouse(1: 10000年,ab6728 Abcam)或anti-rabbit二级抗体(1:10000年,ab6721 Abcam)。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为一个量化的内部控制。反应性是可视化增强化学发光(ECL)包(微孔、德国)和被发射极耦合逻辑检测系统(Bio-Rad)。每个乐队的相对密度值与ImageJ测量。

表3
主要和次要的信息抗体。
2.13。统计分析

统计分析使用棱镜软件7.0版本(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。所有的数据都表示为 。比较两组使用学生的表现 - - - - - -测试。多个比较了使用单向或双向方差分析Bonferroni事后测试紧随其后。所有的测试被认为是具有统计学意义 。

3所示。结果

3.1。姜黄素治疗改善梗死体积和白质损伤和促进MCAO后感觉运动功能恢复

验证的有利影响姜黄素对白质损伤和功能结果卒中后,梗死诱发小鼠通过MCAO然后再灌注后立即用姜黄素腹腔内注射治疗。手术后治疗持续了7天与日常管理(图1(一))。姜黄素对中风的神经保护效应进行评估急性梗塞卷在3天和长期脑组织损失MCAO后21天。姜黄素治疗后明显减少梗塞卷相比vehicle-treated组卒中(图3天1 (b)和1 (c))。与此同时,curcumin-treated小鼠脑组织损失明显小于vehicle-treated小鼠在MCAO后21天(数字1 (d)和1 (e))。我们之前的研究表明,姜黄素治疗改善神经功能在疾病早期阶段在远端MCAO模型(21]。因此,我们调查是否姜黄素治疗改善缺血性中风后感觉运动长期赤字使用胶去除测试。我们的数据表明,MCAO长时间接触和删除磁带的卒中后21天。姜黄素注射液显著减少这些时间在测试期间(数字1 (f)和1 (g))。这些结果表明,姜黄素治疗显著授予保护从早期到卒中后长期阶段。

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姜黄素治疗可以显著减少白质损伤和改善缺血性中风后感觉运动功能。老鼠受到大脑中动脉阻塞(MCAO),然后用姜黄素治疗(150毫克/公斤,i.p)后立即再灌注缺血后7天,每天一次。(一)的插图在活的有机体内实验时间。(b)代表TTC染色和(c)量化MCAO后梗塞体积的3天。 为每个组。 。学生的 - - - - - -测试。(d)代表MAP-2染色和(e)的脑组织损失量化MCAO后21天。 为每个组。 。学生的 - - - - - -测试。(f, g)胶去除被用来评估长期感觉运动赤字pre-MCAO和3,10,手术后21天。接触胶带(f)时间;(g)移除胶带, 为每个组。数据了 。 , 。双向方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。(h)原理图说明图像的解剖位置侧perilesion胼胝体(红色)和纹状体(绿色)。蓝色代表Luxol快(局部反馈)染色侧peri-infarct胼胝体(CC)和纹状体区域MCAO后21天。规模 μm。 为每个组。(i, j)的集成密度局部反馈染色是量化和标准化的骗局。 与车辆。单向方差分析Bonferroni紧随其后事后测试。

我们进一步研究了姜黄素治疗能否缓解白质损伤的局部反馈染色后中风。如图1 (h),光密度值(OD) LFB-stained地区的胼胝体(CC)和纹状体在vehicle-treated大幅减少中风小鼠MCAO后21天。与之相反,姜黄素治疗显著增加LFB-stained白质的OD值与车辆控制数据1(我)和1 (j))。局部反馈染色显示显著抑制stroke-induced脱髓鞘与姜黄素治疗。

3.2。姜黄素治疗可以减少脑Ischemia-Induced Pyroptosis在活的有机体内

小胶质pyroptosis能促进细胞内il - 1的释放β中风后的地震,导致炎性反应。据报道,抑制小胶质pyroptosis减弱中风破坏大脑,促进功能的结果(16,17]。确定姜黄素可以减少ischemia-induced pyroptosis,我们分析了包括GSDMD-N pyroptosis-related蛋白的水平,激活的GSDMD形式,作为pyroptotic peri-infarct地区标志。正如所料,MCAO显著诱导的表达裂解GSDMD (GSDMD-N)卒中后21天(数字2 (b)和2 (g))。重要的是,用姜黄素抑制治疗卒中后GSDMD-N的表达,表明pyroptosis抑制。没有显著变化的表达GSDMD-full长度(GSDMD-FL)被观察到在三组(数字2 (b)和2 (f))。NLRP3 inflammasome GSDMD乳沟的上游信号,和它的激活可导致细胞pyroptosis [17]。因此,我们下一步研究姜黄素的影响在NLRP3 inflammasome激活。免疫印迹结果表明,该表达式NLRP3和裂解caspase-1卒中后大大增加。然而,这些是由姜黄素抑制治疗数据2(一个),2 (c),2 (e))。最后,我们测量pro-IL-1的表达β和il - 1βperilesion地区中风大脑。中风也诱导pro-IL-1明显增加β和il - 1β,这又极大地抑制了姜黄素治疗(数字2 (b),2 (h),2(我))。我们的数据表明,姜黄素抑制促炎反应缺血性中风后,至少在某种程度上,通过pyroptosis抑制。

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姜黄素治疗可以减少stroke-mediated NLRP3 inflammasome激活和pyroptosis侧peri-infarct地区脑缺血后21天。免疫印迹(a, b)代表NLRP3和pyroptosis-related蛋白质的老鼠。免疫印迹数据的量化NLRP3 (c), pro-caspase-1 (d)、裂解caspase-1 (e), GSDMD-FL (f), GSDMD-N (g), pro-IL-1β(h)和il - 1β(我)。所有的值 。 。 老鼠,每组1乐队/鼠标。单向方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。GSDMD-FL表示GSDMD-full长度。GSDMD-N表明GSDMD-N-terminal。
3.3。姜黄素抑制Stroke-Induced NLRP3 Inflammasome激活小胶质Pyroptosis在活的有机体内和在体外

促炎pyroptosis缺血大脑主要是由小胶质细胞(26]。确认pyroptosis的发生在小胶质细胞,我们量化GSDMD的频率+或caspase-1+在Iba1+小胶质细胞/巨噬细胞免疫荧光costaining(数字3(一个)和4(一))。Immunofluorescent标签显示GSDMD的增加+小胶质细胞同侧皮层,胼胝体,和纹状体区域,卒中后21天(数字3 (c)- - - - - -3 (e)),相比sham-treated组。姜黄素治疗显著抑制GSDMD MCAO小鼠的免疫反应性。此外,MCAO caspase-1的频率增加+细胞Iba1+小胶质细胞/巨噬细胞在这三个领域,显著抑制中风和姜黄素管理局(数据后21天4 (c)- - - - - -4 (e))。这些在活的有机体内研究结果提供了确凿的证据,姜黄素抑制stroke-induced小胶质pyroptosis caspase-1激活。

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图3
姜黄素治疗可以减少GSDMD-positive小胶质细胞在脑缺血皮层,胼胝体,纹状体MCAO后21天。(一)代表coimmunostaining Iba-1(红色)和GSDMD(绿色)。禁止在1 - 3列的数据 μm,第四列的图的比例尺 μm。箭头表示GSDMD+Iba-1+小胶质细胞。(b)原理图说明图像的解剖位置侧perilesion皮层(蓝色),胼胝体(红色),和纹状体(绿色)。(汉英)定量分析GSDMD-positive小胶质细胞。量化的GSDMD的百分比+Iba-1+细胞中总Iba-1+细胞perilesion皮层(c),胼胝体(d),和纹状体(e)值 。 。 老鼠每组。单向方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。
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图4
姜黄素治疗变弱caspase-1积极的小胶质细胞在脑缺血皮层,语料库,纹状体在MCAO后21天。代表免疫荧光costaining caspase-1和Iba-1标记的大脑部分从姜黄素——获得或vehicle-treated组。(一)Costaining Iba-1(红色)和caspase-1 perilesion皮层(绿色),胼胝体和纹状体。禁止在1 - 3列的数据 μm,第四列的图的比例尺 μm。箭头表示caspase-1+Iba-1+小胶质细胞。(b)原理图说明图像的解剖位置perilesion皮层(蓝色),胼胝体(红色),和纹状体(绿色)。量化的caspase-1的百分比+Iba-1+细胞中总Iba-1+细胞perilesion皮层(c),胼胝体(d),和纹状体(e)值 。 。 老鼠每组。单向方差分析Bonferroni紧随其后事后测试。

接下来,我们评估以初级小胶质pyroptosis姜黄素的影响在体外。免疫印迹数据显示,有限合伙人+ ATP刺激显著增加NLRP3的表情,caspase-1裂解,和GSDMD-N在主要小胶质细胞(数字5(一个),5 (c),5 (e),5 (g))。实时PCR表明NLRP3的mRNA水平和caspase-1大大提升在初级小胶质细胞后有限合伙人+ ATP治疗(数字5(左)和5(米))。这些结果验证有限合伙人+ ATP诱导NLRP3 inflammasome小胶质细胞的激活和pyroptosis。按照在活的有机体内结果,姜黄素治疗显著地抑制激活NLRP3 inflammasome和小胶质pyroptosis LPS诱导的+ ATP。与此同时,姜黄素明显抑制pro-IL-1蛋白表达的增加β,il - 1βpro-IL-18,地震后小胶质细胞有限合伙人+ ATP刺激(数字5 (b)和5 (h)- - - - - -5 (k))。实时PCR表明,姜黄素显著降低mRNA水平的il - 1β和地震pyroptotic小胶质细胞(数字5 (n)和5 (o))。总的来说,我们的在活的有机体内和在体外模型表明,姜黄素抑制stroke-induced NLRP3 inflammasome小胶质细胞的激活和pyroptosis。

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图5
姜黄素抑制小胶质pyroptosis在脂多糖(LPS)和ATP-stimulated主小胶质细胞。主小胶质细胞提取从新生C57BL / 6 j小鼠的大脑皮层。小胶质细胞治疗与车辆或姜黄素(12.5μ米)的存在与否,有限合伙人(100 ng / mL) 24小时后跟ATP(1毫米)为进一步刺激3小时。免疫印迹(a, b)代表pyroptosis-related蛋白质。定量分析的免疫印迹NLRP3数据(c), pro-caspase-1 (d)、裂解caspase-1 (e), GSDMD-FL (f), GSDMD-N (g), pro-IL-1β(h)、地震(我),pro-IL-18 (j)和地震(k),所有的数据 。 每组。样本收集的三个独立的实验。 , ,和 ,单向方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。的mRNA表达NLRP3 (l), caspase-1 (m),地震- (n),和il - 1β(o)被实时PCR检测。所有的数据是 。 每组。样本收集的三个独立的实验。 和 ,单向方差分析Bonferroni紧随其后事后测试。
3.4。姜黄素变弱小胶质Pyroptosis通过NLRP3 Inflammasome抑制在活的有机体内和在体外

如前所述,姜黄素治疗显著降低NLRP3 inflammasome因此改善中风后小胶质pyroptosis(数字2- - - - - -5)。评估的相关性NLRP3 inflammasome抑制小胶质pyroptosis中风之后,我们分析了蛋白质的表达与pyroptosis peri-infarct地区与AAV-based成分(NLRP3击倒后的数字6(一)和6 (b))。NLRP3表达沉默在大脑中与NLRP3-shRNA实现大幅降价的NLRP3 peri-infarct地区,所体现的减少NLRP3蛋白质水平(图S1和数字6(一)和6 (c))。我们发现NLRP3击倒或姜黄素治疗减毒pyroptosis-associated蛋白质的水平,如裂解caspase-1, GSDMD-N pro-IL-1β,il - 1βperilesion地区MCAO后21天,而对照组(数字6(一),6 (b),6 (e),6 (g),6(我))。同时,NLRP3-shRNA治疗明显提高姜黄素的影响在这些pyroptosis-related蛋白的水平。

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图6
姜黄素和NLRP3 inflammasome抑制减弱stroke-induced小胶质pyroptosis在活的有机体内和在体外。在活的有机体内目标,定制的AAV载体携带shRNA NLRP3 (NLRP3-shRNA)被用来沉默的表达NLRP3 14天,其次是MCAO的操作。蛋白质样本提取侧peri-infarct卒中后21天。在体外小干扰rna在初级,NLRP3撞倒了小胶质细胞。代表pyroptosis-associated蛋白质免疫印迹在活的有机体内(a, b)在体外(j, k),定量分析蛋白质印迹NLRP3数据(c、l), pro-caspase-1 (d, m)、裂解caspase-1 (e, n), GSDMD-FL (f, o), GSDMD-N (g、p), pro-IL-1β(h, q), il - 1β(ir), pro-IL-18 (s)和地震(t)值 。 在活的有机体内, 老鼠,每组1乐队/鼠标。在体外从三个独立的实验,样本收集。 每组。 , ,和 ,单向方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。

接下来,我们进行了一项在体外实验进一步评估姜黄素的antipyroptosis效应是否与NLRP3激活有关。NLRP3有效siRNA转导撞倒了在休息主要小胶质细胞,免疫印迹结果(图就证明了这一点S2)。同样,siRNA转导大大减少NLRP3蛋白表达在有限合伙人+ ATP-stimulated小胶质细胞(数字6 (j)和6(左))。如图6 (j),6 (k),6 (m)- - - - - -6 (t),NLRP3抑制核减少pyroptosis-related蛋白质的水平,包括GSDMD-N caspase-1裂解,pro-IL-1β,il - 1β、pro-IL-18和地震在初级小胶质细胞处理有限合伙人+ ATP。按照我们的在活的有机体内数据,姜黄素治疗显著衰减小胶质pyroptosis siRNA-control组与LPS刺激+ ATP。有趣的是,NLRP3击倒增强小胶质pyroptosis姜黄素的抑制效应。

3.5。姜黄素治疗可以减少白质损伤和改善功能结果通过抑制NLRP3 Inflammasome激活

测量的意义NLRP3-mediated pyroptosis在卒中后神经病理学和功能恢复,我们下一个评估白质损伤和MCAO后感觉运动功能恢复NLRP3-shRNA击倒的老鼠。NLRP3-shRNA显著降低时间接触和删除磁带(数字7(一)和7 (b))和增强姜黄素对MCAO后感觉运动功能恢复的影响。此外,局部反馈染色结果表明,curcumin-induced保护白质损害明显增强的卒中后21天在NLRP3-shRNA击倒的老鼠(数字7 (c)- - - - - -7 (e))。最后,独自NLRP3-shRNA大大减毒stroke-induced白质病变又提高姜黄素神经保护效应。我们的研究结果表明,姜黄素治疗可以减少白质损伤和改善功能结果,通过抑制NLRP3 inflammasome激活。

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图7
姜黄素治疗和NLRP3 inflammasome抑制减少中风后白质损伤和改善功能结果。AAV-based NLRP3成分用于沉默的表达NLRP3 MCAO操作前14天。(a, b)胶粘剂删除测试presurgery和3,10,MCAO后21天老鼠与车辆或姜黄素治疗。(a)时间接触胶带,(b)移除胶带, 为每个组。数据了 。 , ,和 ,MCAO + shRNA-Con +车辆vs。MCAO + shRNA-Con +姜黄素;# , # # ,和# # # ,MCAO + shRNA-Con +车辆vs。MCAO + shRNA-NLRP3 +车辆;+ , + + ,和+ + + ,MCAO + shRNA-NLRP3 +车辆vs。MCAO + shRNA-NLRP3 +姜黄素。双向方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。(c)原理图说明图像的解剖位置侧perilesion胼胝体(红色)和纹状体(绿色)。代表局部反馈染色在侧peri-infarct胼胝体(CC)和纹状体区域MCAO后21天。规模 μSTR (CC)。(d, e)的集成密度局部反馈染色是量化和标准化MCAO + shRNA-Con +汽车集团。 为每个组。 , ,和 。单向方差分析Bonferroni紧随其后事后测试。
3.6。姜黄素抑制NF -κB在卒中后小胶质细胞激活在活的有机体内和在体外

姜黄素和NLRP3击倒了协同效应在神经保护,MCAO后感觉运动功能恢复。这是表明inflammasome抑制通过调制的上游信号级联。NF -κB通路引发大量的促炎反应在脑缺血后小胶质细胞,包括upregulation inflammasome组件。因此,我们测量了NF -的水平κB pathway-related蛋白质,包括phosphorylated-IκBα(phos-IκBα)和phos-p65 peri-infarct地区缺血性老鼠(图8(一个))。MCAO诱导NF -κ证明的一样,B激活phos-I的百分比的增加κBα我(Ser32)κBα(数据8(一个)和8 (e))和百分比phos-p65 p65 (Ser536)(数据8(一个)和8 (h)),卒中后21天。相比之下,姜黄素管理大大减毒stroke-induced磷酸化的我κBα和p65(数据8(一个),8 (d),8 (g))。此外,姜黄素显著逆转的减少κBα引起中风(数字8(一个)和8 (c))。在体外实验进一步证实姜黄素的抑制作用在NF -κB激活(图8 (b))。符合我们在活的有机体内结果,有限合伙人+ ATP phos-IKK的相对蛋白表达增加α/β(Ser176/180)(数据8 (b)和8 (k)),phos-IκBα(Ser32)(数据8 (b)和8 (n)),phos-p65 (Ser536)(数据8 (b)和8(问)相比)。与之相反,姜黄素显著减少的影响有限合伙人+ ATP刺激phos-IKK相对蛋白质表达的α/β(Ser176/180)(数据8 (b)和8 (j)),phos-IκBα(Ser32)(数据8 (b)和8 (m)),phos-p65 (Ser536)(数据8 (b)和8 (p)主小胶质细胞)。这些发现支持,显著抑制NF -姜黄素治疗κB在小胶质细胞激活后中风。

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图8
姜黄素治疗抑制NF -的stroke-induced激活κB通路在活的有机体内和在体外。在活的有机体内姜黄素(150毫克/公斤)再灌注后腹腔内注入老鼠MCAO后7天,每天一次。大脑从侧peri-infarct收集的样本区域脑缺血后21天。在体外、初级小胶质细胞与LPS诱导pyroptosis + ATP与姜黄素预处理后或者车辆24小时。免疫印迹NF -代表κB pathway-related蛋白质在活的有机体内(一)和在体外(b),我免疫印迹的定量分析数据κBα(c、l), phos-IκBα(米),d phos-I的相对比κBα与总我κBα(e, n)、p65 (f, o), phos-p65 (g、p), phos-p65的相对比例和总p65 (h, q)、IKKα/β(我),phos-IKKα/β(j)和phos-IKK的相对比例α/β与总IKKα/β(k)值 。 在活的有机体内, 老鼠,每组1乐队/鼠标。在体外从三个独立的实验,样本收集。 每组。 和 ,单向方差分析Bonferroni事后考验紧随其后。

4所示。讨论

在中枢神经系统中,白质髓鞘和白羽组成的轴突(27]。轴突的髓鞘是缠绕在节间,借此促进跳跃式传导的神经信号。髓鞘密度,由局部反馈表示染色,可以表示白质的完整性。相比于灰质,白质是更容易缺血性侮辱更严重受损,由于有限的血液流动和小侧枝循环(28]。以前的临床前研究主要集中在缺血性神经元的保护。然而,防止白质损害常被忽视。局灶性脑缺血可诱导髓鞘和轴突的完整中断损失。因此,无论在灰质神经元的保护,失去髓鞘和轴突的完整性可能会干扰神经连接(29日]。白质的完整性起着重要的作用在长期中风后恢复。神经结果后中风被证明与白质病变小鼠(负相关30.]。考虑到关键的白质损伤和缺血性中风之间的联系,最近的研究集中在对卒中后恢复白质治疗策略。一些药理干预措施,如苯丙酸诺龙(30.和山茱萸环烯醚萜苷31日),被证明对缺血性中风提供神经保护通过促进白质的完整性。到目前为止,姜黄素的神经保护效应主要集中在stroke-induced灰质病变。在这里,我们研究姜黄素的疗效与卒中后长期白质损伤。我们的数据显示显著改善白质完整性CC和小鼠纹状体区域,伴随着增强感觉运动功能恢复中风后21天。内源性少突细胞祖细胞(OPC)激增到myelin-producing寡树突胶质细胞位于CC和缺血性中风后的纹状体区域32]。与我们的研究一致,用姜黄素治疗被证明发挥关键作用在缓解伴有白质损伤的动物模型的缺血缺氧性脑病新生儿(33和脊髓损伤34]。但是我们进一步表明,姜黄素在脑白质损伤的神经保护效应与小胶质pyroptosis有关。

Microglia-mediated炎症反应产生关键影响二次损伤和自发修复白质卒中后(9]。少突胶质细胞是白质的主要组件。促炎小胶质反应加剧stroke-induced寡树突胶质细胞死亡和抑制/ OPC remyelination通过促炎细胞因子的分泌8,9]。相比之下,调节小胶质极化向抗炎表型可以促进恢复受损的白质通过神经保护等因素的释放TGF -β和il - 108]。一些研究报道,fingolimod的政府24)或红细胞生成素(35)可以提高白质修复间接通过小胶质极化的规定。因此,抑制促炎小胶质反应被认为是一个潜在的治疗策略以提高白质完整性和改善卒中后神经复苏。在先前的研究中,我们表明,姜黄素间接提高功能恢复调节小胶质细胞/巨噬细胞极化对消炎表型(21]。在目前的研究中,我们分析了姜黄素的抑制作用小胶质pyroptosis,促炎细胞程序性死亡,使用一个在活的有机体内MCAO模型和在体外模型主要有限合伙人+ ATP后小胶质细胞的刺激。Pyroptosis特点是caspase-1-mediated乳沟GSDMD的n端结构域,形成GSDMD毛孔,从而使释放促炎il - 1β和地震。新兴的研究表明pyroptosis参与缺血性中风的发病机制pyroptosis抑制,改善脑损伤(36]。Pyroptosis报道等中枢神经系统的多种细胞类型的神经元和胶质细胞(37中风后)。我们的在活的有机体内和在体外结果表明,姜黄素治疗显著降低pyroptosis-related蛋白质含量包括GSDMD-N caspase-1裂解,il - 1β小神经胶质细胞中,地震。因此,姜黄素对脑白质损伤的有益作用引起的中风至少部分归因于pyroptosis抑制小胶质细胞。就在慢性脑低灌注大鼠模型结合糖尿病,据报道,姜黄素预防认知障碍部分通过pyroptosis抑制(38]。

正如前面所讨论的,pyroptosis由GSDMD inflammasomes发起和执行。具体来说,NLRP3 inflammasome是最关键的介质之一pyroptosis各种inflammasomes之一。它患中风的病理过程中起着至关重要的作用[39]。NLRP3 inflammasome不足或治疗的选择性抑制剂可以明显降低缺血性脑损伤(40]。特别是中风被发现引起小胶质pyroptosis-mediated促炎反应通过的激活NLRP3 inflammasome [13,36]。在脑缺血,NLRP3 inflammasome活化诱发caspase-1的乳沟,从而裂开GSDMD, pro-IL-1β,pro-IL-18 GSDMD-N,成熟的il - 1β,分别和地震。在目前的研究中,我们的在活的有机体内和在体外数据表明,姜黄素大大抑制激活NLRP3 inflammasome引起的缺血性中风。因此,姜黄素的抑制小胶质pyroptosis可能与其抑制关联NLRP3 inflammasome激活。在这里,与AAV-based成分NLRP3击倒在活的有机体内显著地抑制小胶质pyroptosis,白质损伤,减少和改进的感觉运动功能恢复。此外,NLRP3沉默协同增强姜黄素antipyroptotic小胶质和白质病变和神经保护作用。这些结果被证实在体外在NLRP3击倒显著增强curcumin-mediated pyroptosis抑制。这些发现证实姜黄素治疗和抑制NLRP3 inflammasome激活改善stroke-induced小胶质pyroptosis。与我们的结果一致,姜黄素还发现抑制促炎介质包括il - 1的水平β、地震、γ干扰素(IFN -γ)和肿瘤坏死因子-αTHP-1巨噬细胞细胞系通过的差别,对这些NLRP3 inflammasome激活鼠标内侧半月板的骨关节炎模型(41]。集体,抑制NLRP3 inflammasome激活中起着重要的作用姜黄素在巨噬细胞的antipyroptosis函数。

姜黄素可以减弱doxorubicin-induced心肌细胞pyroptosis通过NLRP3 inflammasome抑制(42]。在这里,我们表明,NLRP3击倒和姜黄素治疗协同作用,以防止白质损伤,表明上游信号调节。繁杂的机制包括减少K+流出,抑制钙2 +涌入,抑制NF -κB激活,防止ASC适配器绑定到NLRP3参与姜黄素的抑制作用NLRP3 inflammasome激活(43]。特别是,NF -κB通路中起着重要的作用的聚合NLRP3组件和形成NLRP3 inflammasome激活。NF -κB信号是促炎反应的主要中介,是参与NLRP3等促炎因子的转录,il - 6、TNF -α、pro-caspase-1 pro-IL-1β,pro-IL-18。激活NLRP3 inflammasome进一步激活caspase-1,进而促进成熟的促炎细胞因子il - 1β和地震。在中风模型在体外姜黄素的抗炎作用,对脑微血管内皮细胞被发现与NF -的抑制有关κB信号通路(44]。因此,我们推测,姜黄素减少NLRP3 inflammasome-mediated小胶质pyroptosis可能通过抑制NF -κ卒中后B通路。在我们的研究中,IKK的磷酸化水平α/β,我κBα中风后,p65显著增加在活的有机体内和在体外与对照组相比,显著逆转的姜黄素治疗。因此,抑制NLRP3 inflammasome激活通过NF -姜黄素是介导κB信号抑制小胶质细胞。我们的研究结果与先前的报道是一致的,表明NF -κB信号通路与姜黄素的镇压NLRP3 inflammasome激活炎性巨噬细胞(45,46]。在这个报告中,我们没有评估NF -的直接依赖关系κB信号,有可能直接干扰上游下游信号级联如TLR可能导致类似的效果。尽管被广泛使用,NF -κB基因敲除小鼠有明显的系统性免疫缺陷使其神经系统疾病的不切实际的模型。尽管如此,最近的发展条件敲除或可拆卸的方法可能规避这个问题。未来的研究将直接评估NF -姜黄素的依赖κB信号降低中风后白质损害。姜黄素的,治疗后变弱stroke-induced通过抑制NF -白质损害κB信号和抑制NLRP3 inflammasome(图9)。


图9
示意图说明姜黄素的抑制作用小胶质pyroptosis NF -和促炎反应κB信号抑制和卒中后NLRP3抑制。缺血性中风的激活触发NF -κB的易位p50 p65小胶质细胞的细胞核中,促进靶基因的转录,如GSDMD NLRP3, il - 1β和地震。的寡聚化NLRP3 ASC和pro-caspase-1生成NLRP3 inflammasome,激活caspase-1。随后激活caspase-1劈开GSDMD pro-IL-1β,pro-IL-18 GSDMD-N, il - 1β,分别和地震。GSDMD-N把最终的质膜和膜孔形式,导致释放il - 1β和地震。因此,小胶质pyroptosis-mediated促炎反应加剧stroke-induced白质损伤。姜黄素显著抑制NF -κB信号,抑制stroke-triggered NLRP3 upregulation和激活小胶质pyroptosis。因此,大脑炎症明显减少,扭转赤字白质损伤和功能。

越来越多的研究表明,姜黄素对不同神经保护功能以直接或间接的方式,包括减少神经元凋亡[18),促进神经发生20.),抑制脑白质损伤(34,47,抑制小胶质细胞pyroptosis [38]。直接的神经保护作用,姜黄素显著改善脑白质损伤,减少preoligodendrocytes的损失,降低新生大鼠LPS-treated活化的小胶质细胞,与抑制诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和NADPH氧化酶(NOX)激活47]。非人灵长类动物模型中正常的老化,长期姜黄素治疗大脑皮层灰质密度增加roi(地区利益)和改进的白质完整性在边缘,小脑和脑干地区,提供改进的空间工作记忆的神经基础和运动机能老化非人灵长类动物对待姜黄素(48]。Daverey Agrawal表明姜黄素治疗防止脊髓创伤性脑白质损伤通过NF -κB和Nrf2相声(34]。值得注意的是,目前的研究表明,姜黄素能减轻脑白质损伤和改善感觉运动与缺血性中风小鼠行为缺陷。我们的在活的有机体内和在体外研究中证实,姜黄素对小胶质pyroptosis直接监管的影响。间接的神经保护功能,姜黄素间接改善认知障碍,慢性脑低灌注大鼠模型结合糖尿病诱导小胶质激活,通过抑制神经炎症减轻细胞凋亡,减少NLRP3-dependent pyroptosis [38),这表明小胶质细胞的抑制pyroptosis缺血性中风可能是一种有效的治疗策略。同样,我们的研究表明,姜黄素治疗白质损伤改善缺血性中风后通过抑制小胶质细胞/巨噬细胞pyroptosis NF -κB抑制和NLRP3 inflammasome抑制。同意我们的结果,最近的一些研究表明,姜黄素对间接通过调节神经保护作用[microglia-mediated神经炎症21,22]。然而,姜黄素的主要缺点是其生物利用度差,由低浓度血清和组织表现不管政府路线(49]。姜黄素的生物利用度较低主要是由于其快速和广泛的小肠和肝脏代谢50,51]。最近,新的药物传输系统可以提高姜黄素的生物利用度和药物动力学,这将有利于其临床应用。例如,nanoformulated姜黄素高度水溶性和改善其生物利用度较高的等离子体水平,调节局部炎症反应,改善神经胶质疤痕,和保护对脊髓损伤的白质(52]。因此,姜黄素可以使这种化合物的新型药物传输系统的理想的候选药物。

5。结论

我们的数据表明,姜黄素治疗可以减弱小胶质pyroptosis,增强白质完整性和改善功能结果,通过NF -κB信号抑制和随后NLRP3 inflammasome抑制。本研究暴露了NF -κB信号和NLRP3激活小说作为小说的治疗目标和姜黄素治疗中风代理。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和补充信息文件(s)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

渊源跑和魏苏的贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金81671161。

补充材料

图S1:击倒NLRP3 AAV-based成分的基因没有脑缺血小鼠。(一)代表西方NLRP3水渍似的在活的有机体内。(B)定量分析的免疫印迹NLRP3的数据。 , ,学生的 - - - - - -测试。图S2:击倒NLRP3基因与核主小胶质细胞在休息。(一)代表西方NLRP3水渍似的在体外。(B)定量分析的免疫印迹NLRP3的数据。 , ,学生的 - - - - - -测试。(补充材料)