文摘
足突细胞线粒体功能障碍的发病机制中起关键作用慢性肾脏疾病(CKD)。先前的研究表明,线粒体过度分裂可能导致生产过剩的活性氧(ROS),促进足细胞凋亡。因此,维护稳定的线粒体功能保护足细胞是一种新发现的方法,防止慢性肾病的进展。mitochondria-targeted抗氧化剂,mitoquinone (MitoQ)已经被证明是一种很有前途的代理线粒体损伤的预防心血管疾病和帕金森病。目前的研究调查了MitoQ对血管紧张素ⅱ的影响——(Angⅱ)诱导足细胞损伤在活的有机体内和在体外。足突细胞线粒体在Ang II-infused老鼠表现出形态和功能改变。观察到线粒体分裂和活性氧的生产与MitoQ治疗缓解。在体外,改变在盎II-stimulated足细胞线粒体形态和功能,包括降低线粒体膜电位、活性氧的生产过剩,和三磷酸腺苷(ATP)不足,被MitoQ显著逆转。此外,MitoQ获救的表达式和易位Nrf2(核转录因子E2-related因子2)和减少Keap1的表达(Kelch-like ECH-associated蛋白1)和II-stimulated足细胞。Nrf2击倒部分屏蔽MitoQ的保护作用和II-induced线粒体分裂和足细胞的氧化应激。这些结果说明MitoQ施加盎II-induced线粒体损伤的保护作用通过Keap1-Nrf2足细胞信号通路。
1。介绍
足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,负责极其复杂的过滤函数,足突细胞损伤,导致蛋白尿和启动的进展慢性肾脏疾病(CKD) [1]。CKD通常伴随着的激活肾素-血管紧张素系统(RAS) (2]。血管紧张素ⅱ(Angⅱ),RAS的重要组成部分,已经被证明可以直接导致足细胞损伤(3,4]。然而,盎II-induced足细胞损伤的确切机制仍然是难以捉摸的。
越来越多的证据表明氧化应激在足细胞损伤的重要作用[5,6]。有趣的是,Angⅱ刺激细胞内活性氧(ROS)形成和参与慢性肾病的发病机理和发展7]。它已经表明,线粒体产生的ROS主要是(8),但Angⅱ的分子机制刺激线粒体产生大量的活性氧是不完全清楚9]。线粒体进行连续核裂变和核聚变来满足能源需求和移除受损的线粒体;总的来说,这些行为被称为线粒体动力学(10]。先前的研究表明,线粒体过度分裂可能影响呼吸链的结构和空间组织ATP合酶和电子传递和耦合影响,导致活性氧的大量生产和细胞凋亡11]。我们最近报道,过度的线粒体分裂和随后的氧化损伤是足细胞损伤的关键组件(12]。因此,它是合理的推测,维持体内平衡的线粒体动力学可以减少Ang II-induced足细胞的氧化损伤。
Mitoquinone (MitoQ),一种mitochondria-targeted抗氧化剂,辅酶Q10和TPP阳离子组成的,其亲和力线粒体倍大于传统的抗氧化剂(13]。最近的研究表明,MitoQ改善氧化应激在各种疾病,包括心血管疾病和低氧诱导肺动脉高压(14,15]。特别是MitoQ已被证明能够防止过度线粒体分裂和管状细胞氧化损伤在糖尿病肾病(DKD) [16]。因此,我们进一步假设MitoQ可以防止Ang II-induced足细胞损伤通过抑制线粒体分裂。
核因子E2-related因子2 (Nrf2)是一个关键的转录因子,调节细胞抗氧化反应(17]。Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1),一个消极的Nrf2调节器,通过泛素化降解Nrf2 [18]。证据表明,Nrf2参与线粒体动力学的规定(19]。有趣的是,最近的一项研究表明,MitoQ减毒线粒体分裂和髓核细胞对氧化损伤的保护目标Keap1-Nrf2通路在椎间盘变性20.]。然而,是否MitoQ防止Ang II-induced足细胞损伤和预防的潜在机制仍不清楚。在目前的研究中,我们调查的保护作用MitoQ在足细胞线粒体动力学和氧化损伤在活的有机体内和在体外和评估Keap1-Nrf2通路在此过程中所扮演的角色。
2。材料和方法
2.1。动物研究
无菌雄性C57BL / 6小鼠年龄在8周,体重在18到22岁的g用于动物实验。这项研究是由动物实验的伦理委员会批准武汉大学人民医院。经过一个星期的适应,老鼠被随机分配到四组:生理盐水灌注组(一个渗透微型泵(2004年Alzet模型,CA)是嵌入在老鼠,收到生理盐水),盐水组接受腹腔内注射MitoQ(美国多国评价5毫克/公斤,两周一次的4周)(16],Angⅱ输注组(渗透微型真空泵是嵌入在老鼠,收到700 ng /公斤/分钟和第二(美国Sigma-Aldrich)注入4周),和Angⅱ灌注组接收MitoQ腹腔注射。28天,24小时后收集尿液样本的测量尿蛋白,小鼠安乐死,收获和肾组织进行进一步的研究。
2.2。细胞培养和治疗
有条件地永生的人类足细胞被好心的天才Moin a .萨利姆博士(学术肾单位,医院最南部,英国布里斯托尔)。足细胞数量在33°C RPMI 1640中(美国HyClone)补充10%胎牛血清(美国Gibco), 100年μg / mL链霉素,100 U /毫升青霉素g(热费希尔科学、美国),和1×insulin-transferrin-selenium(其Gibco)。这些细胞被转移到其免费的37°C中诱导分化。差异化的足细胞暴露在106M Angⅱ24 h模仿Angⅱ在足细胞的直接影响。Angⅱ曝光之前,细胞使用50或100 nM MitoQ 2 h。Nrf2核(TsingKe,中国)交付给足细胞使用HiPerFect(试剂盒、德国)根据制造商的指示。
2.3。免疫荧光染色
石蜡包埋deparaffinized和肾组织部分受到抗原检索,这是在高压下进行柠檬酸缓冲(0.01 mol / L, pH值6.0)10分钟。阻塞后5%牛血清白蛋白(BSA)为1 h,孵化了部分主要抗体在一夜之间在4°C(美国GeneTex Nrf2 # GTX103322;synaptopodin Progen,德国,# 65194),其次是孵化与fluorochrome-conjugated二级抗体(热费希尔科学)在37°C 2 h在黑暗中。核与4复染色 ,6 - - - - - -diamidino-2-phenylindole (DAPI Antgene,中国)。所有图片都是用荧光显微镜(日本奥林巴斯)。
2.4。免疫组织化学染色
石蜡包埋deparaffinized和肾组织部分受到抗原检索,这是在高压下进行柠檬酸缓冲(0.01 mol / L, pH值6.0)10分钟,然后用3%过氧化氢孵化了10分钟。阻塞后30分钟山羊血清在室温下为10%,部分是孵化与anti-Nrf2抗体(Nrf2 # GTX103322)一夜之间在4°C和孵化聚合辣根peroxidase-conjugated二级抗体为30分钟。的部分与diaminobenzidine可视化,用苏木精复染色。与荧光显微镜图像捕获(奥林巴斯)。
2.5。西方免疫印迹
如前所述(执行西方免疫印迹3]。短暂,总蛋白质样品被sds - page分离,然后转移到PVDF膜(美国σ),也被封锁与5%脱脂牛奶1 h和孵化一夜之间在4°C的主要抗体(Nrf2 # GTX103322;美国Keap1,罗福斯# nbp1 - 83106;美国光学atrophy-1 (Opa1) ImmunoWay # YN2976;美国mitofusins2()中进行Mfn2 Abcam # ab124773;dynamin-related蛋白1 (Drp1)、Abcam # ab56788;美国p-Drp1-Ser637、细胞信号技术,# 4867;裂变1 (Fis1)、GeneTex # GTX111010;,Proteintech GAPDH中国,# 600004 - 1)。HRP-labeled山羊anti-rabbit /鼠标免疫球蛋白(H + L)抗体(Antgene,中国)作为二级抗体。 The proteins were detected by a Bio-Rad imaging system.
2.6。MitoTracker红染色
MitoTracker红色(美国表达载体)染色进行如前所述[21]。简而言之,足细胞孵化了50 nM MitoTracker红色工作解决方案30分钟37°C和与DAPI染色细胞核形象化。所有图片都是用荧光显微镜(奥林巴斯)。
2.7。评估ROS、线粒体膜电位和三磷酸腺苷(ATP)含量
过氧化物生成、线粒体膜电位和ATP含量进行测量(如前所述)(22]。短暂,ROS生产在肾小球足细胞被dihydroethidium评估(她,英杰公司)和2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein(中国Beyotime H2-DCFDA)化验,分别。分析了线粒体膜电位JC-1染色(Beyotime)。与ATP测定ATP生成测量工具(Beyotime)。
2.8。细胞凋亡检测
足细胞凋亡的化验是通过流式细胞术使用PE和7-ADD双重染色,和所有程序都按照制造商的指示执行(PE膜联蛋白V凋亡检测装备,BioLegend,美国)。
2.9。统计分析
GraphPad棱镜7用于统计分析。所有的值表示为 (SD)。所有组之间的差异是由学生的决定 - - - - - -测试或单向方差分析(方差分析)。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。MitoQ改善肾小球足细胞损伤在Ang II-Infused老鼠
一个盎II-infused小鼠模型建立了调查MitoQ能否防止肾小球足细胞损伤。如图1(一)与saline-infused老鼠相比,Ang II-infused老鼠表现出增加24 h尿总蛋白(UTP)的水平,和MitoQ治疗显著下降UTP的水平。与此同时,组织学检查发现明显的形态学改变和II-infused肾小球的老鼠,表现为系膜基质扩张,肾小球硬化症。此外,肾小球基底膜(GBM)增厚和弥漫性足突融合,足细胞损伤的标志,透射电子显微镜(TEM)观察到在Ang II-infused老鼠。有趣的是,这些改变被MitoQ管理局(数据明显改善1 (b)- - - - - -1 (d))。
(一)
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3.2。MitoQ提升足突细胞线粒体融合和减毒氧化应激在肾小球和II-Infused老鼠
证据表明,足突细胞线粒体分裂导致生产过剩的活性氧,这在慢性肾病的发病机制中起着至关重要的作用。因此,本研究测试MitoQ在线粒体损伤的影响在活的有机体内。使用TEM分析线粒体形态和显示增加足细胞的线粒体分裂和II-infused老鼠与saline-infused老鼠和减少线粒体碎片在足细胞从老鼠MitoQ(数据管理2(一个)和2 (b))。此外,减少线粒体聚变相关蛋白的表达(Opa1和进行Mfn2)和线粒体fission-related蛋白的表达增加(Drp1、p-Drp1 Fis1)被发现在肾小球和II-infused老鼠。然而,所有这些变化获救MitoQ治疗(数字2 (c)和2 (d)和补充图S1a-b)。此外,她染色显示增加活性氧产量从盎II-infused小鼠肾小球,MitoQ管理局显著减轻肾小球的活性氧积累Ang II-infused老鼠(数字2 (e)和2 (f))。总的来说,这些结果表明,MitoQ治疗减足突细胞线粒体分裂和肾小球氧化应激和II-infused老鼠。
(一)
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3.3。MitoQ缓解Ang II-Induced足突细胞线粒体分裂在体外
接下来,我们研究MitoQ能否减弱和II-induced足突细胞线粒体分裂在体外。线粒体表现出支离破碎的、强调或圆形结构和II-exposed足细胞,线粒体和MitoQ预处理显著预防上述盎II-exposed足细胞形态转换(数据3(一个)和3 (b))。同时,Opa1的表达水平,进行Mfn2 Drp1, p-Drp1, Fis1被免疫印迹检测。符合的模式在活的有机体内研究,MitoQ预处理部分纠正Drp1的过度表达,p-Drp1, Fis1 Opa1和差别,对这些进行Mfn2盎II-exposed足细胞(数字3 (c)和3 (d)和补充图S1c-d)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。MitoQ减毒氧化应激、线粒体功能障碍和盎II-Treated足细胞凋亡
MitoQ已经被证实能改善线粒体氧化损伤通过抑制线粒体分裂在髓核细胞和肾小管细胞16,20.),但其对足细胞保护作用尚不清楚。在足细胞ROS生产被DCFDA染色检测。我们发现Angⅱ暴露明显增加活性氧的生成和MitoQ预处理明显减毒ROS升高生产(数字4(一)和4 (b))。进一步调查MitoQ对线粒体功能的影响,线粒体膜电位(MMP)和细胞ATP生成足细胞进行评估。Angⅱ曝光MMP和细胞ATP含量的显著降低,而这些改变被MitoQ预处理(数据特别是预防4 (c)- - - - - -4 (e))。探索MitoQ是否能够改善的结果引起的足细胞损伤和II,足细胞凋亡的化验是通过流式细胞术,我们观察到MitoQ预处理显著降低凋亡引起的足细胞和II(数字4 (f)和4 (g))。这些结果表明,MitoQ变弱氧化应激和线粒体功能障碍通过抑制线粒体分裂。这些结果表明,抑制线粒体分裂是一个关键的过程MitoQ变弱在足细胞氧化应激和线粒体功能障碍。
(一)
(b)
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(e)
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(g)
3.5。MitoQ对线粒体氧化跟压力的表达蛋白质Keap1和Nrf2
上述结果表明,MitoQ明显缓解Ang II-induced线粒体碎片和氧化应激在足细胞在活的有机体内和在体外。然而,底层MitoQ预防线粒体损伤的分子机制仍然不明。自Keap1 / Nrf2在抗氧化应激信号通路起着关键的作用,然后,我们调查是否Nrf2激活参与MitoQ在在足细胞线粒体损伤的保护作用。免疫印迹结果显示增加Keap1和减少Nrf2表达式在肾小球和II-infused老鼠相比saline-infused老鼠(数字5(一个)和5 (d))。此外,减少Nrf2表达式在肾小球足细胞从Ang II-infused老鼠也证实了免疫组织化学和免疫荧光双重染色,分别。有意义,MitoQ部分救了这些蛋白的异常表达模式(数据5 (b)和5 (c))。与结果一致在活的有机体内研究,增加Keap1和减少Nrf2表达式也和II-stimulated足细胞所示在体外并通过MitoQ预处理(数据恢复5 (e),5 (g)和5 (h))。此外,核易位Nrf2被免疫荧光监控,和Nrf2核位置的表达式和II-stimulated足细胞明显减少。MitoQ预处理大幅逆转的核易位引起Nrf2 Ang II(数字5 (f)和5(我))。综上所述,这些数据表明,Nrf2激活可能参与MitoQ在足细胞的保护作用。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
3.6。沉默的Nrf2废除MitoQ的保护作用和II-Induced线粒体在足细胞裂变
检查Nrf2如何有助于保护MitoQ对线粒体动力学的影响,Nrf2 siRNA用于击倒Nrf2的表达在体外(图6(一))。MitoTracker红染色显示MitoQ的保护作用线粒体形态被Nrf2击倒(数字6 (b)和6 (c))。依照这些发现,免疫印迹结果表明Drp1表达的增加,p-Drp1, Fis1 Opa1表达降低,进行Mfn2盎II-stimulated足细胞由MitoQ获救,这种效应被小干扰rna转染Nrf2(数字部分废除6 (d)和6 (e)和补充图S1e-f)。这些结果表明,Nrf2信号参与保护MitoQ反对Ang II-induced线粒体在足细胞裂变。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.7。MitoQ减毒氧化应激、线粒体功能障碍和足突细胞凋亡通过Nrf2信号部分
我们进一步研究了Nrf2击倒能否减弱MitoQ的保护作用和II-induced足细胞的氧化损伤。DCFDA染色显示MitoQ盎II-stimulated足细胞减少活性氧积累,和小干扰rna转染Nrf2废除这一效应(数据7(一)和7 (b))。同样,Ang II-induced线粒体功能障碍被MitoQ逆转,部分消除了小干扰rna转染Nrf2,就是明证JC-1染色和ATP含量分析(数据7 (c)- - - - - -7 (e))。此外,击倒Nrf2明显但不完全废除MitoQ的保护作用和II-induced足细胞凋亡(数字7 (f)和7 (g))。这些结果表明,MitoQ在足细胞的保护作用在一定程度上依赖于Nrf2。
(一)
(b)
(c)
(d)
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(f)
(g)
4所示。讨论
目前的研究表明,治疗MitoQ可以减弱足细胞损伤和肾小球硬化症Ang II-infused老鼠。MitoQ能够维持线粒体动力学体内平衡和减少Ang II-induced线粒体分裂和随后的氧化应激在足细胞。此外,这些影响的可能机制是进一步探索。这些结果表明,MitoQ在足细胞的保护作用介导的Nrf2, Nrf2可能影响线粒体动力学通过调节Opa1的表达,进行Mfn2, Drp1 p-Drp1, Fis1。
线粒体融合与分裂动力学发挥重要作用在肾脏疾病的发病机理和发展23- - - - - -27]。线粒体分裂主要受Drp1及其受体,包括Fis1 Mff(线粒体分裂因素)和MiD49 / MiD51(线粒体蛋白质动力学49和51 kDa) (5,28]。在裂变过程中,Drp1招募从线粒体外膜的胞质受体和形成一个环状低聚物介导线粒体的分区(29日]。此外,Drp1磷酸化在Ser637残留导致线粒体裂变过程(30.]。相反,Mfn1/2,两个dynamin-related gtpase,调节线粒体融合的拘束线粒体外膜(23]。另一个dynamin-related GTPase Opa1促进内膜融合和嵴的稳定5]。已经表明,蛋白石退化参与镇压线粒体融合(31日,32]。之间的平衡失调聚变和裂变蛋白质改变线粒体形态和导致线粒体功能障碍(29日,33,34]。我们和其他人的研究表明过度足细胞中线粒体分裂DKD病人和DKD动物模型;这样过度的线粒体分裂可能导致活性氧过剩和线粒体功能障碍(12,30.,35,36]。Overactivation CKD的RAS是主要的风险因素和DKD肾脏氧化应激密切相关(37- - - - - -40),但其作用线粒体动力学和氧化应激在足细胞很少研究。本研究首次探讨之间的关系和二世,RAS的代表组成部分,足突细胞线粒体动力学。这里的研究结果表明,Angⅱ刺激调节Drp1的表达,p-Drp1, Fis1和表达下调的表达进行Mfn2 Opa1,导致线粒体分裂和足细胞的氧化损伤。
虽然积累的证据表明,线粒体分裂和氧化应激参与慢性肾病进展(41,42),只有有限的研究是否线粒体分裂和足细胞的活性氧产量减少药理方法能减少肾脏损害。应用血管紧张素转换酶抑制剂(acei)或血管紧张素受体阻滞剂(arb)在慢性肾病患者会导致部分缓解肾脏氧化应激(7,抗氧化剂干预目标的总水平的影响细胞氧化还原状态是令人失望的,因为传统的抗氧化剂是不被线粒体。mitochondria-targeted抗氧化剂MitoQ可以迅速进入细胞并被线粒体(吸收43]。我们所知,没有研究关注MitoQ对足细胞损伤引起的影响和二世。足细胞和脚过程中扮演着重要的角色在建立的选择性渗透肾小球滤过屏障,和足细胞损伤与蛋白尿和肾小球硬化症1]。这项研究表明,MitoQ明显减轻蛋白尿,脚过程融合,肾小球硬化症。椎间盘变性,神经退化和DKD动物模型,MitoQ表现出保护作用通过维持线粒体的内稳态动力学(16,20.,44]。因此,我们进一步研究了防护MitoQ对足细胞的影响,这种影响是否由于线粒体动力学的规定。符合这些研究,我们已经表明,MitoQ显著减毒线粒体分裂Drp1下调表达,p-Drp1, Fis1和移植进行Mfn2和Opa1的表达。
本研究也探讨底层机制MitoQ在盎II-stimulated足细胞线粒体动态的管理。Nrf2是一个关键的转录因子,调节生产的抗氧化剂保持细胞氧化还原平衡(17]。Nrf2的负面调节器,Keap1与Nrf2导致Nrf2 polyubiquitination和随后的退化(18]。Sabouny et al。45)最近表明,压力激发了Nrf2可能增加蛋白酶体活性促进Drp1的退化,导致减少线粒体分裂。除了调节线粒体动力学通过影响线粒体分裂/融合蛋白,Nrf2也可以间接地通过影响线粒体生物合成和mitophagy调节线粒体动力学。Dinkova et al。46)建议Nrf2可以维持PGC1水平α并增加线粒体生物起源取代分散线粒体的压力条件。此外,激活Nrf2能促进mitophagy通过粉色/帕金线粒体途径消除分散(47]。Nrf2已经表明,激活或抑制Keap1预防肾脏疾病如急性肾脏疾病,常染色体显性遗传多囊肾疾病,慢性肾病(48- - - - - -50]。周et al。51)报道,Nrf2抗氧化反应的激活能减轻podocytopathy,肾小球损伤,和阿霉素引起的蛋白尿。此外,Nrf2导致恢复线粒体管状细胞动力学对MitoQ DKD [16]。因此,它是合理的推测MitoQ能够调节通过Nrf2足突细胞线粒体动力学。
来验证这个假设,我们使用不同的方法来检测Keap1的表达和Nrf2在足细胞和显示Keap1表达增加,Nrf2表达减少和II-infused老鼠。此外,Nrf2水平下降和核易位伴随着大量的线粒体分裂和足细胞的氧化应激。然而,这些改变被MitoQ政府明显获救,并击倒Nrf2在足细胞用siRNA废除MitoQ的保护作用线粒体分裂和氧化应激引起的Ang II,提供进一步支持这一假说的Nrf2可能起到至关重要的作用在足细胞线粒体动力学的规定。然而,激活Nrf2作为一把双刃剑的氧化应激(52]。Nrf2不足导致破坏的氧化还原平衡,导致活性氧和自由基的积累。相比之下,连续upregulation Nrf2可能增加抗氧化剂的水平,如谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白(时候),导致冲ROS-dependent炎症和细胞凋亡的敏感性52,53]。此外,Nrf2在肾脏疾病的功能作用是有争议的;我们和许多其他研究表明,Nrf2发挥抗氧化作用,延缓肾损害的进展(54- - - - - -56]。不过,拉什et al。56)表明,Nrf2通路持续活化可能诱发足细胞损伤和慢性肾病动物模型中增加蛋白尿。因此,所有这些研究表明可能需要监控Nrf2 CKD患者的活动水平。
在目前的研究中,具体的机制MitoQ调节Nrf2 Keap1并没有研究。此外,Nrf2易位到核促进抗氧化应激等因素的转录NAD (P) H醌脱氢酶1 (NQO-1)和血红素加氧酶1 (HO-1) [57]。虽然该研究表明MitoQ提升Nrf2核易位,NQO-1的表达水平和HO-1没有评估。
总之,这项研究首次表明,MitoQ引起的对足细胞损伤有保护作用和二世。潜在的影响机制可能是通过Nrf2归因于线粒体动态的维护,导致线粒体分裂和减少氧化损伤。这些研究结果强烈支持MitoQ在RAS-associated足细胞损伤的治疗价值。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
所有作者声明没有利益冲突。
作者的贡献
梁伟夺得朱镕基和贡献同样这项工作。
确认
这项研究由美国国家科学基金会支持的中国(批准号81770687和81770687 g D。柔,81970631)。
补充材料
补充图S1:免疫印迹分析pDrp1(637)从不同的团体在肾小球。(b)量化的蛋白质水平从面板; 比正常盐水组;# 与Ang II灌注组。 。(c)免疫印迹分析pDrp1(637)从不同的团体在足细胞。(d)从面板c蛋白水平的量化; 与控制;# 与Angⅱ;美元 与Ang II + MitoQ 50纳米, 。(e)的免疫印迹分析pDrp1(637)从不同的团体在足细胞。(f)从面板e蛋白水平的量化; 与控制;# 与Angⅱ;美元 与Ang II + MitoQ 100海里, 。(补充材料)