文摘

慢性肝脏疾病(cld)与氧化应激诱导细胞内积累的活性氧(ROS)。在这项研究中,我们使用HepG2,人工肝细胞癌行包含许多抗氧化酶,探索的功能花翠素对氧化应激诱导的H₂O₂并提供科学数据的分子机制。飞燕草色素细胞使用不同浓度(10μ20 mol / Lμmol / L, 40岁μmol / L)在治疗前2 h 750μM H₂O₂1 h。结果表明,H₂O₂HepG2细胞的存活率降低,增加活性氧的水平,但是花翠素预处理可以拥有相反的结果。同时,Nrf2表达的增强是由花翠素预处理。这是因为花翠素促进Nrf2核易位和抑制其降解,导致抗氧化蛋白的表达增加HO-1(血红素oxygenase-1 Nrf2-related二期酶)。此外,我们发现花翠素可以显著缓解减少Nrf2蛋白质含量和细胞内活性氧的积累水平Nrf2击倒HepG2细胞。总之,我们的研究表明,花翠素是一种有效的抗氧化剂,保护HepG2细胞氧化应激通过调节Nrf2 / HO-1的表达。

1。介绍

慢性肝脏疾病的死亡人数(cld)与肝硬化、肝癌、肝炎等正在全世界增加(1]。越来越多的证据证实氧化应激的贡献作用cld的发病机理。氧化应激的常见原因(2,3)、活性氧(ROS)包含氧化反应是分子的总称,包括超氧化物阴离子(O₂-),羟基自由基(OH),次氯酸(HOCl),臭氧(O₃)和过氧化氢(H₂O₂)[4]。

有一个适应和动态抗氧化防御系统,消除过多的活性氧和保护细胞不受氧化应激在人类的身体。抗氧化剂、抗氧化酶和第二阶段解毒酶是包含在这个系统。以前的研究已经表明谷胱甘肽的二期解毒酶由S-transferase(销售税),NAD (P) H醌oxidoreductase-1 (NQO1),和血红素oxygenase-1 (HO-1),可以清除自由基,亲电试剂(5]。此外,抗氧化剂的反应元素(是),一个共同的核苷酸序列在第二阶段解毒酶的启动子区域,可以有效地抑制核转录因子激活红细胞两个相关因子2 (Nrf2),可以调节其下游基因的表达(6]。

作为一个关键的转录因子,Nrf2调节细胞内抗氧化的反应,在体内平衡维护中扮演着关键角色7]。在正常情况下,Nrf2存储在细胞质中处于不活跃状态,直到加上Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1)和由ubiquitin-protease系统迅速退化。从而Nrf2稳定的表达和转录活性很低。虽然氧化应激条件下,Nrf2负责与Keap1的分离和转移到细胞核之前识别和绑定与下游的转录调节两相的解毒酶和抗氧化蛋白的基因,如消费税NQO1、HO-1。先前的研究表明,Nrf2有保护作用对氧化应激疾病如癌症(8)、糖尿病(9),呼吸系统疾病(10,慢性炎症11),心血管疾病(12),和神经退行性疾病13]。除此之外,先前一些研究显示,多酚活性Nrf2 / Keap1通路通过不同的机制来发挥抗氧化活性如槲皮素(14,15),儿茶素(16[],黄芩苷、17),和白藜芦醇18]。

花青素,广泛分布在可食用植物,是有益健康19- - - - - -21]。例如,花青素在神经系统疾病有一个有效的函数,低血糖,毒性,抗炎22- - - - - -24]。飞燕草色素,天然花青素,是一种最有价值的多酚类物质由于其较高的抗氧化活性。金等人此前透露,飞燕草色素具有抗血管新生作用潜力(25]。此外,花翠素可以抑制SKOV3细胞的增殖(卵巢癌细胞)26),它可以通过抑制细胞凋亡由预防前列腺癌p53 [27]。李等人报道,花翠素可以保护软骨细胞对H₂O₂介导的氧化应激通过激活NF -κB和Nrf2 [28]。然而,缺乏数据如何花翠素调节Nrf2发挥抗氧化压力的功能。在这项研究中,我们打算使用H₂O₂构建一个细胞的氧化损伤模型和评估飞燕草色素的抗氧化活性。本研究的目的是调查是否花翠素发挥抗氧化保护细胞通过调节Nrf2通路。

2。材料和方法

2.1。细胞和试剂

HepG2细胞获得中南大学癌症研究所(长沙,中国)。花翠素从开曼群岛公司购买(美国密歇根州)。过氧化氢溶液(H₂O₂)从恒星化学试剂的购买(天津)。RPMI 1640中型和胎牛血清(的边后卫)从Gibco购买(美国纽约大岛)。5-dimethylthiazol-2-yl Penicillin-streptomycin解决方案和3 - (4)2,5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)试剂获得Gen-View (Calimesa、钙、美国)。细胞内活性氧的形成决定使用DCFH-DA (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。核和胞质蛋白提取设备和蛋白酶抑制剂phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)从Beyotime购买(上海,中国)。主要的抗体,如anti-Keap1 anti-HO-1, anti-Lamin B从圣克鲁斯生物技术(美国CA)。从Abcam Nrf2抗体购买(英国剑桥)。抗体β肌动蛋白抗体和α微管蛋白是来自ABclonal(美国波士顿)。多聚甲醛是购自Dingguo(中国,北京)。从Solarbio Triton-X得到(中国,北京)。山羊血清和DAPI买来博士德(武汉,中国)。试剂盒试剂是来自Ambion(美国奥斯汀)。qPCR SYBR绿色主混合从Vazyme购买(中国南京)。反转录试剂盒说明和Lipofectamine 3000人购自热费希尔科学(美国威明顿)。

2.2。细胞培养

HepG2细胞培养在RPMI 1640中,补充了10%的边后卫和1% penicillin-streptomycin解决方案在37°C公司5%₂的气氛。

2.3。MTT试验

MTT试验进行检测花翠素对细胞活力的影响。HepG2细胞( 细胞/ 96 -孔板)被播种了24小时,然后用不同浓度的花翠素治疗24 h。改变培养基后,5毫克/毫升MTT试剂添加和细胞培养4 h。细胞生存能力是通过测量吸光度计算使用标490海里。10μ米,20μM, 40μ米花翠素的治疗H₂O₂经过评估是对细胞活力的影响基于上述实验的结果。

2.4。ROS化验

HepG2细胞( 细胞/)被播种在96 -孔板24 h。刷新后培养基,细胞治疗与花翠素(10μ20 mol / Lμmol / L, 40岁μ摩尔为2 h / L)。然后细胞暴露在H₂O₂(750μmol / L) 1 h。细胞被洗一次温暖的磷酸缓冲盐(PBS)和无血清培养基含有5μM ROS探针是添加和反应30分钟。荧光是读取荧光光谱仪(PerkinElmer沃尔瑟姆,妈,美国)的激发波长485纳米。

2.5。免疫印迹分析

细胞质和核蛋白质提取准备通过使用核和胞质蛋白提取工具。细胞被洗3次,冰冷的1×140年PBS和细胞溶解μL 1×SDS。蛋白质分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和随后转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF) 1.5 h在阻止5%脱脂奶1 h。然后,PVDF膜被孵化到特定的初级抗体(Nrf2、Keap1 HO-1,β肌动蛋白,核纤层蛋白B,α微管蛋白在一夜之间)在4°C。与Tris-Buffered盐水洗3次后Tween20 (TBS-T)解决方案,PVDF膜的孵化与相应的二次抗体室温。最后,膜进行化学发光成像系统扫描(Tanon 5500年,中国上海)。

2.6。免疫荧光分析

HepG2细胞(~ 细胞/)培养24 h在盖玻片24-well盘子。细胞治疗花翠素(20μmol / L) 3 h, h₂O₂(750μmol / L) 1 h。细胞随后被洗两次热烈PBS和4%多聚甲醛固定在室温下30分钟。与0.1% Triton-X渗透后在室温20分钟,细胞被封锁的山羊血清1 h。然后,细胞被孵化Nrf2主要抗体在一夜之间在4°C。与冷PBS洗3次后,细胞与荧光二次抗体1.5 h和孵化与DAPI染色5分钟在室温下在黑暗中。最后,盖玻片被安装到玻璃幻灯片,图片是由荧光显微镜(美国威明顿热科学)。

2.7。免疫沉淀反应

HepG2细胞( 细胞培养皿中10厘米/盘)被播种在24 h。然后,细胞治疗花翠素(20μmol / L) 2 h, h₂O₂(750μmol / L) 1 h。与冷PBS洗两次后,细胞与细胞裂解细胞溶解PMSF缓冲区包含1毫米。溶菌产物搅拌1 h在4°C,然后在12000 xg离心机高速冷冻离心机在4°C,持续15分钟。确定上层清液的蛋白质浓度后,细胞提取物preincubated 2μg正常兔免疫球蛋白g(免疫球蛋白)和20μL蛋白琼脂糖珠(Beyotime、上海、中国)2 h。混合物在2500 rpm离心机高速冷冻离心机在4°C 5分钟。anti-Nrf2抗体(2的上层清液被添加μ在4°C g)和搅拌过夜,然后上层清液混合着30μL蛋白琼脂糖珠在4°C 2 h。随后,混合物在2500 rpm离心机高速冷冻离心机在4°C 5分钟收集珠子。与细胞裂解缓冲洗一次后,珠被添加到1×SDS加载缓冲然后在100°C加热5分钟为后续免疫印迹实验。

2.8。定量实时聚合酶链反应

从细胞总RNA提取试剂盒试剂,和1%琼脂糖凝胶被用来评估RNA完整性通过紫外凝胶成像系统。总RNA反转录成cDNA根据逆转录工具包指令。此外,实时PCR分析使用qPCR SYBR绿色主人混合和LightCycler 96仪器(罗氏、巴塞尔、瑞士)。研究中使用的引物合成了Sangon生物技术(Sangon生物技术有限公司、上海、中国)和表所示1。最后,使用2 -数据计算ΔΔCq方法。

2.9。转染的成分

的设计可拆卸的短发夹核糖核酸(成分)(ccggacTGACAGAAGTTGACAATTActcgagTAATTGTCAACTTCTGTCAgttttt-tg)针对Nrf2委托GeneChem(上海,中国),随后,shRNA克隆成double-marked慢病毒载体GV248 (GeneChem、上海、中国)。Lipofectamine 3000被用来使转染sh-con(负控制)和sh-Nrf2质粒成HepG2细胞。嘌呤霉素治疗后,非特异性的细胞被淘汰和绿色荧光细胞分类使用流式细胞仪。转染细胞培养,用免疫印迹检测和ROS的方法。

2.10。统计分析

SPSS18.0统计(美国芝加哥,IL)软件是用于统计分析。所有的数据至少重复三次,结果被表示为 。估计正常的数据分布和方差的同质性。统计两组之间的差异是使用双尾学生的评估 - - - - - -测试。采用单向方差分析之间的多个样本均值(成对比较使用LSD测试)。否则,克鲁斯卡尔-沃利斯H测试是用于数据分析(Student-Newman-Keuls测试用于成对比较)。被认为是在统计意义 。

3所示。结果

3.1。花翠素保护HepG2细胞对H₂O₂全身的氧化应激

HepG2细胞处理不同浓度(0 ~ 200μ米)24小时测试的飞燕草色素细胞毒性,和生长抑制率是通过MTT分析来衡量的。如图1 (b)HepG2细胞接受飞燕草色素的IC50值为65.58μm与对照组相比,细胞治疗花翠素不同浓度(10μ米,20μM, 40μ米)显示正常生长,多边形形状,和明确的边界(图1 (c))。根据上面的MTT实验的结果,10μ米,20μM, 40μ米花翠素被用来预处理HepG2细胞的细胞和细胞生存能力治疗H₂O₂(750μ米)检查。一方面,细胞的可行性₂O₂治疗组显著下降(100%和 %, )。另一方面,花翠素干预组显著增加。( %, %, %, %,分别 )(图1 (d))。

此外,2 ,7 - - - - - -dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA)探针用于检测细胞内ROS水平。与对照组相比,ROS水平H₂O₂治疗组增加了60% ( )。相反,与H₂O₂治疗组,ROS水平花翠素干预组(10μ米,20μM, 40μ米)下降了9.4%、28.7%和21.1%,分别为( )(图1(f))。

3.2。激活Nrf2-Related受花翠素的蛋白质

与对照组相比,Nrf2的蛋白表达增加了1.2倍,3 h ( )和HO-1提升3 h, 6 h, h (9 )治疗后与20μHepG2细胞的M(数字2(一个)和2 (b))。结果表明,细胞治疗20μ米花翠素调节Nrf2 HO-1蛋白水平在3 h。此外,Nrf2的蛋白表达和HO-1 20后调节μM和40μ米花翠素治疗( )。另一方面,飞燕草色素并不影响Keap1的蛋白表达(数字2 (c)和2 (d))。因此,3 h处理时间和20μ米花翠素选择了下面的实验。

3.3。激活Nrf2 / HO-1通路由花翠素氧化应激

为了调查是否花翠素可以调节Nrf2 / HO-1通路,HepG2细胞处理不同浓度(10μ米,20μM, 40μ米)的飞燕草色素2 h,随后治疗h₂O₂(750μ米)1 h(总治疗时间是3 h)。然后,Nrf2-related mRNA的表达和蛋白质被qPCR和免疫印迹检测。相比之下,H₂O₂治疗组,Nrf2 mRNA水平显著增加花翠素干预组(10μ米,20μM, 40μ米)。除此之外,花翠素导致的一个重要upregulation HO-1 mRNA在20μM和40μ米花翠素组。没有显著差异在Keap1 mRNA的表达(图3(一个))。如数据所示3 (b)和3 (c),我们发现在20的浓度μM和40μ米也调节Nrf2和HO-1的蛋白表达。然而,每组Keap1蛋白质水平保持不变( )。这一结果表明,飞燕草色素会增加Nrf2 HO-1信使rna和蛋白质含量,但对Keap1没有影响。

3.4。花翠素促进Nrf2的核易位

进一步调查是否花翠素可以调节Nrf2的核易位,免疫荧光实验进行定位Nrf2 HepG2细胞治疗花翠素(20μ米)和H₂O₂(750μ米)。此外,利用免疫印迹检测水平Nrf2细胞质和细胞核。相比之下,H₂O₂治疗组,绿色荧光表达HepG2细胞的细胞核是增强与花翠素治疗后(图4(一))。在图4 (b),结果表明,一些Nrf2可以检测到细胞质的对照组。相反,与H₂O₂治疗组,Nrf2蛋白表达增加的细胞核花翠素干预组(10μ米,20μM, 40μ米)( )。这些数据表明,花翠素可以促进细胞核Nrf2输入和积累。

3.5。抑制Nrf2飞燕草色素降解和H₂O₂

Nrf2在细胞质中由26 s蛋白酶体降解。26 s蛋白酶体抑制剂MG132采用预处理细胞的泛素化Nrf2被coimmunoprecipitation和免疫印迹检测。与MG132治疗后,ubiquitinated蛋白质和Nrf2蛋白质的水平是每组高于那些没有MG132(图5(一个))。在IP实验中,无论是MG132 (10μ米)添加与否,的表达ubiquitinated Nrf2较高和飞燕草色素细胞补充(20μ米)和H₂O₂(750μ比其他组(图)5 (b))。上述结果可能表明,飞燕草色素可以减弱退化Nrf2通过抑制26 s蛋白酶体的功能。

3.6。花翠素和H的效果₂O₂Nrf2击倒细胞

为了进一步验证cytoprotective Nrf2和花翠素对氧化应激的影响,与sh-Nrf2 HepG2细胞转染质粒,随后使用20μ米花翠素前增加750μM H₂O₂。Nrf2对照组的表达与sh-Nrf2使转染质粒后显著降低,表明转染是有效的。此外,Nrf2的表达在HepG2细胞治疗花翠素单独增加sh-con和sh-Nrf2细胞,这表明,飞燕草色素可能上调Nrf2(数据的表达6(一)和6 (b))。与对照组相比,ROS试验的结果表明,H₂O₂治疗显著增加sh-con细胞的荧光强度的0.77倍,而sh-Nrf2细胞增加了1.55倍( )。此外,sh-con细胞的荧光强度和sh-Nrf2细胞花翠素干预组明显减少了32.5%和64.9%,分别的价格相比H₂O₂治疗组(图6 (c))。这些结果表明,沉默Nrf2基因增强的H₂O₂全身HepG2细胞氧化应激,飞燕草色素减少氧化应激恢复正常。

4所示。讨论

据一些报道(29日),花青素是水溶性黄酮类化合物,他们的骨骼是2-phenylbenzopyran环结构(图1(一))。他们有一个抗氧化活性与diorthohydroxyl相关功能的一部分。在各种花青素,飞燕草色素(Dp)吸引了太多的关注由于其最大B环上的羟基数量和较高的抗氧化活性30.,31日]。在这项研究中,HepG2细胞,肝细胞,具有多方面的生物学特性和许多阶段I和II抗氧化酶的活性,选择评估飞燕草色素的抗氧化性质影响治疗(32,33]。到目前为止,很少有报道飞燕草色素的抗氧化活性HepG2细胞。作为小分子很容易穿过细胞膜,H₂O₂的主要成分是细胞内ROS在许多生理和病理过程中产生的,它可以导致氧化损伤细胞(34,35]。因此,H₂O₂常被用来研究氧化应激的机制(34,36]。在我们之前的实验,我们对HepG2细胞与500年μM H₂O₂,发现尽管细胞内ROS水平增加,它不能满足稳定的氧化应激环境的要求。在这个实验中,我们选择了750年μM H₂O₂对HepG2细胞1 h,基于我们之前的实验的结果和别人的研究37- - - - - -39]。在我们的研究中,治疗750例μM H₂O₂导致减少细胞生存能力和积累在HepG2细胞ROS。同样,我们的研究还表明,750年μM H₂O₂可能会导致细胞形态学的变化(图S1)。它明显缓解与花翠素预处理后,符合镍的研究40和李et al。28]。目前,飞燕草色素HepG2细胞的毒性并没有被研究过。在我们的研究中,我们获得了,飞燕草色素的IC50值是65.58μ用MTT检测(图1 (b))。不同浓度的细胞治疗(10μ米,20μM, 40μ米花翠素没有造成任何损坏的细胞(图1 (c))。在其他的研究中,不同浓度的花翠素用于治疗不同的细胞,但普遍认为,40下花翠素的剂量μM细胞增殖(没有影响28,41]。与花翠素干预组(40μ花翠素干预组(20美元)μ米)有较强的抗氧化能力(数据1 (d)和1 (e))。建议飞燕草色素的抗氧化活性HepG2细胞可能与剂量相关的依赖。我们都知道,花翠素具有很强的抗氧化能力,但花翠素对其抗氧化活性的分子机制仍然遥遥无期。

多酚类物质,比如花翠素、槲皮素和山柰酚,可以发挥其cytoprotective属性由于其能力增加第二阶段解毒酶的活性和直接清除活性氧的能力(42- - - - - -44]。在多个第二阶段解毒酶,HO-1和NQO1被认为是产生有益的多种细胞氧化应激反应(16,45]。事实上,这是因为heme-derived HO-1有强大的抗氧化和cytoprotective活动产生的代谢物(46,47]。此外,根据相关研究,人们已经发现,HO-1和NQO1可以有效地激活Nrf2 [30.]。在我们的研究中,花翠素治疗显著调节Nrf2和HO-1(图的蛋白表达3)。与矮牵牛配基(48),飞燕草色素Nrf2的mRNA水平也增加。此外,据几位之前的报告,我们发现,多酚可能激活Nrf2通路通过轻微的氧化应激(49]。然而,在我们的研究中,与对照组相比,ROS水平没有明显差异当细胞接受花翠素(20μ米)(图1 (e))。因此,花翠素没有促进Nrf2激活的方式略有增加活性氧的水平。

在生理条件下,Nrf2结合Keap1在细胞质中,它不断的协同效应下ubiquitinated ub-activating酶E1, ub-conjugating酶E2和E3 ub-ligating酶。在那之后,ubiquitinated Nrf2迅速由26 s蛋白酶体降解。然而,如果身体接触毒物,药物,致癌物质,或其他亲电试剂,Nrf2将从Keap1隔离和转移到细胞核,在Nrf2与小加蛋白质结合形成形成之前绑定;最后,下游第二阶段解毒酶被激活(7,50)(图7)。在这项研究中,泛素化和免疫荧光实验被用来调查花翠素是否通过这种机制发挥抗氧化剂效果。花翠素治疗后的结果表明,绿色荧光的表达在HepG2细胞的细胞核增强(图4(一))。此外,结果显示Nrf2蛋白表达在细胞质和细胞核,我们可以看到花翠素促进了核易位Nrf2(图4 (b))。最近,据报道,多酚如geraniin [51]和hyperoside [49)可以在细胞核刺激Nrf2的表达,与这些化合物和我们的研究结果是一致的,但不同于槲皮素在NB4白血病细胞(52]。尤其是MG132的预处理后,我们发现Nrf2的表达和ub-Nrf2高集团对待花翠素(20μ米)和H₂O₂(750μ比其他组(图)5)。张等人先前表明,非瑟酮,饮食类黄酮有相同的函数作为花翠素Nrf2上调表达,长期Nrf2蛋白的半衰期(2]。这些结果表明,飞燕草色素可能会减少退化Nrf2通过抑制26 s蛋白酶体的功能,导致更高的总Nrf2表达蛋白质。事实上,陈等人此前透露,B环上的与哦团体膳食类黄酮和/或不饱和C环可以作为蛋白酶体抑制剂(53),进一步支持我们的发现。此外,秦等人此前透露,杨梅酮(54和黄芩甙元17)可以抑制Nrf2的泛素化和表达下调Keap1的表达,但这种变化不是花翠素干预后观察。分析这些化合物的结构后,我们推测,这可能是与4-carbonyl组C环,这需要进一步实验验证。基于上述结果,我们认为花翠素升高Nrf2激活可能通过上调Nrf2 mRNA表达,促进Nrf2核易位,而不是通过诱导Keap1退化。

根据上述研究,我们必须考虑是否花翠素还能保护细胞不受氧化应激Nrf2撞倒的时候。尽管H的ROS水平₂O₂sh-Nrf2细胞的治疗组高于sh-con细胞,花翠素还能减少ROS的sh-Nrf2细胞(图恢复正常水平6 (c)),我们还发现花翠素可以促进推倒Nrf2后Nrf2蛋白的表达。上述结果显示重要作用减轻细胞内氧化损伤的飞燕草色素Nrf2击倒细胞(数字6(一)和6 (b))。考虑到ROS水平没有明显差异,对待花翠素(20μ米)在sh-con和sh-Nrf2细胞,飞燕草色素的荧光强度的干预组低于对照组sh-Nrf2细胞,我们推测花翠素也可能扮演一个角色在cytoprotective效应通过激活其他抗氧化途径,如phosphatidylinositol-3-kinase PI3K / Akt信号通路(55]或抑制ERK的磷酸化、物和p38 [56),这需要进一步实验验证。

5。结论

作为对手的26 s蛋白酶体,飞燕草色素可以上调Nrf2 mRNA的表达,促进细胞核的Nrf2的积累,抑制ub-Nrf2的退化,激活下游HO-1的表达。总之,本研究表明,花翠素提出的抗氧化保护作用,减轻毒性作用引起的H₂O₂HepG2细胞,通过Nrf2信号通路机制。建议花翠素可以作为一种新型的抗氧化剂预防疾病与氧化应激有关。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

晶晶徐张Yanwei构思和设计研究。晶晶徐、张Yanwei华贵,香港秦,Rengui杨任,Jingfang陈,小菁香进行实验。晶晶徐写道。Yanwei张、陈华贵和香港秦审查和编辑的手稿。所有作者阅读和批准了手稿。晶晶徐和Yanwei张同样这项工作。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(81472972)和中南大学的毕业生的创新研究项目(2020 zzts808)。华贵的陈和香港秦cocorresponding本文的作者。

补充材料

图S1:形态学观察不同浓度(10μ米,20μM, 40μ花翠素M)与H₂O₂(750μ米)(补充材料)