文摘

本研究的目的是确定关系的类黄酮结构化学和细胞内抗氧化活性。60类黄酮的抗氧化活动进行了三种不同的抗氧化剂化验,包括2、2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH自由基清除活性,氧自由基吸收能力(ORAC)和细胞抗氧化活性(CAA)化验。结果表明6类黄酮细胞抗氧化剂首次评估。细胞抗氧化化合物7-methoxy-quercetin活动,3 -O-methylquercetin、8-hydroxy-kaempferol quercetin-3 -O- - - - - -α阿拉伯呋喃糖,kaempferol-7 -O吡喃葡萄糖苷,luteolin6 -C葡萄糖苷与抗氧化酶的upregulation活动(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)。结构活性关系表明,2、3键,4-keto组,3 ,4 - - - - - -邻苯二酚结构,3-hydroxyl类黄酮骨架的抗氧化行为中起了非常重要的作用。此外,细胞增殖试验显示为3 -较低的细胞毒性O-methylquercetin。目前的结果提供有价值的信息的膳食应用高抗氧化剂类黄酮与不同的结构。

1。介绍

活性氧(ROS)已知损害身体的组织,导致扰乱人体系统上建立秩序。活性氧攻击生物分子如DNA、脂质和蛋白质自由基损伤,这刺激了许多疾病的发展,衰老、心血管病和癌症等(1]。目前,研究人员发现,类黄酮消费可以改善癌症和心血管疾病(2]。有逆饮食类黄酮和慢性疾病之间的关系,显示的重要性,研究类黄酮(3]。

类黄酮是一种最丰富的酚类化合物在各种水果、蔬菜、谷物、香料、饮料,和药用植物结构的C6- c3- c6环骨架标有A、B和C(表1)。子类包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮类、黄烷醇,花青素,isoflavonoids [4]。许多研究人员已经发现了一种广泛的生物活性的黄酮类化合物在预防和缓解各种疾病如肥胖、糖尿病、癌症、心血管病、心脏病(5- - - - - -7]。因此,黄酮类化合物被认为是这些疾病管理候选人由于ROS和伊诺(8]。黄酮类化合物的能力取决于他们取代基组,羟基的数量,其他的替换,结合。此外,槲皮素、山柰酚、芸香苷、橘皮苷、柚皮苷、染料木素、根皮素,异槲皮苷,紫杉叶素,表儿茶素,花青色素氯化,及其衍生物被广泛分布在苹果、蓝莓、樱桃、葡萄、茶叶、柑橘、辣椒、红酒、巧克力等,具有广泛的生物活性(9- - - - - -11]。然而,据我们所知,系统研究各种类黄酮的抗氧化能力的差异和结构活性关系仍然稀缺。特别是,不同结构之间的影响类黄酮和抗氧化酶活动(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT),与谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶))很少被研究。

表1
60个黄酮类化合物的化学结构。

因此,我们选择了60个黄酮类化合物,其核心结构的多样性和替代模式,有助于系统地研究化学和细胞抗氧化剂的差异分析工作。一系列的类黄酮的抗氧化活动(表1)常见的饮食,包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮类、黄烷醇、黄烷类化合物,和花青素,被2,检查2-diphenyl-1-picrylhydrazyl自由基清除活性,氧自由基吸收能力,细胞抗氧化活性分析。饮食黄酮类化合物的构效关系的不同结构分析获得抗氧化活性高的子结构。细胞抗氧化活性测定是接近生理条件提供一个广泛的评价抗氧化剂。此外,细胞毒性和抗增殖活性测定也测量。本研究提供了理论基础的结构修改类黄酮是有效的抗氧化剂。

2。材料和方法

2.1。化学试剂

二甲亚砜(DMSO), 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Trolox,荧光素钠盐,2 ,7 - - - - - -dichlorfluorescin二乙酸(DCFH-DA), 2, 2-azobis (2-amidinopropane)盐酸盐溶液(ABAP)从西格玛化工有限公司购买(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。类黄酮标准从Solarbio购买科技有限公司有限公司(中国,北京)。磷酸盐缓冲液(PBS), MEM / ebs,胎牛血清的边后卫,青霉素,链霉素从HyClone购买(美国UT Logan)。细胞计数Kit-8从Dojindo获得中国有限公司有限公司(上海,中国)。试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)和过氧化氢酶(CAT)从Beyotime购买生物技术(上海,中国)。

2.2。氧自由基抗氧化能力(ORAC)测定

ORAC试验评估如前所述了曹等人做了一些调整(12,13]。50μL(样品或Trolox萤光素与不同浓度的解决方案是添加到96 -微型板块,这是孵化在37°C 10分钟。然后,50μL(119毫米AAPH(刚做好的)被添加到每个。荧光一代测量使用微型板块读者485海里的激发和发射的520海里每2分钟60周期。ORAC值之间的回归方程,计算了Trolox浓度和曲线下的净面积(表示为μ摩尔Trolox eq /μ摩尔样本)。

2.3。DPPH自由基清除活性

这个试验是如前所述,温家宝等人进行一些修改(14]。DPPH是刚做好的甲醇浓度为0.1毫米。解决方案(20μ包含测试化合物与不同浓度L)添加到DPPH解决方案(180μL)在96 -孔板。板块在37°C孵化30分钟的黑暗,和吸光度值被记录在515海里。的集成电路50值计算对DPPH自由基清除活性。

2.4。细胞的抗氧化活性
2.4.1。细胞抗氧化活性测定(CAA)

英国民航局化验测试如前所述[15]。 细胞/好HepG2细胞被播种在96孔酶标100μL生长介质/。细胞主要是处理100μL(包含测试化合物和DCFH-DA(25的媒介μ米)1 h在37°C。然后,细胞被洗PBS和处理100μL 600年μABAP(溶解在哈佛商学院)和96 -微型板块是立即放入无限SpectraMax i3x多模检测plate-reader在37°C。荧光读数测量在535 nm的发射和激发485海里每5分钟1 h。槲皮素作为积极的控制;欧共体50值表示每100微克分子槲皮素的等价物μ测试化合物的摩尔(μ摩尔QE / 100μ样品的摩尔)。

2.4.2。细胞抗氧化酶的活性决定

HepG2细胞被播种( 细胞/)six-well盘子。孵化24 h后,细胞与不同浓度样品进行预处理。600年中洗了PBS和处理μABAP。这些细胞被收集和处理细胞裂解缓冲(20毫米三羟甲基氨基甲烷在液pH值7.5,150毫米氯化钠和1% Triton x - 100)在4°C。细胞溶解细胞被用来测量细胞内SOD的活动,猫,氧化酶包根据制造商的说明温(2015)。细胞没有样品和ABAP治疗被用作积极控制(PC),同时使用ABAP但没有处理过的细胞样本被用作-控制(NC)。

2.4.3。细胞毒性和抗增殖活性测定

细胞毒性和抗增殖活性测定进行了通过使用CCK-8分析工具(16]。简而言之,HepG2细胞培养密度 细胞/好或 /在96孔酶标细胞生长介质。孵化后37°C,生长介质处理100μL含有不同浓度的生长介质的测试化合物24 h或72 h。井在生长介质没有测试化合物作为控制。然后,细胞孵育10μL / 2 h CCK-8解决方案在37°C。的吸光度值测定在使用标450海里(SpectraMax i3x, ForteBio分析有限公司,有限公司,美国)。测试化合物的细胞毒性活性和抗增殖效果计算 在哪里 与化合物的吸光度; 吸光度的控制。

2.5。统计分析

所有数据了 一式三份分析( )。单向方差分析(方差分析)是用于比较的方法。差异被认为是重要的 。所有使用IBM SPSS 21.0统计软件进行统计分析(美国IBM公司,纽约)。

3所示。结果与讨论

3.1。抗氧化能力
3.1.1。化学抗氧化活性

类黄酮的抗氧化活动评估和DPPH化验。槲皮素,一个著名的抗氧化剂,是作为积极的控制。氧自由基吸收试验是基于荧光探针的氧化(荧光素)自由基来自AAPH的自发分解。氧自由基吸收过程是一个经典的氢原子转移(氧化过程17]。如图1(一),强大的氧自由基吸收能力被观察到在化合物2,4 - 8人,16日,18日- 26日,30日,35-36,38-40,44-45,47岁,49岁,51-52,54岁,是和年度,ORAC值从4.07到12.85不等μ摩尔TE /μ摩尔。化合物,化合物16 ( TE /μ摩尔)被发现拥有过氧化氢自由基清除活性最高,其次是化合物30日,18日,44岁,49岁,60岁( , , , , TE /μ分别为摩尔)。35-36化合物2 4 - 8月22日至23日,26日,38-40,45岁,47岁,51岁,52岁,54,56-59没有显著不同于复合60。ORAC值的化合物1、3、9日至15日,17日,19日,24 - 25日,27 - 29,31-34,37岁,41-43,46岁,48岁,50岁,53岁和55从0.21到3.97不等μ摩尔TE /μ摩尔(图1 (b))。然而,复合19 ( TE /μ摩尔)最低在氧自由基吸收测定抗氧化活动。

(一)
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(d)
图1
类黄酮的抗氧化活动由氧自由基吸收(a、b), DPPH (c)和细胞抗氧化(d)分析。的集成电路50和电子商务50的化合物没有图> 200μm .数据的平均值和标准偏差(SD)三个复制的酒吧。共同的价值观没有字母明显不同( )。中列出的数据表S1。

DPPH实验是基于减少DPPH•在存在hydrogen-donating抗氧化,导致DPPHH形式。测试了类黄酮的DPPH自由基清除活动如图1 (c)。化合物2、7、9 - 11、16、18、23、25 - 28,35岁,39岁,51-52,58和60表现出很强的DPPH自由基清除活性的IC50值从19.13到96.03不等μ米,而化合物1和59 ( , ,)有一个低得多的自由基清除活性。其他人没有抗氧化活性。测试中黄酮类化合物,化合物2,7日,18岁,35岁,52岁和60岁被发现拥有最高的DPPH自由基清除活性( , , , , , ,分别),其次是化合物9 - 11,16日,23日,25 - 28,39岁,51岁,和58岁 , , , , , , , , , , , ,分别。

3.1.2。细胞的抗氧化活性

化学抗氧化剂化验很难准确反映了抗氧化活性在活的有机体内。相对,创新艺人经纪公司的优势分析来模拟细胞生物过程包括吸收、分布和代谢。CAA试验进行了量化分析物的能力,防止形成的DCF AAPH-induced HepG2细胞中过氧化氢自由基。的细胞荧光水平创新艺人经纪公司化验相关DCFH氧化的程度,这表明减少荧光分析物造成的显示了一个细胞抗氧化能力(18]。细胞抗氧化活性的化合物2、5、8、10、13、32首次确定了这项工作。DCFH氧化的动力学HepG2细胞过氧化氢自由基引起的显示在图中2。结果表明荧光的增加抑制了由于DCF形成类黄酮剂量依赖性的方式进行测试。

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(e)
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(f)
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图2
过氧化氢氧化radical-induced DCFH DCF HepG2细胞和抑制氧化的化合物2 (a)、5 (b), 8 (c), 10 (d), 13 (e)和32 (f)随着时间的推移,使用协议没有PBS洗。

欧共体50图中列出的化合物1 (d)。在这项研究中,抗氧化活性的化合物2是一样好积极的参考,EC的槲皮素50是 。欧共体50值的化合物5、8、10、13、和32 , , , ,和 ,分别。

化合物2显示对DCF形成的抑制一个意想不到的影响。化合物1 2、4、5、6、8、10、13日,21日,23日,26日,27日,32岁和34有相似的结构,槲皮素和没有氢氧根存在于颈,颈- 3 ,和c - 5 。结构差异导致明显的变化细胞抗氧化试验。槲皮素(7),化合物2细胞有很强的抗氧化活性。损失,颈 或c - 5 氢氧根细胞抗氧化活性的影响(19]。损失,颈 或c - 5 氢氧根破坏昊图公司二羟基结构,从而降低了因为抗氧化活性昊图公司二羟基多有助于自由基清除效果的类黄酮(20.]。因此,化合物1 (21),化合物4 (22),化合物6 (18),化合物8、13、21日(23),和3424)表现出显著差异从化合物2和7。失去3-hydroxyl一半也减少细胞的抗氧化活性,如所示化合物5,10,2123,2318),26个化合物(25)和32。化合物48 (18,51岁,5226],和60 [18)有强烈活动的羟基的数量。此外,一个额外的5 - - - - - -b环的羟基,如化合物[1818),被发现降低抗氧化活性。的存在O配糖体抗氧化活性降低,所表示的化合物7和27 (25]。

大量细胞抗氧化效果观察化合物2,5,8,10,13显示一致的抗氧化作用存在剂量依赖的相关性。与其他测量方法常用化学抗氧化活性,这种试验已经开发了更多的生物代表协议。抗氧化剂可以作用于细胞膜打破过氧化氢自由基链式反应可以实验在细胞表面或细胞与活性氧反应细胞(19]。膜绑定和细胞吸收的效率是两个重要影响因素的抗氧化活性化学测试。

值得注意的是尽管CAA化验代表一个可靠和具有成本效益的方法来评估潜在的饮食类黄酮生物活性在细胞水平和功能食品发展传达了重要的参考价值,它并不完全反映体内这些化合物的代谢。休多酚的代谢过程在人体内可能是复杂的,因为他们可能会被各种肠道广泛降解和代谢酶和微生物区系。结果饮食类黄酮代谢的产物也会导致生物活性一旦释放到体循环(27]。

3.2。Structure-Antioxidant活动关系
3.2.1之上。羟基

取代基的空间安排更重要比黄烷骨干孤独的抗氧化活性。符合大多数多酚的抗氧化剂,数量和位置b环的羟基的黄酮类化合物大大影响抗氧化活性的机制。特别是,一个3 ,4 - - - - - -邻苯二酚结构b环强烈提高抗氧化活性(28]。创新艺人经纪公司的化验,化合物7(槲皮素),3 ,4 - - - - - -O二羟基集团,最高的电子商务活动50的 。化合物2,5,23日有相同的骨架小一部分差异,活动仅略低于槲皮素。化合物60有强烈活动的羟基的数量。化合物4和40,b环有两个羟基,活动(低得多 ,> 200μ比槲皮素M)。的存在米双酚相比减少一半活动昊图公司配置在前面研究[19]。的存在昊图公司二羟基组b环的稳定的抗氧化性能由于参与电子离域和3之间的氢键 - - - - - -和图4 - - - - - -羟基化(29日]。与槲皮素相比,5 - - - - - -羟基化合物18减少细胞抗氧化活性;然而,DPPH自由基清除活性和活动基本持平。抗氧化活性化合物58-59已经低于复合60。DPPH和氧自由基吸收化验,化合物2,23岁和60显示良好的活动,拥有氢氧根但不受其他群体的影响。58岁的化合物4、5、40至59有良好的活动在氧自由基吸收试验和DPPH自由基清除活性较低,但化合物4和5细胞抗氧化活性好,这说明了其他组织,膜协会和吸收细胞在不同抗氧化剂化验也扮演了重要的角色。galloyl集团的存在高的化合物60的活动在所有化验。这些结果表明,3 ,4 - - - - - -O二羟基集团是一个重要的结构功能创新艺人经纪公司相当大的类黄酮抗氧化活性的测定。这一发现是在与DPPH和氧自由基吸收测定的结果一致。以前的研究也表明,b环苯邻二酚组对高抗氧化活性[至关重要30.,31日]。

3.2.2。C / O-Glycoside O-Methylation

此外,一个额外的C/O配糖体或O -甲基化,化合物1中可以看到,3,上行线,19岁的男性,36岁,41-44,49,56-57,一直显示降低抗氧化活性的prooxidant抵消他们的抗氧化作用32]。化合物上行线,男性,41-44,49,56-57显示细胞抗氧化活性低于苷配基,这表示C/O配糖体减少了抗氧化活性(6]。这一发现是在与DPPH和氧自由基吸收测定的结果一致。由于O -19岁的甲基化组,化合物1,3和36抗氧化活动三个化验。进一步化合物9 - 11,25日,41-44,49,和56-57好氧自由基吸收活动,降低细胞的抗氧化活性,这揭示了细胞的膜协会和吸收程度,由于黄酮类化合物的结构、极性和溶解性。

3.2.3。2、3键,4-Keto集团和3-Hydroxyl一半

为类黄酮b环苯邻二酚组,失去任何c - r基团,2、3键,4-keto集团或3-hydroxyl一半导致降低抗氧化活性(14]。CAA试验,抗氧化活性的化合物5、9、16、23日,28 - 29日,31-32,38-40,53-54和2、3键和4-keto组织减少由于3-hydroxyl损失一半。这一发现是在与DPPH实验的结果一致。然而,2、3键c - r不影响活动的分析。与此同时,2、3键的化合物7,23岁,比3-hydroxyl 39将进一步影响创新艺人经纪公司分析的一部分。最大的区别是类黄酮的ORAC, DPPH,和细胞分析建议模型中的一些化合物并没有如此有效的创新艺人经纪公司,和这个不同的现象提供了信息程度的膜协会和吸收细胞,由于它们的结构,极性和溶解性。

3.3。对细胞内抗氧化酶的影响

生产过剩的活性氧引起的不平衡细胞内的氧化压力,这可能会导致细胞损伤。它是一个慢性疾病的主要因素,包括老化、心血管病、高血压、和神经退行性疾病(33]。ABAP-induced ROS生成可引起细胞内的抗氧化防御系统的失衡,SOD, CAT,主要自由基清除酶和氧化酶。为了进一步测量细胞内类黄酮的抗氧化机制,SOD的活动,猫和氧化酶测定。细胞没有样品和ABAP治疗被用作积极控制(PC),同时使用ABAP但没有处理过的细胞样本被用作-控制(NC)。数据如图3。SOD, CAT,氧化酶数控细胞活动 , ,和 分别为PC细胞。这表明ABAP HepG2细胞氧化应激引起的。然而,预处理细胞与化合物2、5、8、10、13、32 ABAP治疗前阻止抗氧化酶活动的活动减少。细胞使用5μM化合物2,15μM化合物5和8、10μM化合物10、20μ或40 M化合物13日μ32 M复合显示一个微不足道的SOD活性增加,同时显著增加活动被发现在更高浓度相比,数控细胞。同样,化合物2、5、8、10、13、32猫和氧化酶活动增加剂量依赖性的方式。猫的活动是 , ,和 ,和氧化酶活动增加了 , ,和 PC值细胞使用5、10和15μM化合物2。猫的活动是 , ,和 ,和氧化酶活动 , ,和 电脑电池使用价值15日30和45μM化合物5。复合8的猫和氧化酶活动 , ,和 , , ,和 分别为PC值。与此同时,猫活动 , ,和 ,和氧化酶活动 , ,和 PC细胞使用价值10日20日和30日μM化合物10。化合物13相似化合物的百分比值10。然而,复合32的猫和氧化酶活动 , ,和 , , ,和 分别为PC值。创新艺人经纪公司分析的结果是一致的,有更好的细胞活性的化合物;酶活性更高。因此,细胞内抗氧化酶的结构与活性关系是一样的创新艺人经纪公司化验。


图3
率和结构的化合物2 (a、g p)、5 (b、h、q), 8 (c, ir) 10 (d j s), 13 (e、k、t), 32 (f, o, u)的电脑价值抗氧化酶的活动。猫的活动、SOD和氧化酶的PC , ,和 蛋白质,分别。猫的活动、SOD和氧化酶的数控 , ,和 蛋白质,分别。提出了数据的平均值和标准偏差(SD)三个复制的酒吧。共同的价值观没有字母明显不同( )。

一项研究表明,类黄酮可以调节细胞内抗氧化酶的活动。Diosmetin柑橘类水果中的一种生物类黄酮,具有较强的细胞抗氧化活性,能够调节细胞内抗氧化酶活动以防止细胞内ROS的生成,从而有效地减弱AAPH-induced氧化应激在红细胞(34]。紫铆素是从几个孤立的草药,据报道,保护细胞免受H2O2通过恢复活动全身的DNA损伤和细胞抗氧化酶的表达35]。在这个工作中,化合物2、5、8、10、13岁和32可以显著提高SOD的活动,猫和氧化酶。这可能是化合物的抗氧化机制之一。

3.4。细胞毒性和抗增殖活动

HepG2细胞选择确定抗增殖活动和细胞毒性的化合物2,5,8、10、13日和32。如图4,化合物2、5、8、10、13岁和32没有显著影响的范围10 - 160μΜ,而化合物13显示轻微的细胞毒性浓度更高。结果表明,创新艺人经纪公司的减少荧光测定没有细胞毒性。化合物5显示强大的抗增殖活动对HepG2细胞。的集成电路50值是 HepG2细胞,而其他人则超过400人μΜ。


图4
抗增殖活动、细胞毒性和结构的化合物2 (a)、5 (b), 8 (c), 10 (d), 13 (e), 32 (f)对HepG2细胞。提出了数据的平均值和标准偏差(SD)三个复制的酒吧。酒吧没有字母的常见的明显不同( )。

测定细胞的抗氧化剂,化合物5已经被认为是一种良好的抗氧化剂。与此同时,在癌症细胞增殖试验、复合5可以抑制癌细胞的扩散。这个结果表明3-methoxyl组的测试化合物相比,抗增殖活动发挥重要作用的化合物2和536]。它可以减少细胞抗氧化活性,但改善抗增殖活动与癌症细胞。根据文献[确认37,38),O相比,类黄酮苷化通常降低了抗增殖活性的化合物2、10、13岁和32岁。与化合物2,5,8,羟基的颈,颈 ,和8抗增殖活动减少39]。和以前的研究报道,C2-C3双键而缺乏其他羟基是类黄酮的抗增殖活动所需的结构特点(40]。然而,抗增殖活动也受到了其他组的影响。化合物5日报道,可以保护正常的肺细胞H2O2全身的活性氧的形成,膜损伤,和DNA损伤。与此同时,它也增加了表达p-p38, Nrf2, SOD (41]。所有这些结果提出了一个潜在的应用在抗癌药物和化妆品类黄酮。

4所示。结论

一系列的类黄酮与不同的结构被用来确定其化学和细胞内抗氧化活性,其中化合物的细胞抗氧化活动2,5,8、10、13日首次和32是识别和特征在这工作。化合物2和5的带来了意想不到的细胞抗氧化行为,一个数量级的槲皮素。他们的细胞内抗氧化相关upregulation内源性抗氧化酶的活动和抑制ROS的生成。2、3键,4-keto组,3 ,4 - - - - - -邻苯二酚结构,3-hydroxyl在抗氧化剂类黄酮骨架扮演重要角色的行为。此外,细胞增殖试验揭示了细胞毒性化合物5。因此,化合物5适合于在未来使用营养食品。

数据可用性

所有生成的数据或分析在本研究中包括这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Q.Z. Z.J.并概念化;Q.Z.和W.Y.方法论;Q.Z. J.L.被分配在软件;Q.Z.上半叶并验证;Q.Z.做正式的分析;Q.Z.调查;Q.Z.,Z.L., C.Z., and D.C. was assigned on the resources; Q.Z. and W.Y. did the data curation; Q.Z. wrote the original draft preparation; Z.J. did the writing, review, and editing; Q.Z. did the visualization; Z.J. did the supervision; Z.J. did the project administration; Q.Z. and Z.J. did the funding acquisition.

确认

作者要感谢宝杨校对的手稿。这项工作是支持的农业科技创新项目的中国农业科学院(CAAS-ASTIP-ZFRI)和河南省的关键科学和技术项目(202102110209)。

补充材料

表S1: 60类黄酮的抗氧化活动取决于DPPH,氧自由基吸收和创新艺人经纪公司化验。(补充材料)