文摘

耐火材料的伤口是一个可怕的并发症的糖尿病和与EPC功能障碍引起的高血糖高度相关。阿卡波糖是一种广泛使用的口服降糖药物专门为2型糖尿病。以往进行的调查显示,阿卡波糖的有益作用改善内皮功能障碍患者2型糖尿病。然而,没有数据已报告在伤口愈合障碍阿卡波糖的有益功效由糖尿病引起的。这里我们研究阿卡波糖是否能改善伤口愈合2型糖尿病db / db老鼠和可能的机制。阿卡波糖加速伤口愈合和增强血管生成,伴随着循环EPC数量增加db / db老鼠。观察体外,逆转BM-EPC障碍后,政府的阿卡波糖db / db老鼠,反映在管形成试验。此外,显著增加生产也见证了BM-EPCs从阿卡波糖治疗db / db老鼠,与降低O2的水平。Akt抑制剂可以废除的有益作用阿卡波糖高葡萄糖体外诱导EPC障碍,伴随着以挪士激活降低。阿卡波糖显示潜在影响在促进伤口愈合和改善2型糖尿病小鼠的血管生成,这可能是与以挪士/ Akt信号通路有关。

1。介绍

糖尿病(DM),特点是高血糖会导致许多严重的并发症包括心血管疾病、肾衰竭,开始下肢截肢(1]。伤口愈合,尤其是深受糖尿病(2,3),一直得到广泛的研究。已经表明,糖尿病患者表现出减少伤口愈合能力,更容易受到发展严重的慢性足部溃疡,这非常影响病人的生活质量(4,5]。因此,当务之急是探索有效的治疗方法,阐明底层机制的征服diabetes-induced受损的伤口愈合。

人们普遍认为内皮功能障碍在血管疾病是至关重要的,受损的伤口愈合的主要因素6,7]。内皮前体细胞(epc),不成熟的内皮细胞,引起了巨大的关注由于其分化为成熟内皮细胞的能力8,9),进而导致内皮再生和新血管形成10]。临床研究发现降低循环内皮祖细胞的数量和功能障碍的这些细胞在糖尿病患者11,12]。因此,EPC障碍和内皮再生的顺向异常可能影响下受损受伤治疗糖尿病的易感性。

阿卡波糖,α葡糖苷酶抑制剂(AGI),是一种常用的口服降糖药物治疗的2型糖尿病(T2DM)病人体内13,14),可以抑制碳水化合物转化成单糖的从而抑制肠道吸收,这样体内碳水化合物的生物利用度下降,血糖水平显著降低(15]。餐后的血糖激增可能会导致严重的内皮功能障碍在糖尿病患者16- - - - - -18]。临床研究表明,阿卡波糖改善内皮功能、减少管理的二型糖尿病患者心血管事件的风险(19- - - - - -21]。然而,到目前为止,有限的信息之间的联系阿卡波糖和伤口愈合,和阿卡波糖的直接影响高葡萄糖EPC功能受损。

基于这些发现,我们假设阿卡波糖可能通过提高EPC diabetes-induced加速伤口愈合功能。为了验证这个假设,本研究试图确定阿卡波糖对伤口愈合和内皮祖细胞的影响db / db糖尿病小鼠。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性C57BL /科小鼠和人。Cg-m + / + Lepr / Jdb/db老鼠(db/db)与C57BL /科背景中英买来SIPPR / BK实验室动物有限公司(上海,中国)。老鼠保持microisolator笼子在12 h与控制温度(光/暗周期 °C)和湿度(大约70%)和接收一个标准实验室颗粒随意饮食和水。所有动物都是按照机构照顾动物保健指导和指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院。详细的基因分型方法识别鼠标瘦素受体突变(C57BL / KsJ-db / db)中所描述的数据补充在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/7809581。

2.2。试剂和抗体

阿卡波糖从Sigma-Aldrich获得。Akt抑制剂mk - 2206 2 hcl是来自塞莱克(上海,中国)。兔子anti-Akt(猫。4691号),anti-phosphorylated Akt (Ser473猫。4060号),anti-endothelial一氧化氮合酶(以挪士,猫。9572号),anti-phosphorylated-eNOS (Ser1177猫。9571号)单克隆抗体购自细胞信号技术(马、美国)。鼠标anti-GAPDH(猫。No.AG019)单克隆抗体购自Beyotime(上海,中国)。二次抗体包括山羊anti-rabbit抗体IgG-HRP和山羊anti-mouse IgG-HRP买来EarthOx(美国)。

2.3。试验协议

C57BL / 6 j小鼠被用作控制。血糖监测在表示时间使用血糖监测系统(猫场、台北、中国)和全血经尾静脉的老鼠。22天,小鼠血糖水平大于250 mg / dL被定义为db / db糖尿病小鼠和随后与阿卡波糖治疗(50毫克/公斤/天,专营。CMC-Na)治疗或车辆(0.5%)连续14天。控制老鼠收到车辆。36天,老鼠用于伤口愈合实验或麻醉获取骨髓分离BM-EPCs(图1)。


图1
实验进度。的血糖db / db糖尿病小鼠监控每7天到21天;然后阿卡波糖(50毫克/公斤/天,专营。)治疗进行了连续14天。最后,伤口愈合模型创建和收集BM-EPCs。
2.4。分析的伤口愈合和血管生成

与氯胺酮麻醉后(100毫克/公斤,i.p。),小鼠固定,无毛绒的背,擦洗betadine和75%乙醇(三倍22]。6毫米圆形伤口是由打孔切片,和受伤的关闭区域测量每2天到第14天使用清晰、bioclusive透明敷料(美国强生,阿灵顿,TX)。拍摄的伤口面积计算与Image-Pro +软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。

血管生成和SDF-1的评估α检测进行使用CD31和SDF-1α免疫化学和苏木精(美国宾夕法尼亚州VWR科学、二)染色(23,24]。短暂,穿孔皮肤活检在受伤区域进行天7和14。固定的皮肤样本嵌入石蜡deparaffinization和补液紧随其后。沉浸在Tris-buffered盐水(pH值7.5)后5分钟,幻灯片受到阻断内源性过氧化物酶。与血清阻断后30分钟(向量实验室,伯林盖姆、钙、美国),幻灯片是孵化anti-CD31抗体(10μ50 g / ml, 1:;美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学、)和SDF-1α(1:50;Abcam,剑桥,妈,美国)在室温下60分钟后跟额外孵化与生物素化的二次抗体(anti-mouse免疫球蛋白,Vectastain精英ABC工具包,矢量实验室)30分钟,Vectastain精英ABC试剂(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) 30分钟,Nova红(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) 15分钟。然后,幻灯片和苏木精复染色前10秒分化在1%水冰醋酸,在运行自来水冲洗。毛细血管被描绘成CD31-positive管状结构,毛细血管密度受伤的区域被量化。每个幻灯片的老鼠是检查,每个幻灯片,两个大功率字段(200 x)测定。数据总结和平均每大功率领域毛细血管。

2.5。循环内皮祖细胞测量

血液样本收集大约0.5毫升的麻醉老鼠,然后放置在肝素管预处理[25]。后与PBS(1: 1)混合,1083毫升的梯度离心液体(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到稀释血液样本随后离心(3000 rpm)在室温下了25分钟。单核细胞分数被转移到一个新的包含红细胞裂解管缓冲溶液为5分钟。离心分离和洗涤后,细胞悬浮在含有FITC-Sca-1缓冲溶液(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)和PE-Flk-1(美国BD,圣何塞,CA)抗体的孵化1 h在室温下。Sca的循环内皮祖细胞+Flk-1+使用流式细胞仪分析细胞被发现。

2.6。BM-EPC提取

老鼠骨骨髓来源的内皮祖细胞(BM-EPCs)是根据前面的方法提取并培养(26]。

管形成分析。七天后BM-EPC文化、细胞使胰蛋白酶化和收集。总共3×104细胞种植在96孔板预镀在增长因素基底膜基质(美国BD生物科学,贝德福德,MA)其次是孵化6 h在37°C。在时间的尽头,管倒置相差显微镜下观察(徕卡微系统公司位于德国)。管得到的图像从五个随机选择的微观领域(50 x) /样品,和BM-EPCs决心的新血管形成。

迁移分析。总共5×104内皮祖细胞在上部腔体镀24-well Transwell板块(康宁Transwell,洛厄尔,MA)。介质包含VEGF (50 ng / ml)放置在较低的钱伯斯紧随其后的孵化24小时37°C。然后,细胞与2%多聚甲醛固定和染色Hoechst33258 (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。染色细胞荧光显微镜下观察。

附着力试验。细胞浓度的5×105/毫升96 -孔板镀涂有老鼠vitronectin 1μ克/毫升。孵化2 h后,不依从细胞被洗PBS和贴壁细胞和2%多聚甲醛固定。细胞染色Hoechst33258和被数在5随机低功耗(50 x)每个样本微观领域。

2.7。BM-EPC函数的分析

管的形成、迁移和粘附的化验BM-EPCs被用于评估BM-EPC血管生成能力(26,27]。BM-EPC文化,7天后,细胞使胰蛋白酶化和收集。总共3×104细胞种植在96孔板预镀在增长因素基底膜基质(美国BD生物科学,贝德福德,MA)其次是孵化6 h在37°C。在时间的尽头,管倒置相差显微镜下观察(徕卡微系统公司位于德国)。管得到的图像从五个随机选择的微观领域(50 x) /样品,和BM-EPCs决心的新血管形成。

2.8。测量细胞内没有

细胞内没有检测到水平(如前所述)(26]。简单,经过7天的培养,BM-EPCs收集和孵化10−6M DAF-FM二乙酸(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 30分钟在37°C和额外的染色在室温下30分钟的黑暗。孵化后,DAF-FM荧光强度也取决于流式细胞术分析。

在细胞内 检测,细胞被收集和孵化为0.5×10−6M dihydroethidium(她表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)在室温下30分钟的黑暗。孵化后,她通过流式细胞术分析荧光强度决定(26]。

2.9。免疫印迹分析

蛋白质提取并决定按照先前技术(28,29日]。总之,蛋白质样本从BM-EPCs获得并使用BCA进行量化分析(美国热科学,罗克福德,IL)。总共30μg样本运行在10% sds - page和electrotransferred硝化纤维膜。膜在5% BSA / PBST然后孵化1 h在37°C阻止非特定的绑定。冲洗后,膜是孵化主要抗体一种蛋白激酶,p-Akt,以挪士或p-eNOS(美国细胞信号技术,贝弗利,MA)其次是染色IRDye 800 cw-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(1:5000;Li-Cor生物科学,林肯,美国东北)。红外荧光图像的特定蛋白质带观察使用一个奥德赛红外成像系统(美国东北Li-Cor生物科学,林肯)和量化的数量一个软件(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.10。体外试验

BM-EPCs被获得db / db和C57BL / 6小鼠体外培养。七天后,培养基是改变了刚做好的高葡萄糖(33毫米)中或高葡萄糖中包含阿卡波糖(1μ米)24 h,阿卡波糖(1μ米)和mk - 2206 (Akt抑制剂;1μ米),或者高葡萄糖中包含两个阿卡波糖(1μ米)和mk - 2206 (1μ米)。阿卡波糖对高glucose-induced EPC障碍的影响进行评估的功能分析(管形成),通过检测细胞内没有 的变化。一种蛋白激酶激活,以挪士是由免疫印迹分析。

2.11。统计分析

所有的数据都表示为±标准差的手段。统计学意义分析了单向方差分析后跟Newman-Keuls使用GraphPad棱镜多重比较测试软件版本5。 值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。阿卡波糖对血糖和体重的影响db / db老鼠

血糖明显增加db / db老鼠与控制( ;图2(一个))。阿卡波糖管理后,相比db / db小鼠血糖水平略,但显著降低( 与 mg / dL, ;图2 (b))。的体重没有明显区别db / db老鼠有或没有阿卡波糖治疗(图2 (c))。

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图2
血糖和体重变化db / db老鼠。(一)血糖显著增加db / db老鼠比控制。 与控制。在db / db老鼠,阿卡波糖治疗(50毫克/公斤/ d×14 d,专营。)显著降低血糖(b)但没有修改体重(c)。 和反对; 与db / db。值表示为平均值±标准偏差( 每组)。案子,控制;Aca,阿卡波糖。
3.2。阿卡波糖加速伤口愈合,增加血管生成db / db老鼠

糖尿病患者的伤口愈合能力明显受损db / db老鼠与控制( ;图3(一个))。然而,伤口愈合的进程明显加速acarbose-treated老鼠相比db / db动物( ;图3(一个))。此外,伤口周围血管生成评估在天7和14后伤口创造。发现毛细血管密度显著降低糖尿病db / db老鼠与控制。天7和14阿卡波糖治疗后,与之相比db / db老鼠,毛细血管密度显著增加( ;数据3 (b)和3 (c))。此外,SDF-1α免疫组织化学显示增加染色acarbose-treated伤口网站相比db / db老鼠(图3 (d))。这些结果表明,阿卡波糖政府能够改善糖尿病大鼠伤口愈合障碍和增加血管生成。

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图3
阿卡波糖治疗加速伤口闭合和增强血管生成db / db老鼠。大约6毫米直径圆伤口是由打孔切片背和伤口愈合评估每2天到第14天。(一)阿卡波糖治疗明显加速伤口关闭db / db老鼠相比,未经治疗的糖尿病。(b)阿卡波糖治疗显著增加伤口毛细血管与未经处理的db / db老鼠在7和14天。(c)的典型照片CD31染色在7和14天;红色箭头指向CD31-positive毛细血管;盒装地区(100 x;比例尺= 100μ米)显示在较高放大(200 x;比例尺= 50μ米)。 , , 和反对; , 与db / db。(d) SDF-1α表达伤口网站目前主要在acarbose-treated组7天;红色箭头显示正面棕色SDF-1染色α;比例尺= 50μm。值表示为平均值±标准偏差( 每组)。案子,控制;Aca,阿卡波糖。
3.3。阿卡波糖增加循环EPC数量和提高EPC函数db / db老鼠

循环内皮祖细胞的数量和功能BM-EPCs水平显著降低db / db老鼠相比,控制。阿卡波糖治疗增加了循环EPC号码( 与 %, ;图4(一))和改进的EPC功能受损(管形成能力: 与 , ;图4 (b))db / db与未经处理的小鼠相比db / db的人。此外,细胞内没有降低和水平 生产更大db / db老鼠相比,控制。阿卡波糖治疗显著纠正这些变化db / db老鼠(没有: 与 , ,图4 (c); : 与 , ,图4 (d))。

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图4
阿卡波糖治疗改善BM-EPC功能和减少细胞内活性氧(ROS)水平db / db老鼠。(一)循环EPC号码被流式细胞术检测和本来的百分比+/ Flk-1+细胞进行了计算。阿卡波糖循环EPC数量显著增加db / db老鼠。(b) BM-EPCs的典型管形成的图像分析。管在每个样本的数量从5低功耗计算字段(50 x;比例尺= 100μ随机m)。阿卡波糖的能力增强管BM-EPCs的形成。(c)细胞内没有水平取决于流式细胞术和DAF)荧光强度的百分比计算。阿卡波糖明显增强BM-EPCs没有水平。(d)她荧光强度是由流式细胞术。阿卡波糖抑制细胞内 在BM-EPCs水平。 , , 和反对; , , 与db / db。值表示为平均值±标准偏差( 每组9)。案子,控制;Aca,阿卡波糖。
3.4。阿卡波糖增加Phosphorylated-eNOS和Phosphorylated-Akt表达内皮祖细胞db / db老鼠

免疫印迹进行确定p-Akt, Akt, p-eNOS,以挪士糖尿病大鼠内皮祖细胞中表达。与控制相比,发现p-Akt / Akt的比率和p-eNOS /以挪士在内皮祖细胞在显著降低db / db老鼠。阿卡波糖管理导致Akt显著增加( 与 , ;图5(一个))和以挪士( 与 , ;图5 (b))激活内皮祖细胞db / db与未经处理的小鼠相比db / db老鼠。

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图5
阿卡波糖刺激激活一种蛋白激酶的表达水平/在BM-EPCs以挪士db / db老鼠。分离、培养BM-EPCs从麻醉老鼠。Akt和以挪士BM-EPCs进行免疫印迹,和阿卡波糖大大增强Akt激活和以挪士BM-EPCs从表达式db / db老鼠。 , 和反对; 与db / db。值表示为平均值±标准偏差( 每组)。案子,控制;Aca,阿卡波糖。
3.5。阿卡波糖减轻功能障碍引起的BM-EPCs高葡萄糖

调查是否高葡萄糖是直接因素诱导EPC功能障碍在糖尿病小鼠和阿卡波糖能够阻止这种变化,高葡萄糖用于体外诱导EPC受伤。发现管的能力形成BM-EPCs被高葡萄糖受损。阿卡波糖(1μ米)治疗明显提高EPC功能受损( 与 , ;图6(一))。如数据所示6 (b)和6 (c)高葡萄糖没有降低,增加引起的 水平与对照组相比,由阿卡波糖治疗逆转不: 与 , ,图6 (b); : 与 , ,图6 (c))。此外,高葡萄糖减少p-Akt / Akt和p-eNOS /以挪士比,和阿卡波糖治疗阻止这些变化(p-Akt / Akt: 与 , ,图6 (d);p-eNOS /以挪士: 与 , ,图6 (e))。

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图6
阿卡波糖缓解EPC功能障碍,降低ROS的表达,增加一种蛋白激酶/以挪士phosphorylated-to-total比例BM-EPCs引起高葡萄糖。BM-EPCs正常小鼠中分离培养在高葡萄糖(33毫米)与阿卡波糖(1μ米)24 h。(一)评估管形成的能力。(b)细胞内没有水平取决于流式细胞术和DAF)荧光强度的百分比计算。(c)细胞内她用流式细胞术测定内皮祖细胞的荧光强度。免疫印迹分析受到检测到表达水平的激活一种蛋白激酶(d)和以挪士在高葡萄糖引起的内皮祖细胞(e)。 , , 和反对; , 对HG。值表示为平均值±标准偏差((a)、(b) (c): 每组;(d), (e): 每组4)。比例尺= 100μm。案子,控制;汞、高葡萄糖;Aca,阿卡波糖。
3.6。mk - 2206在内皮祖细胞体外预防阿卡波糖的作用

去了解阿卡波糖介导的可能机制影响内皮祖细胞在高葡萄糖体外,mk - 2206年p-Akt抑制剂(30.),使用。发现mk - 2206年废除了提高EPC函数由阿卡波糖(管形成能力: 与 , ,图7(一);迁移: 与 , ,图7 (b);粘连: 与 , ,图7 (c))。此外,mk - 2206没有的变化和预处理预防 由阿卡波糖(没有: 与 , ,图7 (d); : 与 , ,图7 (e))。这些研究结果表明,阿卡波糖的有益的作用可能是通过一种蛋白激酶/以挪士信号通路。

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图7
阿卡波糖改善EPC功能和抑制细胞内ROS水平通过Akt通路体外的依赖。阿卡波糖(1μ米)和p-Akt抑制剂和mk - 2206 (1μ米)被添加到高葡萄糖中24 h。测量管形成的(a),迁移(b)和附着力(c) BM-EPCs的能力。测定细胞内没有(d)和水平 级别(e)。 , , 。值表示为平均值±标准偏差((a)、(b) (c): 每组;(d), (e): 每组)。比例尺= 100μm。案子,控制;汞、高葡萄糖;Aca,阿卡波糖;可,MK - 2206。

4所示。讨论

我们显示在当前研究的主要发现是,(1)阿卡波糖加速伤口愈合和刺激血管生成在2型糖尿病,伴随着改善BM-EPC功能(包括管的形成、迁移和附着力)和增加生产减少 在BM-EPCs生产;(2)体外,阿卡波糖改善高glucose-mediated EPC障碍和增强细胞内没有水平,阻碍了增加 ;和(3)阿卡波糖的有利影响是介导至少部分通过激活以挪士/ Akt信号。

伤口愈合是一个复杂的病理生理过程对组织损伤,其中包括一连串的交互各种细胞类型,生长因子,细胞因子和其他分子(31日]。DM患者通常有延迟伤口愈合和血管机能不全与内分泌紊乱(3]。此外,慢性糖尿病人容易发展耐火材料足溃疡,一个重要的公共健康问题负责开始下肢截肢(32]。血管生成的过程中起关键作用恢复组织的完整性,在内皮细胞的前体细胞,特别是内皮祖细胞,形成新的血管(涉及25,31日]。然而,血管生成的机制仍有待阐明的一个重要障碍。

阿卡波糖,如美国国际集团,是最安全的抗糖尿病的药物可用,这是常用的治疗或预防2型糖尿病33]。发现阿卡波糖可以作为保护,减少内皮损伤引起的高血糖,从而有助于改善心血管结果(34]。其他血糖过低的代理,如双胍类,dipeptidyl肽酶4 (DPP-4)抑制剂,和thiazolidinediones噻唑烷二酮类),也被证实改善糖尿病引起的内皮功能障碍(17,22,35]。在这项研究中,我们发现,阿卡波糖导致药理管理显著改善糖尿病相关受损的伤口愈合和减少EPC损伤在糖尿病db / db老鼠。

正如上面提到的,内皮祖细胞,内皮细胞内稳态的关键驱动和再生,可以回家缺血性组织和发挥重要作用在血管发生和血管内稳态36- - - - - -38]。重要的是,本地和epc系统的管理可以显著改善血管再生和伤口愈合25]。这些证据表明,提高EPC功能和增加循环EPC数量可能扮演至关重要的角色在糖尿病血管并发症患者抗糖尿病的治疗与某些血糖过低的代理。我们观察到,在我们的工作中,阿卡波糖治疗诱导显著增加循环内皮祖细胞和细胞功能显著改善(管形成)db / dbmice-derived内皮祖细胞和体外高葡萄糖刺激内皮祖细胞。这些结果表明,局部血管生成的EPC障碍和随后的增量在受伤区域,在这项研究中,观察到可能至少部分归因于糖尿病加速伤口愈合db / db老鼠由阿卡波糖治疗。

已经表明,以挪士批判性调节EPC函数,和减少细胞内没有和增加细胞内 可能代表一个主要机制EPC功能障碍(29日,39- - - - - -41]。此外,eNOS-derived没有生产的损失被公认为EPC损伤的主要原因(38]。先前的研究已经报道,以挪士,丝氨酸/苏氨酸激酶Akt的上游效应以挪士激活内皮细胞(42- - - - - -45]。有趣的是,它已经证明,糖尿病大鼠美联储与阿卡波糖显示改善Akt激活脂肪细胞引起的胰岛素(46],也观察到类似现象在心脏组织的acarbose-treated肥胖大鼠(47]。因此,它很容易推测可能以挪士/ Akt信号通路可能参与保护阿卡波糖对内皮祖细胞的影响。我们观察到,在目前的研究中,阿卡波糖治疗诱导显著增加以挪士的活化和细胞内没有水平,随之减少细胞内 的水平。此外,磷酸化Akt在BM-EPCs来源于显著抑制db / db老鼠与对照组相比。相应地,一个重要的区别之间的观察p-eNOS水平db / db组和对照组。体外,高葡萄糖诱导显著内皮祖细胞功能障碍伴有细胞内没有降低,增加 的水平。然而,阿卡波糖治疗预防上述变化,一种蛋白激酶抑制mk - 2206减少阿卡波糖高glucose-induced EPC损害的保护作用。这些结果表明,阿卡波糖可以保护糖尿病引起的EPC障碍通过激活一种蛋白激酶/以挪士信号通路。

总之,我们的结果表明,伤口愈合,血管生成,EPC功能受损db / db老鼠。阿卡波糖治疗可以逆转上述病理变化,这可能是与以挪士/ Akt通路有关。还需要进一步的研究来更好地理解这个阿卡波糖产生的有益影响的机制管理。

缩写

糖尿病: 糖尿病
2型糖尿病: 2型糖尿病
内皮祖细胞: 内皮前体细胞
BM-EPCs: 骨marrow-endothelial前体细胞
SDF-1 : 基质衍生因子- 1α
没有: 一氧化氮
: 过氧化物
以挪士: 内皮细胞一氧化氮合酶
美国国际集团: 葡糖苷酶抑制剂。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

韩雪和yap邓小平进行了研究和写的手稿。Jiawen Yu Yuannan阳光、任Guofei剑Cai, Jianjun朱镕基进行研究和/或导致数据分析和解释。江Guojun设计研究,解释数据,获得资金,监督这项研究,并回顾了手稿。所有作者批准了最终版本。韩雪和yap邓小平是相等的贡献者。

确认

本研究自然科学基金支持的浙江(拨款20131813样子,20130733 q41,和20150633 b58)。

补充材料

完整的识别方法描述鼠标瘦素受体突变通过PCR分析。

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