文摘

氧化应激被认为是一个重要的中介在老年性白内障的发病机制;使用抗氧化补充剂是一个合理的策略对氧化应激保护抗氧化防御系统。胃促生长素政府预计将减少ROS,防止不同疾病的发病。饥饿激素的作用,如果有的话,在防止氧化应激HLECs从来没有检查。在目前的研究中,我们调查的影响胃促生长素对H2O2全身的氧化应激和相关的分子机制在HLECs和老鼠镜片。结果表明,预处理与胃促生长素减少H2O2全身的细胞凋亡和活性氧积累,增加SOD和CAT的表达水平,降低MDA的表达水平。形态学检查表明,ghrelin-treated透镜机关文化保持透明度。这是第一个报告显示胃饥饿素可以防止HLECs H2O2全身的氧化应激。我们的研究表明,胃促生长素可以预防白内障的进展,为眼科医生治疗价值。

1。介绍

氧化应激被认为是一个重要的中介在老年性白内障的发病机制;人们普遍公认的状态失衡prooxidants和抗氧化剂1,2]。过度生产活性氧(ROS)中发挥着重要作用的破坏正常晶状体上皮细胞的功能(3,4]。过氧化氢(H2O2),nonradical活性氧家族的成员,是一个主要的细胞内ROS和积累大量的镜头5]。多项研究表明,自由基和活性氧可以影响人类晶状体上皮细胞的生长和功能(HLECs) [1,2,5]。我们之前的研究已经发现,ROS产生的H2O2导致蛋白质降解和上皮细胞破坏而言伤害的伤害中发现人类白内障(6,7]。

白内障,视力残疾的主要原因在全球范围内,是一种蛋白质构象的疾病,其特征是氧化破坏蛋白质的聚合(8]。晶状体蛋白质氧化是一个主要的风险因素在白内障formation-any外部侮辱或受损蛋白质降解不足可能会影响抗氧化状态的镜头,导致不透明1,2,7]。

使用抗氧化补充剂是一个合理的策略来保护抗氧化防御系统对氧化应激(9]。虽然手术治疗白内障,有无数的术后并发症;此外,一些地区缺乏必要的手术器械和面临短缺的医生可以满足大量的患者的医疗需求。这些因素限制了可用性白内障手术。没有有效的治疗药物来阻止形成洪流的镜头;因此,有必要开发一种药理干预改善镜片透明度和延缓白内障的发展。

生长激素释放肽,28-amino-acid内源性肽,主要从胃粘膜分泌10]。小肠的成绩单也被发现,胰腺、肝脏、胎盘,心脏,肺,中枢神经系统(CNS)和肾脏,暗示其extraendocrine以及内分泌行动。研究表明生长素展品有利cytoprotective效应对氧化应激(11]。它可以消除活性氧和活性氮物种(rns)通过提高抗氧化酶的表达和直接清除自由基12]。胃促生长素政府预计将减少ROS,预防各种疾病的发生。饥饿激素的作用,如果有的话,在防止氧化应激HLECs从来没有检查。在目前的研究中,我们调查的影响胃促生长素对H2O2全身的氧化应激和相关的分子机制在HLECs和老鼠镜片。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

胃饥饿素从σ购买化学(圣路易斯,密苏里州,美国)和溶解在二甲亚砜(DMSO)(σ,圣路易斯,密苏里州)。胎牛血清(的边后卫)和杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)获得Gibco(美国纽约大岛)。中199年获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。膜联蛋白V-FITC和propidium碘(π)正欲从(美国加利福尼亚州山景城)。(3)- 4 5-dimethyl-2-thiazolyl 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)和H2从Beyotime DCFDA得到(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)。Anti-SOD, anti-CAT, anti-MDA抗体购自圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯、钙、美国)。SOD, CAT, MDA比色包购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。

2.2。细胞培养和治疗

HLECs(写明ATCC,美国)在DMEM培养heat-inactivated (56°C, 0.5 h)的边后卫(15%)、100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升湿润5%股份有限公司2在37°C。这些细胞被经常亚文化每2 - 3天。当融合增长到70%,他们表示浓度处理的H2O224小时或用不同浓度激素预处理前12 h h2O2治疗。

2.3。细胞生存能力分析

这些细胞被镀在2×10的密度4细胞/在96孔培养板和孵化0,50岁,100年,200年、400年和800年μM H2O224 h后单独或与不同浓度激素预处理(10−9-10年−6米)12 h。培养基被删除,和细胞生存能力是衡量使用MTT方法如前所述[13]。

细胞的形态学变化,在倒置显微镜下观察(奥林巴斯CK-30、东京、日本)。

2.4。细胞凋亡检测

膜联蛋白V-FITC / PI染色被用来量化细胞凋亡的数量。细胞被镀和孵化six-well板1×106细胞/好,有或没有不同浓度激素预处理12 h, 100年之后,他们对待μM H2O224 h。这些细胞被收集并沾膜联蛋白V-FITC /π绑定缓冲在黑暗中在室温20分钟。染色细胞使用流式细胞仪系统进行分析。

2.5。细胞荧光染色法和H2DCFDA

细胞内ROS水平检测,并且采用H2DCFDA。10的细胞被孵化μM H2DCFDA为20分钟37°C,然后用PBS洗两次。DCF检测到的荧光强度使用荧光显微镜(4000年徕卡DMI,德国)。

2.6。镜头器官培养

老鼠的眼睛(哈尔滨医科大学、哈尔滨、中国)被移除并放置在哺乳动物生理盐水prewarmed 37°C。新鲜提取透明镜片是孵化199年中含有50毫克/毫升庆大霉素和0.1% BSA有限公司为5%2在37°C。镜片是治疗胃促生长素浓度的10−9-10年−6M 24 h在37°C。中被改变,100年μM H2O2添加到中等6 h。镜头立体显微镜下观察和拍摄的背景下,黑色网格线来记录不透明度的发展。

2.7。抗氧化剂酶含量测定

整个镜头被移除的眼睛,用提取缓冲。离心后,上清液用于测试根据分析制造商的指示。总SOD含量测定spectrophotometrically在550 nm,结果被表示为U·毫克−1蛋白质(14]。MDA测定参照MDA测定装备使用硫代巴比土酸方法(15]。结果表示为U·毫克−1,由此产生的粉红色的强度在532海里。猫内容化验使用钼酸铵的方法根据猫的指令分析工具(16]。结果表示为U·毫克−1,淡淡的黄色复合物被发现在405海里。

2.8。免疫印迹分析

镜头从每组用生理盐水洗净干滤纸,用Vannas剪刀,然后在冰。组织是在一个冷冻离心机在1000 r / min 10分钟,和上层的细胞溶解在冰上的20分钟radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒和离心机,享年12000岁 20分钟。总蛋白(30μg)受到10 - 15% sds - page和转移到一个聚乙二烯二氟化物膜。抗体SOD的污点是孵化,猫,和MDA。酶是使用辣根peroxidase-conjugated二级抗体。增强化学发光是用来检测免疫反应性的乐队,和ImageJ软件(Java)图像处理和分析被用来量化结果。正常化后个人actine水平,比目标蛋白的表达。每个实验重复三次。

2.9。统计分析

统计分析进行了使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。所有的值表示为平均值±标准平均误差(SEM)从至少三个独立的实验。的重要性两两组学生的评价t以及。两组以上的比较,采用单向方差分析; 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。H的影响2O2和胃促生长素HLECs的可行性

如图1(一),饥饿激素对HLECs没有表现出任何细胞毒性的影响。H2O2受损细胞的生存能力在剂量依赖性的方式(图1 (b))。治疗浓度为100μΜH2O224 h被选为后续实验,因为它减少了细胞生存能力与对照组相比大约49.12%(细胞治疗h2O2)。HLECs的预处理与胃饥饿素显示保护作用存在剂量依赖的相关性对H2O2损伤(图1 (c))。图1 (d)显示HLECs的形态学变化。对照组显示正常细胞形态学和常规的细胞与完整的连接。H2O2治疗组显示收缩的细胞异常形状,和细胞之间的距离增加;然而,与胃饥饿素预处理抑制H2O2破坏细胞的形态。

(一)
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(b)
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图1
胃促生长素在细胞的可行性的影响2O2对待HLECs。(一)HLECs孵化与不同浓度的生长素(10−9-10年−6米)24 h。(b) HLECs孵化与不同浓度的H2O2(50 - 800μ米)24 h。(c) HLECs preincubated胃促生长素(10−9-10年−6为前12 h M)与100年接受治疗μM H2O224 h。通过MTT测定细胞生存能力评估。(d) HLECs被显微镜检测。结果表示为均值±SEM ( )从三个独立的实验。α 与未经处理的对照组相比,; , ,而H2O2治疗组。
3.2。胃促生长素抑制H诱导细胞凋亡2O2

细胞凋亡率量化使用流仪分析了双重染色膜联蛋白V-FITC和π。增加观察凋亡细胞的H2O2治疗组,而胃饥饿素预处理降低了细胞的凋亡率H2O2(图2(一个))。这积极的影响观察胃促生长素浓度的方式(图2 (b))。

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图2
胃饥饿素阻止H2O2在HLECs全身的细胞凋亡。HLECs preincubated胃促生长素(10−9-10年−6为前12 h M)与100年接受治疗μM H2O224 h。(一)细胞凋亡HLECs流式细胞仪探测到。结果表示为均值±SEM ( )从三个独立的实验。(b) HLECs胃饥饿素显著降低细胞凋亡率。α 与未经处理的对照组相比,; , ,而H2O2治疗组。
3.3。胃促生长素减少HLECs ROS的生成

正如预期的那样,有一个缺乏染色H2O2无对照组(图3)。HLECs,只有接触到H2O2亮绿色的颜色,表明ROS水平有显著增加。细胞内活性氧的增加在剂量依赖性的方式阻止与胃饥饿素预处理。这一发现表明,生长素可以防止细胞内ROS的生成与H HLECs挑战2O2。


图3
胃促生长素对H2O2全身的代HLECs ROS。细胞治疗的100μM H2O2孵化后24小时没有或存在激素12 h。然后,ROS的产生决定使用10μM H2DCFDA。细胞的形态学特征使用荧光显微镜观察。
3.4。级配镜片

我们开发了一个器官培养实验检查镜片上的饥饿激素的影响。形态学观察证实,镜片孵化在胃促生长素减少不透明度(图4)。镜头在对照组没有不透明,和网格线清晰可见;然而,镜头不透明度测量显示,100μM H2O2引起明显的白内障形成的镜头。胃促生长素阻塞的效果2O2剂量依赖性的方式。


图4
形态学观察证实了减少不透明度时,镜头在胃促生长素孵化。整个镜头使用胃促生长素浓度的10−9-10年−6M 24 h,然后培养6 h和100μM H2O2。对照组不接受任何治疗,H2O2治疗组只有100μM H2o .照片的背景下,被黑色的网格线。生长素的浓度越高,观察不透明的镜片越少。
3.5。胃促生长素对SOD的蛋白表达的影响,猫,在镜头和MDA

免疫印迹被用来测量水平的草皮,猫,MDA在H2O2刺激HLECs检测胃饥饿素的抗氧化能力。暴露在H2O2显著降低SOD和CAT的活性和MDA含量与对照组相比增加了。预处理与胃促生长素显著增加SOD和CAT的表达,并降低MDA与H2O2组(图5)。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图5
胃促生长素对SOD的表达的影响,猫,在镜头和MDA。(a)的蛋白质含量,SOD, MDA测定猫,用免疫印迹分析。(b, c, d)的相关蛋白表达水平的草皮,猫,和MDA。α 与未经处理的对照组相比,; , ,而H2O2治疗组。
3.6。胃促生长素对SOD的影响,猫的活动,镜头和MDA含量

生物活性测定表明,100毫米H2O2显著降低SOD和CAT的活动镜头,和胃饥饿素预处理阻塞的效果2O2。如表所示1,100毫米2O2镜片MDA含量显著增加。最后,饥饿激素阻塞的效果2O2剂量依赖性的方式。

表1
胃促生长素对SOD的影响,猫的活动,镜头和MDA含量。

4所示。讨论和结论

白内障是全球法律失明的主要原因。直到现在,还没有一个有效的药理剂可以抑制或逆转白内障的发展,寻找负担得起的和非手术药物治疗是必要的延迟晶状体浑浊的进展(17,18]。HLECs饥饿激素的影响和调控机制的影响从来没有被报道。因此,目前的研究是第一次对胃促生长素对H的影响进行调查2O2在HLECs全身的细胞损伤。

越来越多的证据表明,氧化应激是白内障的发生和发展的主要因素。氧化应激是指状态的活性氧水平升高,与后者受到影响细胞内的氧化和抗氧化防御机制19- - - - - -21]。越来越ROS水平是一个至关重要的决定因素的氧化损伤和细胞功能受损。在氧化应激,抑制抗氧化酶的活性,而活性氮物种的浓度(rns)或ROS增加显著。氧化应激参与眼病的发病机制,包括年龄相关性白内障和黄斑变性(19,22]。考虑到氧化应激中扮演一个重要的角色在白内障的发病机制,减少氧化应激是一个似是而非的潜在治疗白内障的目标。

胃促生长素生物行为有几个,包括调节细胞生存和增殖,抑制炎症,发挥抗氧化作用23,24]。先前的研究已经表明,脑肠肽的抗氧化效果是基于增加内源性抗氧化酶的活性(25]。例如,胃促生长素报道缓解SAH-induced氧化脑损伤oxidant-antioxidant状态(通过保持平衡26]。胃饥饿素也被发现的蛋白表达显著减少进气阀打开,增加CuZnSOD的表达,MnSOD,猫,在肝脏GPx [27]。胃饥饿素是一种氨基酸肽对人体安全,已被证明在许多研究[28]。我们的研究还表明,生长素在HLECs表现没有明显的细胞毒性和预处理胃促生长素抑制H2O2破坏细胞的形态。考虑其毒性和缺乏优秀的抗氧化效果,我们建议应视为预防胃饥饿素保护视觉功能,可以用来治疗老年性白内障。

HLECs的单层上皮细胞在镜头前表面。HLECs的正常结构和功能的维护是至关重要的透明度和代谢体内平衡整个镜头。一旦受损,他们不能自我更新,他们成为永久受损。氧化应激可能增加HLECs的渗透性,造成功能障碍。研究表明,氧化剂,特别是H2O2,可能引发晶状体上皮细胞凋亡和启动早期白内障(6,7,29日]。一旦镜头的防御系统被削弱,白内障开始形成。

保护细胞免受氧化损伤的抗氧化系统在正常代谢和氧化后的侮辱;它们含有大量的抗氧化酶SOD等猫,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。这些抗氧化的酶可以从氧化应激和维护保护镜头镜头清晰(30.]。H2O2全身的白内障是与减少增加SOD和CAT活性和MDA的活动镜头。这三种酶在氧化应激保护和正常晶状体代谢至关重要(SOD, CAT和MDA)。抗氧化剂酶能够催化地清除自由基等活性物种。SOD可以防止脂质过氧化、清除活性氧和保护细胞免受毒性氧自由基的破坏性影响31日]。猫降低H2O2水;猫的水平下降削弱晶状体上皮细胞的抗氧化能力和诱导细胞凋亡,导致白内障(32]。MDA是一种代谢的产物脂质过氧化物和是众所周知的一种广泛使用的氧化应激的标志(33]。

我们的体外试验证实胃促生长素在防止氧化应激的影响细胞功能障碍;然而,饥饿激素也可以对镜头组织有效吗?要回答这个问题,我们提出一个体外研究的结果评估anticataract胃促生长素在H的潜力2O2全身的孤立的老鼠的镜头通过观察晶状体透明度和一些生化参数估计如SOD、猫,和MDA含量。

免疫印迹结果显示增加SOD和CAT蛋白表达和降低MDA的表达在饥饿激素治疗。抗氧化酶含量化验显示出类似的结果;SOD和CAT的平均含量显著减少H2O2对待镜头与镜头的控制。ghrelin-treated组抗氧化酶的意思内容恢复与镜头的H2O2治疗组。H的MDA含量升高2O2治疗眼镜可能占膜脂类的破坏。此外,减少ghrelin-treated组MDA水平表明,生长素可能防止破坏的透镜状膜脂质,从而阻碍不透明的镜头。

总之,从我们的实验数据表明,饥饿激素有效推迟H2O2全身的白内障的形成。作为一种抗氧化剂代理,饥饿激素增加SOD和CAT的水平和降低MDA的水平,因此维持晶状体透明度。此外,饥饿激素是一种氨基酸,因此应该可以安全地用于人类。由于其安全性和有效性,饥饿激素cataractogenesis的预防具有重要意义。

缩写

ROS: 活性氧
HLECs: 人晶状体上皮细胞
H2O2: 过氧化氢
SOD: 超氧化物歧化酶
猫: 过氧化氢酶
MDA: 丙二醛
麻省理工: (3)- 4 5-Dimethyl-2-thiazolyl 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴离子。

的利益冲突

作者宣称他们没有财务利益冲突。

确认

这项工作得到了资助从黑龙江省博士后基金(LBH-Z14161),科学研究基金的哈尔滨医科大学第一附属医院(2016 b001),黑龙江省博士后科学研究(LBH-Q16177)发射,哈尔滨医科大学和科研创新项目(2016 lcz39)。