通过防止辣椒素可以防止心肌细胞缺氧/复氧损伤线粒体功能障碍由SIRT1

文摘

辣椒素(Cap)据报道,对心血管系统有益的影响,但这些影响的机制仍知之甚少。细胞凋亡参与线粒体功能障碍,已被证明是,SIRT1的上调表达可以抑制细胞凋亡引起的心肌细胞缺氧/复氧(A / R)。因此,本研究的目的是测试帽的保护作用是否对心肌细胞的损伤是由SIRT1。帽的影响有或没有共同sirtinol, SIRT1抑制剂,变化引起的a / R细胞生存能力,活动的乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)水平的细胞内活性氧(ROS),和线粒体膜电位(MMP),相关的蛋白表达,线粒体渗透性转换孔开放注射(mPTP药物),和主要的新生大鼠心肌细胞凋亡率测试。帽显著增加细胞活力,调节SIRT1和bcl - 2的表达,并减少LDH和肌酸磷酸激酶释放,一代的ROS,失去MMP mPTP开放,caspase-3活动,细胞色素c的释放,细胞凋亡的心肌细胞。Sirtinol明显阻塞帽的心血管效应。结果表明,帽的保护作用与A / R-induced损伤心肌细胞是参与SIRT1。

1。介绍

心血管疾病是人类死亡的主要原因。缺氧/复氧(A / R)损伤是指一种现象在缺血/再灌注(I / R)心肌组织加重心肌结构和功能的损伤(1),这可能导致心律失常,心脏机能减退,心肌细胞凋亡和其他障碍(2]。人们普遍认为线粒体Ca^{2 +}过载和增加活性氧(ROS)会导致线粒体功能障碍,如线粒体膜电位的损失(MMP),线粒体渗透性转换孔开放注射(mPTP药物),caspase-3的活动,和细胞色素c的释放,最终导致心肌细胞凋亡。

凋亡多畴的蛋白质(bcl - 2和Bcl-xL)主要存在于线粒体,防止注射的mPTP药物,细胞凋亡诱导的病原事件之一(3]。此外,半胱天冬酶的半胱氨酸天冬氨酸的蛋白酶家族中扮演一个重要的角色在细胞凋亡的起始和结束,代表了细胞凋亡的执行人。例如,caspase-3凋亡的主要激活DNA碎片(4]。一些报道表明,细胞色素c proapoptotic信号触发半胱天冬酶级联放大反应,导致蛋白质的乳沟一组(5,6]。值得注意的是,研究人员发现,凋亡bcl - 2家族成员主要采取行动保护线粒体完整性通过抑制细胞色素c的释放(7),保护细胞免受拆卸。因此,许多心血管的方法,如缺血性前提或后置条件,以及代理已知心血管效应收敛的减少^{2 +}过载和/或ROS生成(8)和/或促进antiapoptosis抗凋亡蛋白。

克利斯托NAD的家庭⁺端依赖蛋白去乙酰酶抑制剂,通过脱乙酰作用调节生理功能的许多目标蛋白质包括蛋白质调节抗衰老的基因(9]。SIRT1,哺乳动物直接同源的无声信息监管机构2 (Sir2)的家庭,是克利的创始成员。SIRT1可以脱去乙酰基各种基质和参与广泛的生理功能,包括控制基因表达、细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复、代谢、氧化应激反应,和老化10- - - - - -14]。它提供了防止细胞凋亡和在调解中扮演着重要的角色的生存压力下的心肌细胞体外。例如,药理研究表明,SIRT1过度保护心肌细胞从血清deprivation-induced死亡15]。相反,SIRT1在心肌细胞的活动有助于减少他们的死在心力衰竭(16]。

辣椒素(trans-8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide, C₁₈H₂₇不,Cap)是一种天然生物碱来源于植物的属辣椒,更好的被称为红辣椒。它已经表明,应用上限大大减弱心肌损伤由于I / R在老鼠17- - - - - -19]。然而,这些影响的机制尚未阐明。因此,这项研究的目的是为了测试(1)SIRT1是否参与限制心肌细胞的保护作用与A / R-induced受伤;(2)是否参与SIRT1的心脏保护盖是通过减少活性氧生成和氧化损伤引起的A / R;(3)是否保存SIRT1的线粒体参与的心脏保护心肌细胞对上限/ R-induced受伤。

2。材料和方法

2.1。试剂

辣椒素(帽,纯度> 98%)购买的国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。Sirtinol SIRT1的特定抑制剂,从Selleckchem购买(S2804)。Anti-SIRT1抗体购自Abcam(美国ab32441)。Anti-caspase-3、anti-Bcl2 anti-cytochrome c, anti-Cox4购买从细胞信号技术(贝弗利,MA)。反β肌动蛋白是购自南京建成生物工程研究所。辣根peroxidase-labeled二级免疫球蛋白抗体购买从细胞信号技术(贝弗利,MA)。

2.2。细胞培养和实验设计

所有实验协议和程序进行了美国国立卫生研究院的指导后的护理和使用实验动物(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)和南昌大学的伦理委员会批准的(2015 - 0036)。心肌细胞从幼童的雄性sd大鼠中准备如前所述[20.]。简而言之,心室与胰酶消化(1毫克/毫升)D-Hanks的平衡盐溶液(Na₂HPO₄H·12₂O 0.37 g, NaHCO₃0.35克氯化钠8.00 g,氯化钾0.40 g和KH₂阿宝₄0.06 g)。离心分离后的细胞收获(5分钟,60),resuspended镀介质(FCS DMEM 85%, 15%, 100 U /毫升的青霉素和链霉素),60毫米Primaria培养皿,电镀前预镀1%明胶(37°C, 30分钟)去除nonmyocytes。不依从心肌细胞被镀上gelatin-coated 60毫米Primaria文化菜1×10⁶细胞每道菜。18 h后,心肌细胞洗和无血清培养系统在维护媒介(M199 DMEM 80%, 20%,和100 U /毫升的青霉素和链霉素)期间的实验。

在为期两天的文化,通过添加新鲜缺氧心肌细胞暴露在缺氧诱导介质(不₂阿宝₄0.9毫米,NaHCO₃98.5毫米10.0毫米6.0毫米,氯化钾、氯化钠,CaCl₂1.8毫米,MgSO₄乳酸钠40毫米,1.2毫米和消息灵通的20毫米pH值6.8,37°C),然后孵化室的大气中95%的N₂和5%的公司₂4 h。4 h后缺氧,缺氧中被撤的细胞和再氧化介质(129.5毫米5.0毫米氯化钾、氯化钠、CaCl₂1.8毫米,不₂阿宝₄0.9毫米,NaHCO₃20毫米,MgSO₄葡萄糖1.2毫米,5.5毫米,消息灵通的20毫米在pH值为7.4,37°C)补充道。然后细胞在孵化器孵化有限公司5%的氛围₂2 h。在常氧控制实验中,这些细胞被孵化与新鲜文化生长介质在孵化器公司5%的氛围₂6 h。细胞培养与帽(从10μM - 40μ(20米)或限制μ加上Sirtinol(60米)μ美国Selleckchem M。一些研究报道,人类SIRT1的IC50是131μM和另外60μ米,这个剂量是确认在我们的初步实验)实验前24小时,分别为(21]。

2.3。MTS试验

比色MTS [3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 - (3-carboxyme-thoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium]分析是用来研究细胞/ R后心肌细胞的可行性。MTS(美国Promega)是一种淡黄色衬底产生一个深蓝色的有色甲产品,直接水解与活细胞中当孵化。主要的心肌细胞种植在96孔板1×10的浓度⁴细胞/。经过感应的A / R,在37°C细胞孵化20μl MTS 100年(5毫克/毫升)μ介质的l 4 h。4 h后,吸光度的测定波长490 nm的标仪(美国Bio-Rad 680)。结果表示为一个百分比的控制。

2.4。生化参数

文化媒体6 h后的细胞培养或细胞溶解产物上层清液为每个组收集评估活动的磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)使用商用试验包(建成,中国)根据制造商的指示。

2.5。免疫印迹分析

收获细胞细胞溶解与无线电免疫沉淀反应(中国•瑞帕,Beyotime)和2 h在4°C的环境。提取后离心机在15,294×g在4°C 15分钟删除任何不溶性材料。等量的总蛋白(20μg)在样本稀释缓冲区包含100毫米二硫苏糖醇,和样品在98°C加热5分钟,然后接受10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶仪器(美国Bio-Rad)。随后,被转移到聚偏二氟乙烯膜的蛋白质。膜被封锁与5%的脱脂牛奶TBS-T (Tween-20 Tris-buffered盐水和0.2%)2 h,然后孵化与抗体SIRT1, bcl - 2,细胞色素c,和caspase-3稀释1:500年TBS-T,和膜不断动摇了在室温下1 h,紧随其后的是洗的TBS-T(每20分钟时间)和孵化辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:2000稀释)1 h。接下来,膜清洗3次,每个在TBS-T 10分钟。检测,膜饱和与增强化学发光混合1分钟和被亲笔用预照光x射线胶片(富士胶片、东京)300年代。分析了乐队使用数量与光密度扫描一个软件。

2.6。测量细胞内的活性氧

Dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA) membrane-permeable染料,用于确定是否减少ROS生成,一个潜在的心血管效应机理。DCFH-DA被细胞内酯酶转化成2 ,7-dichlorodihydrofluorescein,然后由活性氧氧化成高荧光2 ,7二氯荧光素。分析是根据制造商提供的协议执行。简而言之,这些细胞被洗两次与冰冷的磷酸盐(PBS)和孵化的DMEM解决方案包含10μM DCFH-DA(美国表达载体)。接下来,样本离心机,享年800岁5分钟,洗两次与冰冷的PBS和每组的荧光强度是决定使用流式细胞分析仪(美国,正欲)激发和发射波长的485和528海里,分别。

2.7。评估线粒体膜电位(MMP)

MMP的评估使用荧光染料JC-1(美国表达载体)。心肌细胞的悬浮与JC-1孵化(200μM)为20分钟37°C之后,洗两次与PBS去除剩余的试剂。荧光然后用流式细胞分析仪(美国Becton Dickinson)与第一激发和发射波长(例/ em) 530和580海里(红色),然后在交货/ em的485/530 nm(绿色),分别。JC-1 (5 5 ,6、6-tetrachloro-1 1 ,3,3-tetraethylbenzimida-zolo carbocyanine碘)是一种亲脂性的,阳离子染料,可以有选择地进入线粒体和可逆地改变颜色从绿色到红色当MMP的增加。红色比绿色荧光强度反映了细胞MMP的水平。

2.8。制备线粒体和胞质分数

线粒体和细胞胞质分数是准备使用一个线粒体/胞质分离设备(德国试剂盒)。心肌细胞有或没有进行A / R被离心收获500 g×10分钟,洗两次冰冷的氯化钠溶液。之后,这些细胞被resuspended 1毫升的冰冷的裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂。孵化后10分钟4°C立式圆筒形瓶,溶解产物离心机在1000 g×10分钟。浮在表面的收获,指定为胞质分数。细胞颗粒是resuspended 1.5毫升的冰冷的中断缓冲区中含有一种蛋白酶抑制剂和均质使用天鹅Dounce组织磨床在冰上。均化离心机在1000 g×10分钟在4°C,和上层的收集。然后收集上层清液离心机在6000 g×10分钟在4°C。浮在表面的被删除了,球是用1毫升线粒体存储缓冲区。然后,溶解产物离心机在6000 g×20分钟在4°C和线粒体颗粒在一个适当的缓冲和指定为线粒体resuspended分数。

2.9。注射的mPTP药物

肿胀的孤立的线粒体分数被暂停缓冲(氯化钾120毫米,Tris-HCl 10 mM,拖把20毫米,和KH₂阿宝₄5毫米)和添加到96 -微量滴定板。的40μl (CaCl₂每个解决方案(200海里)作为一个注射兴奋剂的mPTP药物,导致线粒体光密度稳定下降。每分钟520海里的吸光度测量观察到稳定值。吸光度的变化被用来测量注射的程度mPTP药物。

2.10。Caspase-3活动的评估

Ac-DEVD-рNA (acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)可以通过caspase-3催化生成黄色物质机构(对硝基苯胺),吸光度最高在405纳米检测caspase-3的活动。进行了化验的制造商提供的协议caspase-3活动分析工具包(Beyotime,中国)。总之,细胞被PBS收集和清洗一次。上层清液被免职,裂解缓冲被加入到细胞的比率100年μ为2×10 l⁷细胞冷冻保存15分钟然后在16000 g×15分钟离心机。上层清液转移到冷管,检测缓冲区和Ac-DEVD-рNA补充道。的混合是在37°C的环境2 h检测吸光度的波长405 nm。

2.11。流式细胞术检测心肌细胞凋亡

评估凋亡是由使用流式细胞仪和一个膜联蛋白V-FITC凋亡检测工具根据制造商的协议。心肌细胞被洗两次冷PBS缓冲溶液中,然后resuspended最后1×10的浓度⁶细胞/毫升。膜联蛋白V-FITC (5μl)和π(5μl)被添加到细胞,resuspended在500年μl 1 x绑定缓冲。这些细胞被轻轻漩涡,孵化在黑暗中在室温下15分钟,并分析了在流式细胞仪(美国正欲ex488 nm和em578 nm)在1 h。每组至少10000个细胞进行分析,执行和分析凋亡细胞使用细胞追求软件(BD生物科学、钙、美国)。

2.12。TUNEL检测心肌细胞凋亡

心肌细胞凋亡的检测是通过终端原位缺口末端标记(TUNEL)测定。心肌细胞被镀在玻璃Lab-Tek室幻灯片(σ),用PBS洗净,然后用1%多聚甲醛固定10分钟。心肌细胞被固定在预冻ethanol-acetic酸(2:1)为一个额外的5分钟−20°C。与PBS洗涤后,这些细胞被孵化与TUNEL反应缓冲在37°C调湿室1小时。细胞是DNase对待我(1.0毫克/毫升,σ)10分钟,所以,镍可能引入基因组DNA,作为一个积极的控制。棕色细胞代表凋亡细胞在每个载玻片(×400)显微镜高倍镜下(奥林巴斯、东京、日本)。心肌细胞的凋亡率是衡量DNA nickel-end标签,和棕色细胞细胞核的数量1000个细胞被重复计算板的方法。

2.13。统计分析

所有的值被表示为±SEM。单向方差分析应用于生化测试的意义差异数据组,其次是事后测试个体差异。结果被认为是重要的价值 。对于每一个评价,至少六个独立的试验进行。

3所示。结果

3.1。帽增加后的心肌细胞的异常进行A / R

细胞的异常有或没有经历一场/ R如图1(一)和图S1部分的补充材料。与对照组相比,A / R明显减少细胞生存能力与A / R组。帽显著增加细胞的异常剂量依赖性的方式,和最优浓度的上限是20μ米( 与A / R组)。当上限浓度达到40μM细胞的异常开始减少,表明帽时心肌细胞毒性的浓度上限高于最优浓度。因此,上限20的浓度μ米被选为后续实验。20 A / R组使用μ米盖和60μM细胞的异常sirtinol证明低于上限20μM + A / R组( )。然而,细胞的异常没有改变单独使用帽,独自sirtinol,帽+ sirtinol与对照组相比 ),以及使用sirtinol + A / R比A / R组( )。

LDH的活动和肌酸磷酸激酶在细胞培养后的文化媒介/ R或常氧介质进行了分析评估细胞的条件。有显著增加的活动LDH和肌酸磷酸激酶/ R组与对照组相比 ),而帽显著减少LDH的活动和肌酸磷酸激酶与A / R组( ,图1 (b))。上限的LDH和肌酸磷酸激酶活动明显被共同服用sirtinol(的 )。同样,LDH和肌酸磷酸激酶的活动并没有改变使用帽,独自sirtinol,帽+ sirtinol与对照组相比 ,图S1B),以及使用sirtinol + A / R比A / R组( ,图S1B)。

3.2。盖在心肌细胞中调节SIRT1表达式/ R

上限SIRT1的表达的影响/ R评估后心肌细胞的免疫印迹分析如图2和图S2部分的补充材料。与对照组相比,A / R的表达显著下调SIRT1 ( ),不管有或没有sirtinol。预处理与帽(20μ米)显著调节SIRT1的表达( ),无论单独使用帽或帽子+ sirtinol。20 A / R组使用μ米盖和60μM sirtinol了SIRT1蛋白质的表达低于上限20μM + A / R组( )。

3.3。帽减少ROS生成

心肌细胞ROS水平研究了通过测量光纤荧光强度图所示3。ROS水平的峰值明显向右移动,显示一个明显的增加的ROS生成/ R组与对照组相比。帽预处理引起了重大转变峰的ROS水平(图左侧3(一个), ),这表明显著降低ROS生成与a / R组(图3 (b), )。心肌细胞中活性氧诱导的峰值/ R组中使用帽和sirtinol转移到正确的与帽组(图3(一个), ),这表明活性氧生成明显多于帽组(图3 (b), )。

3.4。帽改变后的心肌细胞MMP / R

MMP的丧失是细胞凋亡的早期征兆。在活细胞中,线粒体基质中JC-1积累,发出红色荧光。凋亡和坏死细胞MMP的丢失,和JC-1只存在于其单体的形式发出绿色荧光。图4显示预处理的影响与限制(20μ(20米)或限制μM)和sirtinol (60μ米)在心肌细胞MMP的变化引起的A / R。荧光的比值在右下象限和右上象限被用来评估MMP的水平。A / R组中,有一个下降的比率荧光强度( ),显示MMP的丧失。预处理与帽显著预防损失引起的MMP / R ( )。然而,MMP组中明显减少使用帽和sirtinol相比组使用帽( )。

3.5。注射帽治疗抑制的mPTP药物诱导的心肌细胞/ R

mPTP开放引起的细胞凋亡中起着重要作用的a / R。Ca^{2 +}全身的线粒体肿胀注射分析是用来确定mPTP药物。如图5注射,mPTP药物开放的A / R组与对照组相比显著增加( ),而注射Cap-pretreated集团有一个重要的抑制剂mPTP药物开放与a / R组( )。注射的mPTP药物再次打开增加Cap-pretreated和sirtinol集团( )。

3.6。帽治疗抑制线粒体细胞色素c的释放在心肌细胞胞质进行A / R

线粒体功能异常结果线粒体细胞色素c的释放到胞质。免疫印迹显示/ R导致了细胞色素c在细胞溶质的积累(图6),但观察到的细胞色素c在细胞胞质显著降低时使用帽/ R治疗前( )。然而,积累增加sirtinol时使用( )。这些结果表明,帽是预防这样的障碍。

3.7。帽治疗减少Caspase-3的活动和影响bcl - 2的表达和Caspase-3心肌细胞进行A / R

半胱天冬酶家庭证明发挥核心作用调解各种凋亡反应。收集细胞后评估caspase-3的活动/ R治疗。如图7的活动caspase-3 A / R组与对照组相比显著增加( Cap-pretreated组),而有一个重要的抑制剂caspase-3相比之下的活动/ R组( )。caspase-3的活动增加了再次Cap-pretreated和sirtinol集团( )。

此外,bcl - 2和caspase-3被免疫印迹(图检查8)。的蛋白表达裂解caspase-3 A / R组与对照组相比明显增加( )。bcl - 2 A / R组与对照组相比显著降低( )。相比之下,治疗帽部分减少数量的增加裂解caspase-3和调节bcl - 2的表达。然而,大量的裂解caspase-3帽和sirtinol略增加了治疗。bcl - 2显示了相反的趋势( )。

3.8。帽治疗可以抑制心肌细胞凋亡诱导/ R

/ R治疗后,心肌细胞收获了膜联蛋白V / PI双染色,然后用流式细胞分析仪(图分析9)。这些结果表明,与一群/ R-treated相比,细胞凋亡Cap-preconditioned组显著降低( )。然而,预先处理的细胞只帽和sirtinol sirtinol演示了一个更高层次的细胞凋亡与细胞预处理只帽( )。

此外,心肌细胞的凋亡是化验使用TUNEL染色(图10)。在显微镜中,A / R组相比明显促进心肌细胞凋亡,在对照组,布朗的明显TUNEL-positive心肌细胞。预先处理帽在TUNEL-positive心肌细胞显著减少。然而,sirtinol证明帽被削弱的影响。一致的结果的观察凋亡心肌细胞的百分比由流式细胞术。

4所示。讨论

由于急性心肌梗塞发病率高,心肌细胞损伤的主要原因,和患病率成功的心肌再灌注疗法在世界范围内,a / R-induced心肌损伤吸引了来自世界各地的研究人员的广泛关注(22,23]。我们的数据表明,心血管效应的上限/ R-induced受伤可能由SIRT1。

梗死和复氧损伤的主要原因是心肌细胞损伤和死亡在各种心血管疾病。A / R,梗死和再氧化实验模型中,得到了广泛的应用。A / R损伤的病理机制显然是多因素的,包括以下步骤:(1)细胞内酸中毒、细胞内钾的损失⁺和代谢产物的积累;(2)细胞内Ca^{2 +}过载、缝隙连接表达式/函数,和不可逆的细胞损伤;(3)的氧化应激水平升高,进步活性氧积累,和线粒体功能障碍(2]。在A / R,再引入氧允许ATP的生成。然而,伤害增加了线粒体的电子传递链的结果代ROS和各种氧化应激损伤。一方面,改变离子稳态导致质膜破裂,细胞死亡。另一方面,ROS-mediated氧化应激影响凋亡之间的平衡(如bcl - 2和Bcl-XL)和proapoptotic(比如恶劣,伯灵顿,或者收购),产生的细胞更容易受到凋亡[24]。预处理与帽已经证明preconditioning-like保护隔离灌注大鼠心脏(25,26]。

目前的研究表明,A / R的LDH和肌酸磷酸激酶显著增加活动文化媒体和减少细胞生存能力和预处理帽明显阻塞造成的变化/ R。这证实,帽子可以保护心肌细胞损伤引起的A / R。此外,免疫印迹分析表明,SIRT1在治疗组表达明显增加帽子。减少ROS报道减少缺血性损伤(8]。如图3帽,这些结果表明,影响降低ROS的生成,减轻/ R-induced损伤心肌细胞可能依赖SIRT1的上调表达的能力和活动。MMP的崩溃是细胞凋亡的早期征兆。在A / R, MMP的中断是由注射的mPTP药物内线粒体膜,导致基质肿胀,外膜破裂,凋亡的信号分子的释放。在这项研究中,我们表明,帽预处理可以明显保护MMP的稳定,注射封闭mPTP药物,和减少apoptotic-related因素的释放。然而,在sirtinol面前,所有的防护帽被完全废除(数据的影响4- - - - - -6)。

bcl - 2家族蛋白质功能通过不同的途径调节细胞凋亡的27]。内在凋亡途径取决于职业的活动之间的平衡和凋亡的bcl - 2家族成员蛋白,这行为调节线粒体膜的通透性(28]。人们已经发现,高比率的bcl - 2 /伯灵顿与更大的漏洞凋亡激活(29日,30.]。此外,先前的证据表明,更高的SIRT1调节凋亡bcl - 2蛋白的表达和Bcl-xl,表达下调proapoptotic蛋白质伯灵顿,然后增加在ischemia-reperfused心肌细胞生存能力15]。此外,bcl - 2及其同系物预防线粒体膜破坏,细胞色素c的释放和其他proapoptotic因素。目前的研究表明,帽预处理调节bcl - 2的表达以及降低MMP和线粒体膜间隙细胞色素c的释放到胞质(数据4,6,8)。

bcl - 2家族成员的水平的变化可能对线粒体膜孔隙的形成有直接影响。这可能会导致caspase-3和内在的凋亡通路的激活。此外,许多研究已经证实,自由基的生产过剩,细胞内钙超载、线粒体损伤和炎性细胞浸润引起的A / R损伤激活凋亡相关基因,如caspase-3 [31日,32]。Caspase-3响应各种apoptosis-stimulating信号和作为细胞凋亡的最终执行者死亡。caspase-3代表的不可逆阶段的激活细胞凋亡(33]。此外,大量研究表明,注射MMP刺激mPTP药物打开,导致细胞色素c的释放在细胞质中,激活半胱天冬酶的途径,和重要的胞内蛋白的降解,从而诱导的细胞凋亡34,35]。在最近的研究中,caspase-3的活动增加了A / R与帽。减少预处理组使用帽,sirtinol, caspase-3的活动从A / R组之间没有显著性差异。此外,前预处理与帽/ R的表达减少caspase-3分开。组中使用帽,sirtinol,水平的裂解caspase-3从A / R组之间没有显著性差异,表明sirtinol块限制的影响。所有的数据表明,帽可能通过SIRT1施加对心肌细胞的保护作用。

细胞凋亡中起着明显的作用/ R-induced损伤组织和可能发病的一个重要组成部分36]。此外,SIRT1可能是细胞凋亡的监管者,乙酰化p53,伯灵顿,裂解caspase-3 [37,38)和调节转录因子的乙酰化水平FOXO1影响凋亡通路在心脏39,40]。因此,它可能是SIRT1-mediated caspase-3的脱乙酰作用活跃,Bcl2,伯灵顿,和FOXO1胞质环境起着重要的作用,一个/ R-induced创伤性的抑制细胞凋亡可能是通过SIRT1-FOXO1通路。因此,抑制细胞凋亡可能是一个上限心肌细胞的保护作用机制由于其影响caspase-3和bcl - 2和可能涉及SIRT1。细胞发生凋亡早期被定义为积极的膜联蛋白V,但消极的人口为π。事实上,在当前的研究中,我们观察到使用膜联蛋白V / PI双染色和流式细胞分析仪,或者TUNEL染色,显微镜,A / R-induced老鼠原发性心肌细胞的凋亡明显减少了预处理帽和sirtinol屏蔽帽的影响。这证实了上限心肌细胞的保护作用是参与SIRT1,通过其凋亡的作用。

5。结论

总之,目前的研究已经证实,帽可以防止线粒体功能障碍和保护心肌细胞/ R-induced损伤通过提高细胞存活率和细胞凋亡,减少活性氧生成,避免崩溃的MMP上调抗凋亡蛋白bcl - 2,注射关闭mPTP药物,减少细胞色素c的释放和caspase-3分开。帽的心血管效应参与SIRT1通路和至少部分SIRT1的依赖。

缩写

A / R:	缺氧/复氧
帽子:	辣椒素
肌酸磷酸激酶:	磷酸肌酸激酶
DCFH-DA:	Dichlorodihydrofluorescein二乙酸
FITC:	异硫氰酸荧光素
我/ R:	缺血/再灌注
JC-1:	5、5 ,6、6-Tetrachloro-1 1 ,3,3-tetraethyl-imidacarbocyanine
LDH:	乳酸脱氢酶
mPTP:	线粒体通透性转换孔
MTS:	(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - 2 h-tetrazolium (4-sulfophenyl)
PBS:	磷酸盐
PI:	Propidium碘化
ROS:	活性氧
MMP的:	线粒体膜电位。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持由中国自然科学基金会(81160402,81160402,81673431)。

补充材料

图S1。帽预处理的影响有或没有共同的sirtinol细胞的异常和LDH和肌酸磷酸激酶活动后的培养基A / R。(一)细胞的异常没有改变使用帽(20μ米),sirtinol (60μ(20米),限制μ米)+ sirtinol (60μ米)与对照组相比,以及使用sirtinol (60μ米)+ A / R / R组相比。(b) LDH和肌酸磷酸激酶活动在心肌细胞的培养基没有改变单独使用帽(20μM), sirtinol (60μ(20米),限制μ米)+ sirtinol (60μ米)与对照组相比,以及使用sirtinol (60μ米)+ A / R / R组相比。值表示为均值±SEM ( )。^▲▲ 与对照组。图S2。西方墨点法乐队和图形演示SIRT1的新生儿鼠原发性心肌细胞。与对照组相比,A / R明显下调SIRT1的表达,无论有或没有sirtinol。预处理与帽(20μ米)显著调节SIRT1的表达,无论单独使用帽或帽子+ sirtinol。值表示为均值±SEM ( )。^▲▲ 与对照组。(补充材料)

引用

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