文摘
养殖鱼暴露于一个连续抗原微生物和环境压力的代理,这可能会导致慢性炎症的一个条件。的多酚类物质的概念,主要包含在水果和蔬菜中,被赋予抗氧化和抗炎活动,养殖鲈鱼(Dicentrarchus labraxl .)管理与红葡萄polyphenol-enriched饲料。多酚提取的种子Canosina尼禄di Troia葡萄在两个不同的浓度和与传统的混合饲料(100和200毫克/公斤,职责)。鱼样品收集在天223年和273年,分别评估了肠道和脾脏细胞因子释放以及脾脏巨噬细胞(MØ)和melanomacrophage中心(MMC)和分布地区。数据将显示,在治疗鱼减少肠道白介素- 1 (IL)βil - 6和增加脾干扰素(IFN)γ发生。另一方面,MØ脾减少的数量似乎间平行增加。总的来说,这些数据表明,polyphenol-administered鲈鱼产生低水平的肠促炎细胞因子,同时产生大量的脾脏干扰素-γ,一个健壮的表达和保护的适应性免疫反应。增加间观点的证据保护脾脏饲料富含多酚引起的反应。
1。介绍
众所周知,鱼类免疫细胞主要包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、thrombocytes [1]。硬骨鱼类的鱼,主要淋巴网状组织头肾、脾、胸腺、肝脏、肠道和mucosa-associated淋巴组织(2]。因此,这些组织可能代表原始类似鱼的淋巴结生发中心,即使他们的形态学和免疫功能仍在调查中3- - - - - -6]。
在鱼、melanomacrophage中心(间)被定义为一群巨噬细胞色素(MØ)形式的结节性集群MØ异构夹杂物的特征,如降解产物的细胞(7]。间是致力于销毁和回收的外源性和内源性抗原8),甚至包括存储的铁由于erythrophagocytosis [9]。所有这些过程生成细胞碎片,黑色素颜料,含铁血黄素颗粒,脂褐质残留(10),以及脂滴,基本蛋白质总量,中性粘多糖(11]。此外,某些类型的细胞内颗粒含有微量金属(12- - - - - -15]。液泡建议中包含的色素沉积的吞噬作用机制间的表达早期抗菌防御(16- - - - - -18]。
数量、大小和色素间的分布取决于鱼类(19,20.,器官11,21,22)、年龄(23- - - - - -25),性活动(26,27],营养状况,和鱼类健康[10,28- - - - - -31日]。
水产养殖的发展,与生产系统的强化,增加了对高品质的饲料的需求以提高鱼类对消费者健康没有副作用(32,33]。鱼粉一直被用作鱼饲料的主要饲料原料制备,由于其高蛋白质含量和氨基酸平衡剖面。由于最近全球产量短缺,加上需求增加和竞争为其在畜禽饲料使用,鱼粉价格成为负担不起34]。因此,可持续的水产养殖取决于一个完美的平衡增长和健康条件的鱼。使用抗生素和化学疗法对抗鱼可能产生耐药病原体感染,在生物和环境污染。此外,商业是昂贵的疫苗用于鱼类养殖实践,必须具体针对特定病原体(35]。
如今,用植物蛋白替代鱼粉而不降低性能已经开始。益生菌和益生元的政府鱼似乎有利于保护微生物群的生长(36,37),为其immunomodulating活动,可能代表一个非常有前途的生物防治水产养殖。因此,脾间的调查提供了有用的知识在鱼的健康状况也与营养的类型(38- - - - - -43]。
天然产物中,多酚类物质,主要存在于水果和蔬菜,可以清除氧和氮自由基,调节抗氧化酶和细胞氧化还原转录因子(44]。特别是,保护作用的多酚类物质是由连续从细胞各种活性氧的清除,如单线态氧、过氧化氢过氧亚硝基,为了维护健康的新陈代谢功能(45]。他们也会影响细胞间信号受体敏感性,炎症酶活性,或基因调控46,47]。根据我们自己的研究在动物模型和人类从红葡萄多酚具有抗氧化和抗炎活动,也保持平衡免疫机械(48,49]。
一些研究已经进行了养殖鱼类中多酚类物质的使用来评估他们的抗氧化和抗炎作用。一项研究调查了在体外白藜芦醇的影响、芒果苷和(-)-epigallocatechin-3-gallate histiophagous纤毛虫Philasterides dicentrarchi,导致养殖大菱的致命scuticociliatosisScophthalmus马克西姆斯l . 3的多酚,白藜芦醇显示最强antiprotozoal活动,减少纤毛虫密度后1周的文化。鉴于这些发现,化疗与多酚类物质的潜在效用的策略控制养殖大菱的scuticociliatosis一直强调[50]。
在另一个研究中,多酚的有益影响来自从橄榄油厂废水,通过非可塑性的分子印迹设备,进行评估hypercholesterolemic饮食Carassius auratus俗称金鱼,被选为实验模型。结果表明多酚的有益活动的减少破坏脂肪组,确认他们可以用于疾病的治疗脂质积累养殖鱼类的饲料。这种饮食方法可以改善感官和营养品质。最后,废油的有益影响提取的上下文中应该建议研究项目集中在产品卫生系统(51]。
在目前的研究中,在养殖鲈鱼(Dicentrarchus labraxl .)饮食中富含多酚类物质的影响对肠道细胞因子释放和脾脏组织间以及沉积的脾脏进行评估。
2。材料和方法
2.1。多酚提取
Canosina红葡萄从尼禄di Troia原地葡萄葡萄品种,生长在阿普利亚(意大利南部)。它的特点是厚皮和小尺寸的浆果。冷冻浆果的种子被渗流提取使用乙醇/水(70:30)。然后,提取首次通过液相色谱分析与二极管阵列检测定义多酚成分。此后,提取纯化在合成吸附剂溴化树脂和多酚含量的比例确定。
潜在的抗氧化作用的提取物进行评估通过使用2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl分析衡量测试代理来清除自由基的能力(52]。
2.2。制备饲料和膳食方案
鱼的饮食包括在常规饲料混合两种不同浓度的葡萄提取物,每天服用3 - 4次:(1)鱼(美联储)混合组成的50克的葡萄提取物在5公斤的玉米淀粉,即10 g的混合(100毫克的提取)1公斤常规颗粒(100毫克/公斤)。(2)鱼(美联储)混合组成的100克的葡萄提取物在5公斤的玉米淀粉,即10 g的混合(200毫克的提取)1公斤常规颗粒(200毫克/公斤)。初步实验,低浓度的葡萄提取物,例如,1,10日和50毫克/公斤,不是有效的在我们的测试系统。
控制()是由美联储传统喂鱼。
2.3。样品收集
脾脏样本收集的90不成熟(青少年)的样本鲈鱼圈养在附近的一个农场长大Lesina湖(意大利福贾)。样本收集发生在冬季223天(T1)、273天(T2)从实验的开始。
鱼饲养在实验条件下,根据治疗“理事会指令86/609 EEC保护动物用于实验和其他科学目的”和“道德理由鱼类的使用和治疗研究”(53]。
2.4。免疫学研究
标本被从脾幽门(P)和终端(T)肠道(G)段的处理和未经处理的鱼,分别。
肠道部分被放置在培养皿中包含RPMI 1640 (Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,GE) +链霉素(100毫克/毫升)青霉素(美国Walkersville Biowhittaker)和1% (Biowhittaker)用剪刀和切片获得GP和GT样本,分别。两段都是在培养皿中培养包含RPMI 1640 2和24小时14°C,分别。之后,离心得到的上层清液的GP和GT文化在10000 g×10分钟在4°C和储存在−30°C,直到使用。
脾标本放置在培养皿中包含RPMI 1640 + 0.2%肝素和细胞通过过滤器70μ米尼龙膜(正欲,贝德福德,MA),轻轻迫使1毫升注射器柱塞,和过滤介质,产生一个细胞悬浮在每种情况下。孵化后2和24小时在14°C,分别为1毫升的细胞培养被埃普多夫杯和离心机在10000 g×10′4°C。最后,文化上层清液被收集并存储在−30°C,直到使用[54]。
浓度(pg / mL)鱼的白介素- 1 (IL)β、il - 6和干扰素(IFN)γ在上层清液由特定的ELISA试剂盒(Cusabio生物科技有限公司、武汉、湖北,中国)根据制造商的指示。细胞因子浓度在550 nm读通过ELISA阅读器(iMark微型板块吸光度读者,BioRad,赫拉克勒斯,加利福尼亚州,美国)。获得每个细胞因子浓度乘以稀释系数获得样本值。
2.5。基本的组织学和组织化学
所有鱼类麻醉三卡因1:5000(丙烯酰胺BioChemika,书,瑞士)根据指南安乐死的非本国动物美国动物园兽医协会(2006)。GP、GT和脾脏的鱼被移除,缓冲福尔马林固定在10%,后来在自来水洗,脱水乙醇浓度增加,嵌在石蜡中。
部分组织(5μ米厚)处理如下:(a) Hematoxylin-Eosin(圆))染色(默克公司,达姆施塔特,德国);(b) Perls-Van Gieson染色(Bio-Optica、米兰、意大利)来识别三价铁;(c)马洛里染色(默克公司,达姆施塔特,德国)检测脂褐质色素和ceroids。执行MØ使用的识别α萘乙酸酯酶(Anae)(σ诊断,圣路易斯,密苏里州,美国)和过氧化物酶(Perox)(σ诊断)方法。
2.6。量化Melanomacrophage中心
表面被MØ和MMC (μ米2脾实质)清点和测量随机的100个元素,选择数字领域。每个数字字段被拍到一个40 x客观与数码相机(xc - 003 p,索尼,东京,日本)连接到一个光学显微镜(Leitz则Laborlux 12日,位于德国)。使用图像分析软件进行测量(QWin、徕卡、英国剑桥大学)。
2.7。统计研究
统计差异从肠道细胞因子的浓度和脾脏组织2和24小时孵化后,分别治疗和治疗之间的样本,在T1和T2,数量和表面被MØ占领和间比较。统计分析了使用GraphPad棱镜统计软件5.0版本Windows Vista。Bonferroni测试是用于比较控制和处理样品。统计学意义是。
3所示。结果
据有关红葡萄中提取的多酚含量百分比如下:原花青素(101.8%)和儿茶素和表儿茶素(10.37%)。
(一)细胞因子释放的直觉和脾脏2 h后孵化。关于GP上层清液,il - 1的含量β表示在图1(一)。在T2,样本数量的il - 1治疗β明显低于中观察到相应的控件。没有指出与多酚含量差异。
(一)
(b)
结果与测定il - 1β在GT上层清液用图表示的1 (b)。il - 1的显著增加β观察T2与多酚剂量100毫克/公斤相比其他处理样品。
对脾il - 1β生产各种样本检测之间没有显著差异(数据没有显示)。
测定GP上层清液中il - 6在图表示2(一个)。在未经处理的样品,il - 6水平的增加是指出在T1到T2相比。在治疗和样品浓度的多酚的il - 6水平显著地减少在T2和T1。然而,处理样品的值没有显著不同于控制在同一时间点。
(一)
(b)
与GT上层清液,il - 6的决心是描绘在图2 (b)。在未经处理的样品,il - 6水平的增加是指出在T1到T2相比。在处理样本,T2值比T1低的il - 6水平使用100毫克/公斤的多酚。然而,T1值和200毫克/公斤低于相应的治疗。
对脾脏il - 6生产、各种样本之间没有显著差异(数据未显示)。
GP上层清液,干扰素-γ水平下降在T1样品使用剂量200毫克/公斤相比T2控制(数据未显示)。在图3(一个)干扰素- T2,水平γ释放GT高剂量200毫克/公斤相比,相同的T1下的浓度。
(一)
(b)
在T2,脾脏干扰素-γ释放显著增加在所有样本(图3 (b))。然而,在T2,干扰素的水平γ鱼处理明显高于200毫克/公斤观察T1处理和未经处理的样品。
(b)从肠道和脾脏细胞因子释放后24 h孵化。在GP上层清液,T2, il - 1β未经处理的样品的浓度高相比,200毫克/公斤样品T1(数据没有显示)。
在GT浮在表面的,没有差异的il - 1β浓度被发现在所有样本(数据未显示)。
脾il - 1的值β生产未达到统计上的显著水平在所有样本(数据未显示)。
在GP上层清液,il - 6含量显著降低在所有样本的T2和T1(图4(一))。然而,il - 6的值对样本相比没有显著不同的控制。
(一)
(b)
(c)
GT上层清液中,观察到的反应是相同的模式的显著减少T2和T1值在所有样品(图4 (b))。
治疗和治疗脾il - 6水平明显高于样本在T1和T2。在脾脏,T1值的il - 6和200毫克/公斤低于相应的未经处理的对应(图4 (c))。
在GP上层清液,干扰素-γ生产基本上是相同的所有样本(数据未显示)。
GT对待样本有200毫克/公斤剂量显著增加干扰素-γ分泌物中检测出所有的样品相比,除了T2控制(图5(一个))。
(一)
(b)
在T2,脾脏干扰素-γ释放显著增加在处理样品相比,剩下的样品。此外,T2值更高剂量200毫克/公斤相比剂量100毫克/公斤。(图5 (b))。
3.1。基本的组织学和组织化学
脾脏的组织学形态,沾染了),如图6(一)。
(一)
(b)
(c)
(d)
这些图像显示外部胶囊,粉红色的彩色,由结缔组织和小骨小梁延伸到实质,这可分为红色和白色的果肉,分别。然而,这种安排并不以有序的方式,可以观察到脾脏以来高等脊椎动物的两种类型的组织总是混杂在一起。无论如何,红髓由网状细胞网络支持干脆烧掉正弦曲线,不同的细胞群,包括MØ和淋巴细胞,而白髓组成的小球形小体也被称为“椭圆体”[4),MØ自由和间质。脾椭圆体分为小动脉形成dense-walled毛细血管能够收集的大量的小颗粒抗原。MØ和间质表现出不规则的边界与人口细胞质颗粒和其它不明物质。值得注意的是,很难区分细胞核与细胞质的其余部分。出于这个原因,他们细胞化学的认同Perox和Anae染色(图6 (b))。三价铁的存在和lipofuscin-ceroids发现了间质中深棕色颗粒与马洛里和Perls-Van Gieson染色,分别为(数字6 (c)和6 (d))。
3.2。MMC的定量分析
间的大小变化很大在同一节;一些大型集群形成测量多达77μ米区域,虽然人小,不到20μ米,可能单细胞MØ。单一MØ大小和间质组之间没有显著差异。相反,数量和金额的表面被MØ和MMC脾脏样本中不同养殖鱼类在T1和T2,分别。
MØ控制的比例高于观察鱼T1与多酚剂量治疗。
MMC控制的比例低于治疗鱼中发现与剂量200毫克/公斤。
T2, MMC比例显著增加与茶多酚的浓度相比,未经处理的鱼(图7)。
在T1和T2,所占据的区域控制MØ下降相比,治疗鱼。相反,所占据的区域间增加polyphenol-administered鱼。特别是MØ区域显示,控制和治疗无统计差异鱼T1和T2。相反,MMC地区高治疗鱼相比,控制在T2与多酚浓度(图8)。
4所示。讨论
茶多酚具有抗氧化和抗炎活动以获得一系列数据记录在动物和人类55- - - - - -59]。源于概念,养殖鱼类面临连续抗原压力由于在水产养殖集约化饲养条件下,一个健壮的刺激他们的免疫系统可能发生。原则上,微生物挑战以及环境的侮辱(如紫外线)可能会引发早期保护性免疫反应在鱼类可能转化为慢性炎症的一个持久的免疫刺激(60,61年]。最终,这病态条件可能会增加鱼的死亡率在水产养殖和/或低质量的肉的饮食消费。
根据这些考虑,我们对养殖鲈鱼polyphenol-enriched饲料为了评估假定的肠道和脾免疫反应的修改。
释放细胞因子治疗肠道和脾脏的和未经处理的鱼已经评估的条件下短期(2 h)或长期文化(24小时)。事实上,在此之前,它已经证明了鱼类细胞因子的生产是根据长度不同培养时间的免疫细胞(62年]。
对il - 1β这个细胞因子的浓度,减少对样品GP相比控制2 h后孵化。在脾脏,没有显著差异之间观察到传统喂和多酚喂动物。众所周知,il - 1β是一种促炎细胞因子,其特征是信号在哺乳动物的保护功能和硬骨鱼类的血统63年]。原则上,il - 1β保护宿主免受潜在的病原体,而产生有害的炎性环境对于其夸大生产持续刺激的反应。所证明的在体外研究与鲈鱼、头肾白细胞刺激Vagococcus fluvialisL-21 upregulation il - 1的β和肿瘤坏死因子(TNF)α表明早期炎症反应(64年]。这也证实了斑马鱼实验后组织损伤(65年]。在我们的实验模型中,il - 1β减少治疗似乎与样本少鱼死亡率和感染(准备手稿)的频率降低,从而表明潜在的多酚施加有益的影响。很有趣的是,在我们的鱼样本脾il - 1的生产β远低于观察肠道,从而提出更有效的脾脏吞噬细胞的能力有效地破坏病原体,从而导致他们立即清除。相反,在肠道的队伍MØ以及淋巴细胞,所记录的数字9 (b),可能会导致病原体的持久性与il - 1的连续触发β释放。
(一)
(b)
在哺乳动物中,il - 6是一种急性相反应物也参与造血作用,炎症和免疫调节,甚至包括抗体生产(66年]。在鱼、稀缺的信息可以在il - 6的功能尽管最近鉴定的基因。此外,il - 6诱导表达il - 1β还有待澄清在鱼67年]。在我们的测试系统,降低il - 6的值发生在GT与剂量200毫克/公斤(T1 / 2 h)和脾(T1 200毫克/公斤/ 24小时)。
关于干扰素-γ生产,众所周知,这种细胞因子,主要发布的T辅助(h) 1细胞和Th1-like细胞[68年,69年),是高度保护对细胞内的细菌和病毒感染宿主。在我们的实验中,干扰素-γ主要是增加脾脏的影响下多酚,从而表明一个更主要的免疫自适应功能发挥的淋巴器官相比,肠道。很有趣的是,在大西洋比目鱼,实验感染nodavirus,增加T细胞标记和干扰素的水平γ成绩单已经观察到的鲁棒自适应免疫反应的一个例子。在相同的情况下,在体外实验也表明il - 6和干扰素的干预γ与CD8的参与β针对nodavirus +细胞(70年]。此外,荣格和同事(71年)报道,重组干扰素-γ保护橄榄比目鱼(Paralichthys olivaceus)对爱德华菌属(E。)获得性迟发性,从而增加生存相比获得性迟发性大肠治疗组。
在与多酚用于我们的实验中,绿茶管理(72年]虹鳟鱼(雄鱼mykiss)能够调节免疫相关基因表达的一些细胞因子,如il - 1βil - 6,引发,il - 10和TNF -α在脾脏、肝脏和肾脏。一般而言,upregulation观察细胞因子il - 10的减少除外。此外,一个增强绿茶抗氧化系统演示的对待动物。
最后,至于多酚剂量用于我们的饲料而言,没有证明差异之间的100和200毫克/公斤浓度使用。
鱼间视为一个表达式的原始细胞聚集体MØ吞噬各种颜料和细胞碎片也发挥早期预防病原体(16- - - - - -18]。MØ和间质分析表明,多酚诱导治疗增加了MMC数字和相关领域。这意味着MØ可能形成集群产生间,反过来,可能承受更多的保护对病原体的鱼,甚至包括病毒。事实上,我们可以假设所有被困的材料首先吞没MØ然后运到间的处理。值得注意的是,可以观察到间质主要位于附近的血管。减少MØ数量的影响多酚可以解释il - 1的减少β虽然可想而知,间质可能对T淋巴细胞作为抗原呈递细胞,进而释放干扰素-γ。因此,增加间似乎有助于减少死亡率和减少传染性事件养殖鲈鱼。
总之,我们的研究结果证实并扩展先前的数据相关的抗炎和immune-modulating活动所多酚(45,48,59]。这个论点是降低il - 1的支持β和il - 6浓度以及增强脾IFN -γ释放。这种饮食方法可以利用养殖鱼公司的长鱼生存或更多有益的影响对消费者由于更高质量的肉。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
本文是由Regione Puglia-Project Vis马里斯(免不了FESR 2007 - 13 - azione 1.2.4也免不了“Aiuti Sostegno一些Partenariati Regionali / l 'Innovazione”)。