文摘
黄酮类化合物具有几个生物和药理作用。槲皮素(Q),一种天然的类黄酮,可以表达下调炎症反应并提供心脏保护。然而,背后的机制问在心肌细胞的抗炎特性知之甚少。在炎症、一氧化氮(NO)作为促炎介质,被诱导合成一氧化氮合酶(间接宾语)炎性反应剂如脂多糖(LPS),一个病原体在脓毒症心肌抑制。在目前的研究中,我们评估问的保护作用在LPS引起的脓毒症大鼠心脏功能障碍。预处理的H9c2 cardiomyoblasts与Q抑制LPS-induced伊诺表达和生产中和氧化应激引起的不受监管的生产导致的生成过氧硝酸盐和其他活性氮物种。此外,问预处理明显抵消细胞凋亡细胞死亡以免疫印迹的裂解半胱天冬酶3和半胱天冬酶3活动。问也抑制了LPS-induced磷酸化的压力激发了蛋白激酶(物/ SAPK)和p38 MAP激酶参与细胞生长的抑制作用以及诱导细胞凋亡。总之,这些结果表明,问可能作为一种有价值的保护剂在心血管炎症性疾病。
1。介绍
系统性细菌感染与multiorgan障碍包括心力衰竭有关,这是发生在败血症患者发病率和死亡率的主要原因(1,2]。脂多糖(lps),细菌外膜的主要组成部分,已经被证明是发挥关键作用的起始病理生理瀑布(3- - - - - -5]。在腐败的情况下,过度LPS激活许多类型的细胞在识别toll样受体4(地)导致增强生产的促炎细胞因子,引起心肌功能障碍(6- - - - - -8]。最近的研究表明,cardiomyoblasts表达地通过该有限合伙人直接不利影响在心肌细胞生理学9,10]。由LPS激活地触发NF -κB信号和导致减少心肌细胞收缩性和大量的促炎细胞因子的表达如细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1) [11,12),肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)[13,14),诱导一氧化氮合酶(间接宾语)13]。伊诺表达的增加,尤其是细胞检测不到发炎的迹象,可能产生不良的影响15- - - - - -17]。潜在的亚细胞的机制参与这些有害的后果包括过度与各种各样的直接反应的蛋白质和酶包括与氨基反应,硫醇(SH),重氮,和酪氨酰团体,与血红素铁2 +或硫中心(18]。此外,不受监管的没有生产,还与氧化应激有关,可能导致的生成过氧硝酸盐和其他活性氮物种(RNS)改变蛋白质功能通过硝化和氧化反应(16,19,20.]。已经证明降低系统性炎症反应可以改善心肌功能(21]。激活多个压力信号流程,如氧化应激和增殖蛋白激酶(MAPKs)在败血性心脏功能障碍的发病机制中扮演关键角色(22]。而激活ERK1/2 map激酶已被确定增强细胞生长和迁移,压力激发了蛋白激酶物/ SAPK和p38 map激酶参与细胞生长的抑制作用和诱导凋亡[23]。
槲皮素(Q)是类黄酮,更具体地说一个黄酮醇,具有广泛的药理特性,包括抗炎作用[24),抗增殖作用(25),对氧化应激保护作用[26]。富含槲皮素的食物有苹果、红茶和绿茶,洋葱、红酒、红葡萄、柑橘类水果、花椰菜和其他绿叶蔬菜,樱桃和浆果,包括树莓和蔓越橘27]。通常情况下,人类槲皮素血浆浓度在摩尔范围,但在槲皮素的摄入量,他们可能达到微摩尔的范围(28,29日]。最近的一项研究表明,低到中度口服剂量的槲皮素两周增加等离子体槲皮素浓度存在剂量依赖的相关性在健康个体30.),确认其生物利用度。在先前的研究中,我们已经表明,Q是实验的cardiomyoblast H9c2细胞系,抵消心肌氧化应激通过其著名的抗氧化活性和调制的两个关键基本蛋白激酶参与prosurvival信号通路,Akt和ERK1/231日]。此外,我们表明,Q是能够强烈移植不同的抗氧化剂和第二阶段酶在新生大鼠心肌细胞间接证明其抗氧化活性32]。
在本文中,我们评估问在心肌细胞的抗炎作用,关注这多酚的可能机制抵消LPS-induced炎症反应。
2。材料和方法
2.1。材料
PhosSTOP购买从罗氏诊断(德国曼海姆)。CelLytic M, 2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA),哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物,DMEM,胎牛血清(的边后卫)、青霉素、链霉素、谷酰胺,acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcoumarin (Ac-DEVD-AMC)、槲皮素、和其他化学品σ买来的最高级别分析化学(圣路易斯,密苏里州)。
2.2。细胞培养
鼠胚胎heart-derived肌原性的细胞系H9c2(英国索尔兹伯里欧洲收集细胞培养)是生长在DMEM补充10% heat-inactivated的边后卫,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100毫克/毫升),谷酰胺(2毫米)湿润孵化器有限公司为5%2在37°C。细胞分裂在subconfluence 1到4 (80%)。H9c2细胞被播种密度的5×104细胞/厘米2治疗前72小时。
2.3。测量一氧化氮产量
亚硝酸盐发布一个稳定的产品没有在水介质,测量使用格里斯试剂系统(WI Promega,麦迪逊,美国)。简而言之,H9c2细胞治疗30μM Q刺激10前2小时μg / mL有限合伙人为24小时。这个时期结束时,培养基是与同等容积的磺胺混合溶液(1%,5%磷酸)和N-1-naphtylethylenediamine盐酸盐溶液(0.1%水)。吸光度测量540海里。亚硝酸盐浓度测定校准曲线的标准0.1亚硝酸钠浓度0.5 -25μ对吸光度。
2.4。细胞内活性氧的检测
活性氧的形成是评估使用荧光探针,DCFH-DA,被王约瑟(33]。简单地说,H9c2细胞使用30μM Q 24 h,然后孵化与5μ在PBS M DCFH-DA 30分钟。DCFH-DA去除后,细胞被刺激和10μg / mL有限合伙人为不同时期(0.5 -24小时)。细胞荧光测量使用485 nm励磁和535海里排放微型板块荧光谱仪(VICTOR3 V Multilabel计数器,优秀的,韦尔斯利,MA)。细胞内抗氧化活性是控制细胞的百分数表示。
2.5。Caspase-3活动分析
caspase-3的活性测定的水解Ac-DEVD-AMC caspase-3,导致释放荧光7-amino-4-methylcoumarin一半(AMC) [34]。H9c2细胞治疗30μM Q刺激10前2小时μg / mL有限合伙人为不同时期(0.5 -24小时)。细胞溶解产物的裂解缓冲(50毫米三,0.1% Triton x - 100, 150毫米氯化钠,2毫米EGTA / EDTA、焦磷酸钠1毫米,10毫克/毫升phenylmethylsulfonyl氟化物,1毫米钒酸钠,50 mM氟化钠,和1毫克/毫升抑肽酶),然后离心5分钟在5000 g和上层清液添加到分析缓冲区(100毫米消息灵通的pH值7.0,5毫米二硫苏糖醇,家伙0.1%,蔗糖10%,和0.15毫米Ac-DEVD-AMC)。的具体乳沟fluorogenic肽Ac-DEVDA-MC监测后AMC乳沟在370 nm兴奋和455海里排放。一个单位被定义为底物的酶活性裂开的1.0 nmol每分钟25°C条件下描述。
2.6。西方免疫印迹
H9c2细胞治疗30μM Q和2小时后刺激了10μg / mL有限合伙人为不同时期(0.5 -24小时)。细胞用冰冷的PBS和蛋白质提取与CelLytic M细胞裂解试剂与哺乳动物蛋白酶抑制剂(1:100稀释)和PhosSTOP混合物。蛋白质在98°C煮3分钟加载缓冲区(62.5毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8包含2% SDS, 2-mercaptoethanol 5%, 10%甘油和0.0025%溴酚蓝)。蛋白质提取被sds - page分离(20μg / lane),然后转移到硝酸纤维素(Hybond-C;通用电气医疗集团、英国白金汉郡)在110 V 90分钟使用Tris-glycine缓冲区。膜被孵化在阻断缓冲区包含5% (w / v)脱脂牛奶和anti-NOS2孵化,anti-phospho SAPK /物(刺183年/酪氨酸185年),anti-SAPK /物,anti-phospho p38 MAPK, anti-p38 MAPK(细胞信号技术,贝弗利,MA)和反β肌动蛋白(σ),一夜之间在一个三维的摇表4°C。这些墨迹被孵化与山羊anti-rabbit免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶在室温下60分钟。化学发光的结果可视化使用ECL试剂根据制造商的协议(通用电气医疗集团)。进行半定量的分析,具体immunolabeled乐队使用萤石年代图像分析仪(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。
2.7。蛋白质浓度
细胞溶解产物的蛋白质浓度是由Bio-Rad布拉德福德蛋白质化验(Bio-Rad实验室)。
2.8。统计数据
每个实验至少进行三次,和所有的值表示为±SD方法。单向方差分析(方差分析)是用来比较不同组间Bonferroni紧随其后的测试(棱镜5 GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。的值被视为具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。问对伊诺表达的影响,没有生产
这项研究的第一个目的是识别的效果有限合伙人治疗伊诺表达式(图1)。有限合伙人治疗(10μg / mL) H9c2细胞伊诺0.5小时不影响蛋白表达。相反,LPS刺激2和24小时能显著诱导伊诺。特别是,有限合伙人增加了酶蛋白表达时间的方式(,)。治疗30μM Q仅2小时没有影响伊诺蛋白表达,而预处理Q,有限合伙人曝光之前,能够显著降低伊诺蛋白表达在每个LPS刺激的时间。
我们下一个评估总亚硝酸盐版本作为一个指示器的生产(图2)。24小时在LPS刺激对伊诺的影响最强烈的蛋白表达,这次我们使用刺激H9c2。与以前的结果一致,有限合伙人显著增加培养基中没有的释放,30岁μM Q就不影响生产,预处理和30μM Q LPS刺激前显著降低生产水平与控制细胞。
3.2。问对细胞内活性氧的影响生产
验证如果RNS的增加伴随着活性氧产量相应增加,我们评估H9c2细胞胞内活性氧积累与LPS刺激不同时期的存在或缺乏30μM Q(图3)。细胞内ROS水平显著增加细胞内与LPS刺激控制细胞相比,24小时的DCF荧光的增加。然而,DCF荧光显著的增加减少了Q预处理表明Q能够降低LPS刺激后细胞内活性氧积累。
3.3。问在H9c2 LPS-Induced凋亡细胞的影响
问了凋亡的影响在不同的细胞类型,因此,我们下一个调查问是否保护cardiomyoblasts LPS-induced细胞凋亡。H9c2细胞使用30μM Q暴露前10μg / mL有限合伙人对不同曝光时间和裂解半胱天冬酶3蛋白表达(图4(图)和半胱天冬酶3活动5)进行评估。免疫印迹分析表明,24小时与LPS刺激诱导半胱天冬酶3方面的一个重要乳沟来控制细胞,而0.5和2小时有限合伙人曝光时间没有影响裂解半胱天冬酶3。预处理前与Q LPS刺激能够强烈减少乳沟半胱天冬酶3级别与控制细胞。问就不修改半胱天冬酶3裂。这些数据经半胱天冬酶3活动分析。只有24小时LPS刺激能够显著提高半胱天冬酶3活动和预处理问显著降低半胱天冬酶3活动水平与控制细胞,证明Q的凋亡效应对LPS-induced损伤。
3.4。问对LPS激活MAPK在H9c2细胞
更好的澄清问背后的机制防止LPS诱导细胞凋亡,我们研究了Q调制的两个基本的角色proapoptotic H9c2细胞信号通路:物和p38 MAPK。H9c2细胞使用30μM Q暴露前10μg / mL有限合伙人对不同曝光时间和细胞溶解产物分析免疫印迹和anti-phospho-p38 anti-p38抗体(图6(图)或anti-phospho-JNK和anti-JNK抗体7)。有限合伙人治疗0.5和2小时显著激活p38 MAPK以磷/总p38比率来衡量,最高的增加在0.5小时。在最长的曝光时间p38 MAPK不再是活性磷/总p38比与控制细胞。问能显著抑制p38 MAPK激活。有限合伙人治疗0.5小时显著激活物以磷/总物比率来衡量,而2和24小时LPS刺激后不影响物磷酸化。问能显著降低物有限合伙人曝光时间0.5小时后激活水平与控制细胞。
4所示。讨论
在这项研究中,我们评估的抗炎作用问H9c2细胞表明这种多酚减毒LPS-induced炎性活动抑制伊诺感应,减少生产氧化应激,抵消细胞凋亡的调制两个关键蛋白激酶p38 MAPK和物。
一系列的临床条件与炎症反应的调节异常相关联。虽然这些是脓毒症的最常见,高浓度的细胞因子也由缺血再灌注,创伤、急性排斥反应、抗原免疫反应,和不同的急性炎症状态35]。一些研究显示有益心脏功能障碍通过抑制心脏炎症过程在脓毒症13]。
有限合伙人的革兰氏阴性细菌已被公认为病原体在脓毒症心肌抑郁症(36]。已经表明LPS诱导的炎症反应在心肌细胞的特点是增加活性氧的生产导致转录因子和细胞内信号通路的激活诱导的炎症介质,包括TNF -αICAM-1,进气阀打开。所有的这些介质可能参与心脏功能的抑郁症13,37,38]。在心血管系统,没有由伊诺是脓毒性休克的主要病理生理的中介39),已被证明调解细胞因子的负性肌力作用[40]。与之前的研究结果相一致,使用心肌细胞执行与LPS刺激至少20 h (41,42),我们表明,伊诺蛋白表达和没有显著增加生产LPS-stimulated H9c2。相反,Chen等人的研究。43]证明增加伊诺mRNA水平虽然没有生产不会受到鼠cardiomyoblasts 4 h LPS刺激。这种差异可以归因于较低的有限合伙人曝光时间不可能太短显著增加培养基。在我们的研究中,问治疗能够显著降低伊诺的表情,没有生产。
不可能与超氧化物自由基等活性氧反应产生高活性的过氧亚硝基氧化剂物种,导致更激进的氧化和nitrosative压力(44),我们评估了细胞内ROS生产LPS-stimulated H9c2细胞。正如所料,有限合伙人显著增加细胞内ROS水平而问预处理能够减少这种生产水平与控制细胞。我们之前问的能力进行验证来减少氧化应激在H9c2细胞(31日)在大鼠心肌细胞(32通过直接和间接两种抗氧化机制。
相关的作用没有被诱导细胞程序性死亡,或细胞凋亡,在各种细胞(45]。没有诱导细胞凋亡的能力首先感谢阿宾娜et al。46),显示没有导致巨噬细胞凋亡。许多报告表明缺血再灌注期间事件,没有协调组织损伤(47,48]。此外,诱导细胞因子在初级伊诺的老鼠心脏细胞与细胞凋亡增加,由管理的改善没有合酶的抑制剂,阻塞伊诺的表达在细胞因子反应(45]。这些结果表明没有明显参与心肌病,导致心脏功能受损的贡献。我们的研究结果表明,问能够抵消LPS-induced通过抑制细胞凋亡caspase-3激活并显著减少caspase-3活动。不同机制的研究已经证明,cytoprotection问可能是介导的抑制NF -κB激活(44,49,50),控制炎症介质的表达(51]。激活NF -一个至关重要的一步κB我的退化κ英国航空公司(52]。LPS刺激规范化NF -κ我激活通路通过降解κ英航和NF的磷酸化κB p65亚基(53,54),NF -κB p65随后把从细胞核和细胞质,反过来,引发大量的基因编码的炎症介质(54]。
增殖作用的蛋白激酶(MAPK)的家庭,包括细胞外signal-regulated c-Jun n端激酶1和2(物)和p38激酶,地图中扮演一个重要的角色在细胞命运决定,涉及死亡/存活心肌细胞动作电位信号[55]。证据也表明,活性氧导致LPS-stimulated MAPKs信号通路在心肌细胞(13]。这些发现符合MAPKs信号的关键作用和氧化应激在sepsis-induced心肌收缩功能障碍(13,37,38]。摘要数据报告表明LPS刺激激活p38 MAPK和物。特别是,物激活2 h后快速瞬态和LPS刺激物磷酸化与控制细胞,而p38 MAPK激活持续了至少2 h。我们的数据与结果的协议彭et al。56证明立即和瞬态增加p38 MAPK LPS刺激后激活,这是TNF -紧随其后α生产的抑制心肌和p38 MAPK激活改善心脏功能和生存在小鼠内毒素。激活物信号转导级联已涉及的规定在心肌肥厚性和凋亡反应(57]。彭et al。58)表明,有限合伙人增加物培养心肌细胞的激活。已经证明的激活物/ SAPK H9c2心脏肌肉细胞没有毒性的关键(59),此外,刘等人。60)观察到孵化与JNK1/2 LPS-treated心肌细胞抑制剂SP600125导致显著抑制LPS-induced磷酸化的我κB我退化κB和upregulation TNF -α,导致心肌凋亡反应。
问预处理能够减少两个激酶的活化值与控制细胞,证明问也可能是介导的凋亡效应的调制p38 MAPK和物在脓毒症已经在很大程度上展示了其有害作用。
总之,问抑制伊诺感应LPS-stimulated H9c2细胞时间的方式,没有生产,减少和中和LPS-induced细胞凋亡。这种保护作用可能是介导的抑制激活p38 MAPK和物。因此,这些结果表明,Q可能作为一种有价值的保护剂在心血管疾病和炎症性疾病。
确认
这项工作一直支持由Ministero Sviluppo报称期中(意大利),项目在意大利50,基金会del Monte e di博洛尼亚拉文纳(意大利)。