Ginkgo Biloba Express EGB761可保护D-半乳糖诱导的老化大鼠心肌细胞中的老化相关舒张功能障碍GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

本研究的目的是利用人工诱导衰老模型心肌细胞，进一步研究EGB761抗衰老相关细胞舒张功能障碍的潜在作用，并探讨其分子机制。用d -半乳糖或d -半乳糖联合EGB761处理培养的大鼠原代心肌细胞48 h。治疗后，SA-阳性细胞百分率GydF4y2BaβGydF4y2Ba半乳糖苷酶，AGEs生成，心脏肌浆网钙泵（SERCA）的活性，心肌肌质网钙摄取和相对蛋白水平进行了测定。我们的研究结果证明，在体外刺激d半乳糖诱导的AGEs生成。加入EGB761的显著降低阳性细胞的数目为SA-GydF4y2BaβGydF4y2Ba-gal。此外，减少了舒张[CA.GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}，从CA的最大浓度缩减时间GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}到基线水平和增加的加州恢复GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}还观察到SR中的商店。此外，P-SER16-PLN蛋白以及SERCA的水平显着增加。该研究表明，EGB761减轻了在Serca2a上形成了年龄的产品，以便在一方面减轻心肌刚度;另一方面，通过增加Ser16位点PLN磷酸化的量，改善SERCA2A功能，这两只手最终导致改善老化心肌细胞的舒张功能障碍。GydF4y2Ba

1.介绍GydF4y2Ba

舒张性心力衰竭（DHF）在老年患者和患有糖尿病，高血压，肥胖症，心脏缺血等患者中最常见的患者。现有研究显示，氧化应激，NAD（P）H氧化酶表达，蛋白质羰基形成，蛋白质氧化和蛋白质改性以及增强年龄水平的升高（P）[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．DHF的主要原因是心脏老化，称为具有晚期心脏泵功能的剧烈下降，导致舒张功能障碍[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．由于对心脏舒张功能不全的机制缺乏了解，目前临床对DHF患者的治疗令人失望[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．因此，在分子水平上了解衰老心肌舒张功能障碍的机制，对于DHF与衰老相关的特异性治疗靶点尤为重要。GydF4y2Ba

D-半乳糖是还原糖，在体外和体内蛋白质和肽中的氨基酸中的游离胺在蛋白质和肽中的游离甘露胺反应，形成先进的糖糖末端产品（年龄）[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．年龄在衰老过程中会增加，并与许多与年龄相关的疾病的发病机制有关，如糖尿病、动脉硬化、肾病、感染和阿尔茨海默病[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．我们之前的研究表明，d -半乳糖注射导致衰老表型加速，表现为AGEs水平升高，与成年大鼠相比，d -半乳糖喂养的衰老大鼠存在明显的心脏重构。表现为左室后壁和室间隔厚度增加，左室重量增加，舒张功能受损。MDA、mtDNA和AGEs含量显著升高;SOD、GSH-PX含量降低。因此，我们通过d -半乳糖干预在体内模拟衰老过程，研究与衰老相关的心脏舒张功能障碍。GydF4y2Ba

心肌舒张功能障碍的发生率与升高的心肌刚度和静止张力有关（GydF4y2Ba）这导致舒张可分能力下降。心肌刚度的增加主要是与心肌插形胶原沉积的交联，而后者主要与异常心肌肌肉钙质钙转运调节蛋白相关，这导致了舒张阶段的细胞内钙过载[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．细胞内钙稳态的失调在老年的心肌细胞中起着重要作用，这导致舒张性心力衰竭。CA细胞内浓度过度增加GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}从细胞溶溶胶到肌内肌肉内腔的钙离子的转向钙离子受损将导致CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}过载，从而产生心肌舒张功能障碍[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

由于细胞内钙主要由心肌肌肉肌肉钙转运调节蛋白的活性调节，从胞嘧啶的去除钙可以通过莎草/内质网胆碱三磷酸三磷酸（Serca）的活性降低或水平增加而延迟磷蛋白（PLN）的活性，即SERCA抑制蛋白[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．Serca和PLN功能障碍可能导致细胞内钙过载，进一步引起舒张性功能障碍[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

EGb761 is a standard extract from the leaves of Ginkgo biloba (Yinxing) containing 24% ginkgo-flavone glycosides (e.g., kaempferol, quercetin, and isorhamnetin derivatives) and 6% terpenoid (e.g., ginkgolides A, B, C, J and bilobalide) [9.GydF4y2Ba]．许多研究表明，黄酮类化合物清除超氧化物，羟基自由基和一氧化氮（NO）并保护心肌免受缺血再灌注损伤[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba-GydF4y2Ba13GydF4y2Ba[萜类成分还显示出与自由基清除性质无关的心脏保护作用[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

EGB761的心脏保护作用已在体内和体外动物模型和人体内进行了证明。现有文献[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，包括我们的前期研究，已强调了银杏叶提取物通过抑制非酶糖化和减少的AGEs的沉积在心肌组织中[对心肌细胞特定的抗衰老效果GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．然而，由于具有舒张性功能障碍的心脏老化，尚不清楚EGB761是否可以调节心肌肌肉网钙转运调节蛋白以改善老化心肌细胞的舒张功能。在这项研究中，我们旨在探讨培养的D-半乳糖诱导的老化大鼠心肌细胞的可能作用及其分子机制治疗EGB761。GydF4y2Ba

2。材料和方法GydF4y2Ba

2．1.药品和试剂GydF4y2Ba

我们使用的EGb761标准制剂主要含有4.2 mg来自Dr. Willmar Schwabe Pharmaceuticals (Karlsruhe, Germany)的类黄酮;d -半乳糖和咖啡因购自Sigma Aldrich公司(G5388;C1778);Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM)和胎牛血清(FCS)购自Gibco Invitrogen公司(31600-034;16000044);衰老GydF4y2BaβGydF4y2Ba- 高烷基酶（GydF4y2BaβGydF4y2Ba的β-gal）染色试剂盒购自Cell Signaling购买（无9860）。大鼠的AGEs ELISA试剂盒购自ADL技术有限公司（E0263r）购买。增强的化学发光（ECL）Western印迹检测试剂盒获自Pierce罗克福德，IL，USA购买。使用其它材料进行了详细的在下面的章节中指定。GydF4y2Ba

２.２.心肌细胞原代培养GydF4y2Ba

新生儿心肌细胞从1-2天的20岁的Sprague-Dawley大鼠获得。使用先前描述的协议收获心脏组织[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．将来自大鼠的心室切碎并在37℃下在0.06％胰蛋白酶中解离。将将解离的肌细胞置于补充有20％胎牛血清和100u / ml青霉素和在50mL的康宁细胞培养瓶中的37℃下的胎儿霉素和链霉素，5％COGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，最小化非肿瘤细胞通过粘附到烧瓶底部。然后除去非附着的肌细胞并镀（5-6×10GydF4y2Ba^5.GydF4y2Ba/ ml）在37°C的室内空气中进入六孔培养簇，5％COGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．After incubation for 48 h, 80% of the attached myocytes were beating spontaneously and were used for further experiments. All procedures were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health Publication no. 85-23, revised 1996).

2.3。d半乳糖治疗方案GydF4y2Ba

d -半乳糖诱导治疗方案如前所述[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．一旦附着的肌细胞自发地敲击，将补充有20％胎牛血清的DMEM被除去，并将补充有5g / L D-半乳糖的DMEM在培养基中的心肌细胞中加入另外48小时培养期。此外，对于心脏保护研究，在5,10和20的浓度下加入EGB761 Plus D-半乳糖中的培养基中 μ.GydF4y2Ba克·毫升GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba整个治疗。GydF4y2Ba

2.4。SAGydF4y2BaβGydF4y2Ba-gal染色GydF4y2Ba

Senescence-associatedGydF4y2BaβGydF4y2Ba半乳糖苷酶（SA-GydF4y2BaβGydF4y2Ba-gal）活性测量GydF4y2BaβGydF4y2Ba根据制造商的说明，pH 6.0的染色试剂盒。简而言之，将细胞在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，在室温下固定10-15分钟，用1ml固定溶液在37℃下在37℃下孵育过夜。观察到细胞用于在×400放大率下用显微镜进行蓝色着色。GydF4y2Ba

2.5。年龄ELISA测定GydF4y2Ba

根据制造商的说明，用年龄ELISA试剂盒进行年龄测定。将试剂盒的试剂在室温下置于室温30分钟并用蒸馏水稀释1：20。等分试样100 μ.GydF4y2Ba的标准品和样品L的添加到空白的微孔和50 μ.GydF4y2Ba加入L-酶标记物溶液。Microtiter plates were incubated at 37°C for 60 min and then washed five times and put aside for 10–20 s each time. The A and B substrate solutions (50 μ.GydF4y2BaL）在37℃下加入微量滴定板15分钟的黑暗反应。通过添加50次终止反应 μ.GydF4y2Ba用超微孔板读卡器(ELX 808iu, Bio-Tek Instruments Inc.)测定450nm处的光密度(OD)。生成AGEs标准曲线，并根据标准曲线计算样品的AGEs值。GydF4y2Ba

2.6。心脏Serca活性的测量GydF4y2Ba

通过在我们的实验室通常使用的改性的对硝基苯基磷酸（P-NPP）方法测定Serca活性[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．简单地，心肌细胞均质并在4°C离心15分钟。一个10GydF4y2Baμ.GydF4y2Bal在37℃下预孵育10分钟的等份上清液 μ.GydF4y2Bal含有以下10的缓冲溶液 μ.GydF4y2Bal mgcl.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba10. μ.GydF4y2Bal EGTA，10 μ.GydF4y2Bal KCL，30或40 μ.GydF4y2Bal hepes（pH 7.4）和10 μ.GydF4y2Bal 0.01％Tritonx-100，无论是在还是没有10 μ.GydF4y2BaL CaClGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．磷酸酶反应开始于添加10GydF4y2Baμ.GydF4y2Bal10 mM p-NPP六水二钠，加入100GydF4y2Baμ.GydF4y2BaL 500 mM Tris (pH 8.7)和55 mM EDTA。用酶标仪(ELX 808 IU)在405 nm波长下测定释放的对硝基苯酚，并生成标准曲线。SERCA活性表示为每克蛋白质在一分钟内产生的对硝基苯酚的量(GydF4y2Baμ.GydF4y2Ba摩尔/ g /分钟)。GydF4y2Ba

2.7。测量[CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}和CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}加载GydF4y2Ba

细胞培养皿（Corning Inc）和[CA的田间肌细胞GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}测量方法如前所述[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]，使用Fura-2/AM (2.0GydF4y2Baμ.GydF4y2BaM, Invitrogen) for 30 min at 37°C. SR Ca^{2＋GydF4y2Ba}负荷测量为Δ的[CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}快速暴露于10mm咖啡因时的振幅。将340nm激发为380nm激发（F340 / F380比率）的背景校正荧光比例被认为是[CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}．从CA的最大浓度的时间GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}至基线水平的时间视为SR Ca的时间GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}吸收。GydF4y2Ba

2.8。免疫印迹GydF4y2Ba

用冰冷的细胞裂解试剂含有含蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Bi Yun Tian，China，P0013）裂解细胞以提取细胞质蛋白。细胞质的蛋白质浓度由双链烷酸（BCA）蛋白质浓度测定测定。将等量的蛋白质提取物分离成16％SDS / PACE并呈涂上聚偏二氟化乙烯（PVDF）膜（Millipore，Technology Inc）。将膜在4℃下堵塞并探测过夜，用对Serca2a（1：1000，Abclim）和Ser16 / Thro17-磷酸化的磷蛋白（P-PLN）（1：1000，Abcam Inc / 1：100，圣诞老人）的一抗，探测过夜Cruz Inc）和GAPDH（1：3000，Sigma），然后在室温下与辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗孵育1小时。使用ECL检测系统开发墨迹并暴露于X射线膜。通过GEL-Pro分析仪软件分析了标准化的带密度，并表示为GAPDH的比率。GydF4y2Ba

2.9。统计分析GydF4y2Ba

所有数据均以均数±标准差(SD)表示。采用方差分析进行多组比较。使用origin7.0 (OriginLab, USA)进行所有统计分析。在每种情况下,GydF4y2Ba被认为是统计学意义的。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

3.1。EGB761防止了SA的增加数量GydF4y2BaβGydF4y2Ba-gal阳性细胞和年龄的形成GydF4y2Ba

为了研究心肌细胞治疗d半乳糖是否表现出衰老的表型，我们研究了SA的数量GydF4y2BaβGydF4y2Ba- 所有心肌细胞中的阳性细胞。在D-半乳糖诱导的心肌细胞，SA的比例GydF4y2BaβGydF4y2Ba-gal阳性心肌细胞明显增多。加入EGB761的显著降低阳性细胞的数目为SA-GydF4y2BaβGydF4y2Ba-gal以剂量依赖的方式，最佳浓度为20 μ.GydF4y2Ba克·毫升GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba（GydF4y2Ba每组的大鼠数量和GydF4y2Ba实验复制;GydF4y2Ba与D-半乳糖）。GydF4y2Ba

同时，AGEs被认为是心脏衰老的重要标志之一。本研究中，d -半乳糖处理组AGEs含量显著升高。不同浓度EGB761处理组的AGEs水平显著降低(GydF4y2Ba每组的大鼠数量和GydF4y2Ba实验复制;GydF4y2Ba对D-galactose)(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

３．２．EGB761对细胞内[CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}和CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}加载GydF4y2Ba

细胞内Ca.GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}超载是引起DHF的主要因素之一。然后我们使用CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}指示器Fluo2 / AM，以确定的AGEs的作用，对细胞内的[CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}中，时间的CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}摄入肌肉网和SR CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}加载。在D-半乳糖基团中，舒张增加[CA.GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}， CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}与基线水平与对照组比较延长（GydF4y2Ba）.灌注10 mM咖啡因后，咖啡因诱导的钙的振幅瞬变(Δ[CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}）在D-半乳糖治疗组中也有所下降。但是，上述效果逆转了20 μ.GydF4y2Ba克·毫升GydF4y2Ba^-1GydF4y2BaEGB761（GydF4y2Ba每组的大鼠数量和GydF4y2Ba实验复制;GydF4y2Ba与D-半乳糖）。在比率代表变化示于表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

3.3。EGB761对心肌细胞Serca活性的影响GydF4y2Ba

探讨EGB761在细胞内[CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}和CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}加载。，SR CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}测量心肌细胞中的酶（Serca）活性（表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.在D-半乳糖基团中观察到SERCA活性的明显抑制，并且该抑制效果衰减20 μ.GydF4y2Ba克·毫升GydF4y2Ba^-1GydF4y2BaEGB761治疗（GydF4y2Ba每组的大鼠数量和GydF4y2Ba实验复制;GydF4y2Ba与D-半乳糖）。GydF4y2Ba

3.4。EGB761对心肌细胞肌肉网钙转运调控蛋白表达的影响GydF4y2Ba

为了探讨EGB761保护患者抗衰老相关舒张功能障碍的潜在机制，蛋白质印迹测量钙转运调节蛋白的蛋白质水平。如图所示GydF4y2Ba2GydF4y2Ba在d半乳糖处理的心肌细胞中观察到的SERCA2a蛋白的表达的约60％下调，而它在另外的银杏叶提取物增加了与d半乳糖组相比（GydF4y2Ba）.由于PLN对Serca2a上的抑制作用取决于PLN，P-SER的磷酸化水平GydF4y2Ba^16GydF4y2Bapln和p-ThrGydF4y2Ba^17GydF4y2Ba-PLN蛋白表达。如图所示GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，p-ser的水平GydF4y2Ba^16GydF4y2Ba-PLN蛋白表达与对照组相比，d半乳糖处理的心肌细胞中显着降低了54％，而它是在银杏叶提取物组中的（增加的GydF4y2Ba与D-半乳糖）。但是，p-thr的水平GydF4y2Ba^17GydF4y2Ba-PLN蛋白表达显示在任何组没有显著变化（GydF4y2Ba大鼠数量和GydF4y2Ba实验复制;GydF4y2Ba与D-半乳糖）。GydF4y2Ba

4。讨论GydF4y2Ba

与在体内的发现衍生的AGE，然后几个细胞表面AGE结合蛋白，许多研究已经致力于研究AGE形成和年龄的潜在生物效应[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．几个早期的报道显示，D-半乳糖处理的动物中的自由基增加，并提出了增加的自由基可能考虑负责衰老加速的下划线机制[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．然而，Song等人早期研究的数据表明，衰老变化不是d -半乳糖特异性的，氨基胍作为防止糖诱导衰老变化的AGE抑制剂，表明在这个模型中，糖基化而不是自由基是衰老的主要原因[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．在我们目前的研究，心肌细胞与d半乳糖慢性孵育已被用作人工诱导心肌细胞老化的AGEs形成模型和进一步调查EGB761的潜在的抗老化相关舒张功能障碍的效果和潜在分子机制。GydF4y2Ba

衰老表型与典型的基因表达分布相关[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba];在衰老形态增加衰老相关GydF4y2BaβGydF4y2Ba牛乳糖(SA)GydF4y2BaβGydF4y2Ba-gal）活动[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]．我们的数据显示，SA的数量GydF4y2BaβGydF4y2Bad -半乳糖处理48 h后，所有心肌细胞-gal阳性细胞均显著增加。与对照组相比，细胞内AGEs含量显著升高。证实体外成功建立了d -半乳糖诱导心肌细胞衰老模型。这与之前文献中的观点一致，即AGEs的积累可能与衰老有关[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．当EGB761被包括在内时，SA的数量GydF4y2BaβGydF4y2Ba- 阳性细胞和细胞内年龄含量显着降低，这可能表明EGB761可以衰减细胞内形成的年龄并延迟细胞衰老。GydF4y2Ba

松弛功能障碍已在衰老心肌中显示[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]．在细胞水平，抑郁的弛豫反映了抑制细胞溶质CA的损伤GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}降低心脏SR CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}装。来自我们目前的研究的数据描绘了积累在心肌细胞上的年龄导致细胞内CA损害GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}处理，这是舒张增加的主要原因[CA.GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}和老年心肌细胞的延长弛豫持续时间。同时，类似于Petrova等人报告的结果。[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．早在1996年，就有报道说，所有这些CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}去除系统在糖尿病中抑制在功能上[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．我们的研究结果还表明，咖啡因引起的钙GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}瞬态，是CA储备的指示GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}在SR中，显着减少。但是，给予EGB761可以增加CA的再生GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}商店在SR，缩短了时间的SR CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}摄取和舒张减少[CAGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}]GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}在心肌细胞。这些发现表明EGB761可以防止心肌细胞中的衰老相关的舒张功能障碍。GydF4y2Ba

同时CaGydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}循环是心肌细胞收缩和扩张的关键决定因素。在哺乳动物弛豫期间，约70%的胞质钙GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}在PLN的调节下部分地通过SERCA2A返回到肌肉网上，并通过血浆膜CA的作用部分挤出到外部培养基GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}ATP酶（PMCA，2％）和NAGydF4y2Ba^+GydF4y2Ba/ ca.GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}热交换器（NCX，28％）[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．因此，改变了Serca2a蛋白和/或其调节蛋白PLN的水平和/或活性可能影响心脏细胞内Ca的稳态GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．随着PLN磷酸化状态是调节Serca功能的关键因素，在我们的研究中研究了Ser16和PLN Thr17位点的主要磷酸化状态[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．我们的数据显示，由于AGEs的积累，SERCA2a的功能受到了显著抑制，包括活性和蛋白水平。这与Bidasee等人的结果一致。他们首次表明，在糖尿病心肌病大鼠中，心脏舒张率的延长可能归因于糖尿病诱导的SERCA2a上AGEs(交联和非交联)形成的增加。此外，他们还发现AGEs的形成可能会降低PLN丝氨酸-16和苏氨酸-17磷酸化的量[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

然而，在EGB761添加剂的情况下，抑制抑制的效果被释放。其次是下一个实验，为了确定PLN的哪种磷酸化残留物在心肌细胞中涉及抗衰老相关的舒张功能障碍，我们确定了P-SER16-PLN和P-THR17-PLN蛋白的量。我们的数据表明，在D-半乳糖处理的心肌细胞中观察到降低的P-SER16-PLN蛋白质水平;与D-半乳糖组相比，EGB761组中增加了（GydF4y2Ba）.而p-苏氨酸的蛋白水平GydF4y2Ba^17GydF4y2Ba-PLN在任何组中与对照组相比均无显著变化(GydF4y2Ba）.因此，这些结果可能暗示SERCA和PLN的活性和磷酸化状态都参与了心脏舒张功能障碍的发病机制。这是可能的，银杏叶提取物可通过改善Ser16位点的磷酸化兹罗提的量上调SERCA2a的功能，进一步提高了细胞内钙的平衡障碍GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}．GydF4y2Ba

由于标准的EGB761制剂主要含有4.2mg类黄酮类化合物和其他未知的复杂组合物，我们的结果与表明表明类黄酮组分的报告一致，所述黄酮组分通过增加SER16位点PLN磷酸化量来保护SERCA2A功能的效果。，衰减细胞内钙过载[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．Abdel-Kader等人。还证实了槲皮素显示出与EGB761类似的抗氧化效果，表明银杏苷糖苷可以是EGB761和其他未知复杂的组合物对内质网的影响，以及我们纸张中测试的其他表型可能是多因素，包括其抗氧化剂，抗血糖和其他性质[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．在我们目前的研究中，我们治疗EGB761 Plus D-半乳糖孵育心肌细胞，可以有效地抵消这种衰老相关舒张功能障碍的这种作用。有可能表明EGB761提取物可能是衰老和年龄相关疾病的假设预防治疗，可能可能保护心脏免受年龄的形成[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

携带在一起，由于心脏舒张功能障碍，它与升高的心肌刚度和静止张力有关（GydF4y2Ba），它是可能的银杏叶提取物至少部分地衰减对SERCA2a蛋白的非酶糖化AGEs形成（交联以及非交联）在心肌细胞中，一方面，使之减轻心肌硬度。上另一方面，它通过增加Ser16位点的磷酸化PLN，其下降在舒张期的细胞内钙超载的量提高的SERCA2a功能。银杏叶提取物的两只手的影响可能防止衰老相关舒张功能的心肌细胞。在这种情况下，银杏叶提取物的提取物或它的一些化合物可用于预防在对患者在临床实践中舒张功能障碍的心脏的改变的新的治疗策略。GydF4y2Ba

5.结论GydF4y2Ba

综上所述，EGb761作为一种“抗衰老”的草药，在中国已经使用了数千年，可以治疗与衰老相关的疾病。我们的工作首次在体外直接证明了EGB761在心肌细胞中抗衰老相关舒张功能障碍的作用GydF4y2Ba．GydF4y2BaEGB761可以缓解心肌刚度和静止张力（GydF4y2Ba）因此，保护​​心肌细胞中的衰老相关的舒张功能障碍。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

J. Liu和J. Wang同样为这项工作贡献。GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

来自中国国家自然科学基金（No.30772781和30900602），江苏省（BK2011382）的国家自然科学基金，江苏省（2011WSN-029）的“六高峰天赋”提供了这项工作。Y. Guo。GydF4y2Ba

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