文摘

突触功能障碍被认为发挥重要作用在阿尔茨海默病(AD)的记忆障碍。PARP-1已经被确认为一种表观遗传调节器的可塑性和记忆。因此,我们假设PARP-1可能改变在后期海马体的广告相比,年龄组没有神经系统疾病。我们发现PARP-1水平的降低海马锥体细胞中核仁的免疫组织化学染色法在广告。核仁的PARP-1染色范围从分散和强烈的完全没有广告相比明显核仁的定位海马锥体神经元控制。在广告的情况下,海马锥体细胞的百分比与核仁阳性PARP-1和核仁的标记fibrillarin明显低于控制。PARP-1核仁的表达成为一个敏感的标志广告功能的变化,提出一个新颖的广告PARP-1失调的病理作用。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)、老年痴呆的最常见原因,是一种不可逆转的进行性神经退行性疾病临床表现为记忆丧失和认知能力下降1]。AD病理特征是通过突触损失和胞外β-淀粉样蛋白(的积累β在细胞内)、神经炎的斑块和过度磷酸化τ神经原纤维缠结(非功能性测试)2- - - - - -4]。其中,突触损失最密切与认知能力下降(5),而β-淀粉样蛋白积累、神经炎的斑块的存在,非功能性测试做病理标记需要明确诊断的广告(6]。

突触可塑性的失败已被建议作为广告的记忆障碍的作用机理(7,8]。核染质的再塑造酶聚(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1)扮演着重要的角色在突触可塑性和记忆的巩固海兔和啮齿动物(9- - - - - -11]。这种酶参与保利(ADP)核糖基化(PAR),使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)形成支ADP-ribose聚合物核受体蛋白质,如DNA聚合酶、连接、组蛋白。这种表观遗传修饰导致染色质结构的放松让修复蛋白质和DNA转录因子来访问(12,13]。PARP-1激活导致基因的表达等需要记忆的巩固立即早期基因(14)和核糖体RNA基因(rDNAs)核仁(15]。此外,PARP-1也已被证明能够调节核仁的功能的多个领域,包括继承rDNA染色质结构,编辑前体rRNA,生源论核仁的核糖体(16,17]。突触可塑性以来已被证明是受损在广告中,我们假设这障碍可能是由于PARP-1和中断的损失在核仁PARP的作用在维护核仁的完整性。开始解决这一假说,我们比较PARP-1表达后期海马神经病理证实患者脑组织来源于广告控制患者的脑组织海马没有显著的神经病理学。我们表明,PARP-1阳性染色的核仁在CA1和CA4海马锥体细胞神经元控制广告相比显著降低。我们建议在广告可能是由于记忆障碍,在一定程度上,这部小说发现。这种损失的核仁的PARP-1广告出现部分是由于蛋白质的定位错觉的核仁。在这里,我们提出一个模型的损失核仁的PARP-1先于核仁的功能和完整性的变化在早期阶段的广告。

2。材料和方法

2.1。案例材料

石蜡包埋组织块从鉴定海马体收集归档材料的阿尔茨海默病研究中心(ADRC)埃默里大学医学院的阳光健康研究所大脑和身体的捐赠项目的阳光城市,亚利桑那州(18,19),国王县医院中心,纽约州立大学州南部医学中心。

从两组个体死亡的脑组织收购(表1):(1)组织的广告组包括男性和女性患者神经病理证实符合标准的广告“明确的”阿尔茨海默病的诊断根据财团建立阿尔茨海默氏症(注册表20.)和高可能性NIA里根痴呆是由于广告的标准(21)和对照组(2)由个人,男性和女性,年龄相仿的广告组,没有已知的历史痴呆或神经障碍和不重要的神经病理学。广告案例已经第5 Braak分数和控制Braak得分为0,我,或二世(表1)。

表1
解剖案例材料。
2.2。组织准备

样本deparaffinized、水分和淹没在10毫米柠檬酸缓冲(pH值6.0)和微波辐照(15分钟)抗原检索。然后光或共焦显微镜使用的样本的“Y”表1。

2.3。免疫组织化学PAR和PARP-1光学显微镜

抗原检索后,幻灯片被冲洗5分钟,特里同x - 100 0.1%磷酸盐(PBS-Triton),接受3%的H2O2与PBS-Triton 20分钟,冲洗5分钟,封锁在2%正常马血清PBS-Triton 30分钟,和孵化主要抗体(anti-PAR多克隆,1:200;猫# 4336 - bcp - 100, Trevigen;PARP-1单克隆抗体,1:200;猫# 1522 g, AbD Serotec)一夜之间在湿度室。部分被冲洗PBS-Triton孵化1 h,生物素化的二次抗体马anti-mouse(1: 200)稀释在拦截器(VECTASTAIN ABC系统,矢量实验室),再次冲洗,并开发了使用ABC系统(向量实验室,伯林盖姆,CA),使用标准的组织学过程。上面提到的控制,部分被视为遗漏的主要抗血清(1:200)。

2.4。免疫组织化学的PARP-1共焦显微镜
2.4.1。单一免疫组织化学PARP-1

单一immunofluorescent可视化,样品被封锁的1 h和2%正常山羊血清(上天)PBS-Triton然后孵化隔夜PARP-1单克隆抗体在拦截器(1:200)稀释。PBS-Triton各清洗3次10分钟后,样本孵化4 h和山羊anti-mouse-biotin F (ab)片段(1:200)在拦截器缓冲区,冲洗3次PBS-Triton 10分钟,孕育了两个小时,喉炎的Alexa 647(1: 200)和DAPI(1: 500)在拦截器缓冲区。部分被PBS-Triton和蒸馏水清洗,浸泡5分钟在苏丹70%的乙醇含有0.3%的黑人,在蒸馏水冲洗,安装在玻璃幻灯片延长黄金(分子探针,尤金或)。上面提到的控制,部分被视为遗漏的主要抗血清。

2.4.2。双免疫组织化学PARP-1和Fibrillarin

双免疫组织化学是类似于单一免疫组织化学除(a)第二个主要抗体(兔子anti-fibrillarin抗体,1:100;猫# ab5821 Abcam)孵化期间使用隔夜和(b)第二个二级抗体(荧光素山羊anti-rabbit;1:200表达载体,热费希尔科学、格伦岛,纽约)与二次抗体在孵化期间使用。

2.5。量化

定性的评估使用光和共焦显微镜进行免疫组织化学染色决心是强大的(光学显微镜)或高强度(用于共焦显微镜)薄弱或缺席。每个幻灯片的图像被放大400倍和三个随机选择的字段中的所有细胞内指定地区存在与否的核仁的染色。共焦显微镜,所有图片在同一参数预置部分沾不上主要抗体。使用成对的统计研究 测试被执行。

3所示。结果

3.1。失去PARP-1神经元核仁的广告

使用光学显微镜相比,我们在广告和控制和PARP-1水平不相上下。我们没有发现显著差异的核染色PAR在海马区神经元CA1-4,嗅和颞皮层,或菌丝层(数据没有显示)。相比之下,PARP-1免疫组织化学显示阳性染色细胞核的强染色核仁的控制和弱核染色没有染色神经元核仁内的广告(图1比较(a)和(b))。有趣的是,唯一的例外是齿状回,没有观察到广告和控制之间的差异。在控制,锥体神经元的百分比PARP-1积极核仁在CA4 CA1的63.9%和51.1%。相比之下,PARP-1积极核仁锥体神经元的百分比在CA1和广告是28.7% 30.4% CA4(数据1 (c)和1 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图1
核仁的PARP-1免疫反应性在广告范围从没有分散和控制的相比没那么强烈。((a)和(b))代表与diaminobenzidine疣状(DAB)人类海马CA1区锥体神经元。(a)显著核仁的染色PARP-1(箭头)被发现在大多数的锥体神经元控制情况。(b)的核仁的染色PARP-1范围从缺席(箭头)更加分散模式强度较低的标签(箭头)锥体神经元的广告案例。((c)和(d))的CA1和CA4海马锥体神经元的百分比与PARP-1积极核仁显著降低广告情况下相比,控制。(控制, ;广告, ; )。比例尺= 50μm。

我们用共焦显微镜确认结果显示亏损PARP-1核仁的染色在广告。与光学显微镜一致的数据,我们发现,66.1%和62.2%的CA1和CA4海马锥体细胞核仁呈阳性PARP-1在控制,然而,在广告中,核仁的PARP-1染色出现在只有29.3%和32.0%的CA1和CA4锥体细胞,分别(图2)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图2
PARP-1核仁的免疫反应性改变在广告的大脑海马锥体细胞。代表共焦显微镜PARP-1疣状(红色)与DAPI核复染色(蓝色)CA4的海马锥体神经元。控制大脑(a - c)高百分比的锥体细胞核仁有强烈的和,划定PARP-1染色(箭头)。相比之下,在广告的大脑(d-f),强烈的彩色的百分比和well-delineated核仁小于控制和有一个更分散模式标签强度较弱((d)和(f),箭头)。((g)和(h))的百分比CA1 (g)和CA4 (h)海马锥体神经元PARP-1积极核仁染色在广告的情况下而控制。(控制, 和 CA1和CA4的职责。广告, CA1和CA4; )。比例尺= 25μM。
3.2。核仁的标记Fibrillarin并不显著下调海马锥体细胞的核仁

测试是否影响其他核仁的蛋白质在广告中,我们进行了免疫组织化学双PARP-1 fibrillarin,核仁的蛋白质参与pre-rRNA处理。如果失去PARP-1核仁的染色是由于一般损失和结构的细胞核仁,那么我们也可以看到类似fibrillarin损失和其他核仁的蛋白质。然而,失去与保存fibrillarin染色PARP-1广告表明PARP-1损失是有选择性的。控制情况下表现出高强度核仁的染色和更高比例的PARP-1 fibrillarin colocalization(数字3(一)-3(d))相比,广告(数字3(e) -3(h))。有一个重大的损失( )PARP-1核仁的染色在CA1锥体细胞相比,广告控制。相比之下,在CA1 fibrillarin染色不是广告和控制之间明显不同(表2和3)。核仁PARP-1的损失,因此,似乎是一个选择性出发,可能反映了离开的核仁定位错觉的蛋白(表2和3)。

表2
CA1。
表3
CA4。

图3
核仁的蛋白质在海马锥体细胞改变广告。((一)- (h))代表数据显示colocalization ((d)和(h)、黄色)的fibrillarin ((b)和(f),绿色)和PARP-1 ((c)和(g)、红色)在锥体神经元的核仁。控制情况下表现出高强度染色(模拟)相比,广告(情况)(箭头)。在广告与控制相比,有较低的核仁的百分比都是PARP-1(+)和fibrillarin (+) ((f) - (g),箭头)在CA1(见表2)和CA4(见表3锥体细胞和一个更高比例的核仁PARP-1 (−) / fibrillarin (+) ((f)和(g),箭头)在CA1(见表2)和CA4(见表3),这表明核仁的蛋白质以不同的方式影响不同的广告。比例尺= 20μm。

4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,有一个损失的PARP-1海马锥体细胞核仁在广告,表明PARP-1核仁的功能可能会受到损害。最近,我们的团队表明,后期阶段的维护长期势差(L-LTP),长期记忆的模型,需要核仁的完整性和新rRNAs-the后者的表达受PARP-1 [22]。因此,我们假设PARP-1和核仁的完整性需要长期记忆。最近,在我们研究的补充,它是证明慢性赤字在核仁的功能改变突触可塑性与学习和记忆23]。此外,PARP-1也已被证明能够调节核仁的功能的多个领域,包括继承rDNA染色质结构,编辑前体rRNA,生源论核仁的核糖体(16,17]。

PARP-1以前的免疫组化染色,染色的广告,发现增加核PARP-1和PAR在额叶和颞叶组织24]。海马不是检查和核仁的隔间没有评估。PARP-1核仁损失有可能差异程度的敏感性在大脑的不同区域广告,可能是寻找特定的海马体。我们发现,海马的CA1和CA4亚区表现出脆弱性的核仁的PARP-1损失广告,这反映了易受广告神经病理变化和缺血性损伤。有趣的是,慢性赤字在核仁的功能已被证明导致海马神经退化与微分细胞脆弱性(25]。

PARP-1显示被激活二次氧化应激和DNA损伤(24,26- - - - - -28),在轻度至中度压力,被认为是修复机制的一部分,但可能导致细胞死亡通过NAD +消费时应对。我们建议PARP-1可能通过在广告中两个截然不同的机制。我们假设PARP-1从海马锥体细胞的核仁的损失可能是一个早期和持续的寻找广告。这种损失的核仁的PARP-1从海马锥体神经元在突触可塑性可能导致财政赤字,因此,认知障碍。相比之下,在广告,可能PARP-1应对,导致细胞死亡在额叶和颞皮层如图所示爱et al。24]。我们建议两种途径在广告可能导致认知障碍。此外,我们推测PARP-1从海马锥体细胞的损失的广告可能有助于解释一些选择性的脆弱性海马的CA1和CA4区。即有一个损失所需的生理PARP-1激活长期突触可塑性和记忆的巩固9- - - - - -11,14,15),也是一个地区的特定损失修复激活PARP-1与轻度至中度压力有关。

核仁已成为一个重要的结构来研究广告神经病理学的关系。嫩在后期的研究大脑的衰老和老年痴呆症的研究,一个纵向研究的广告,广告发现无症状的情况下,大脑的解剖样本显示病变常见广告尽管受试者有认知正常,表现出明显的肥大CA1神经细胞的核仁(+ 80.2%)相比,MCI或控制29日]。也有肥大细胞的身体和核但核仁的最大的改变。这表明损伤的代偿机制防止认知尽管存在典型的AD病理(29日]。基于这些发现,我们假设它是维护核仁的功能(因此,核糖体rna合成),阻止了这些患者的认知缺陷广告神经病理学。

畸变表观遗传代码的乙酰化、甲基化,和PARylation公分母的神经退行性疾病30.- - - - - -32]。核仁的障碍也可能是一个公分母在一些神经退行性疾病,如亨廷顿氏舞蹈症,帕金森症和阿尔茨海默氏症的疾病(33]。由DNA甲基化是表观遗传沉默的rDNA发现轻度认知障碍(MCI)的共同特征和广告,可能代表一种新疾病的标志(34]。rDNA沉默发生在核仁,扰乱核仁的功能,比如全球染色质监管(35)和生物转化的核糖体(17]。这种基因沉默与先前的报道是一致的核糖体减少下顶叶的MCI患者和广告(36]。损害核糖体rna的表达(核糖体的组成部分)或任何步骤的核糖体生物起源可以产生核仁的压力,导致基因表达的变化和核糖体和蛋白质合成的减少导致细胞功能障碍。

到目前为止,导致增加的因素rDNA甲基化在MCI和广告是未知的。PARP-1以来显示调节基因组甲基化模式通过抑制DNA methyl-transferase的活动(37),我们建议PARP-1位移核仁的广告导致rDNA甲基化。核糖体rna表达的差别是对这些和核糖体生物起源的人物4(一)和4 (b))。没有新的核糖体的合成新的蛋白质受损和形成新记忆中断。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
模型。核糖体生物起源在阿尔茨海默氏症。(一)正常的神经元。PARP-1活动(PAR)防止rDNA甲基化。票面价值=保利(ADPribosyl)。(b)广告神经元。没有PARP-1核仁允许DNA甲基转移酶(Dnmt1)混入甲醇rDNA推动者沉默核糖体rna转录导致核仁的破坏。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢胡安·马科斯提问和金姆·d·艾伦阅读本文批判和阿曼达·西蒙,奥尔加·Krasnozhen瞿和歌曲的技术支持。他们感激太阳健康研究所大脑和身体的捐赠项目的阳光城市,亚利桑那州,人类的大脑组织。大脑和身体的捐赠项目支持国家神经疾病和中风研究所(U24 NS072026国家大脑和组织资源对帕金森病及相关疾病),国家老龄化研究所(e AG19610亚利桑那州阿尔茨海默氏症核心中心),亚利桑那州卫生服务(合同211002年亚利桑那州阿尔茨海默氏症研究中心),亚利桑那州的生物医学研究委员会(合约4001、0011、05 - 901,和1001年亚利桑那州帕金森病协会),和迈克尔·j·福克斯帕金森氏症研究基金会。