文摘

整个螺旋神经节的机关文化地区是一个足智多谋的模型系统便于操作和分析活蛇管神经节神经元(胡志明市)。三维(3 d)文化已被证明有许多生物医学应用,但3 d的影响文化在维护胡志明市结构和功能在外植体培养仍被知晓。在这项研究中,我们使用了人工基底膜封装从新生儿分离小鼠螺旋神经节区域。首先,我们优化3 d文化系统的基底膜基质浓度,发现三维培养系统对细胞凋亡保护胡志明市,螺旋神经节的结构区域,保存和促进发芽和神经突的胡志明市的产物。接下来,我们找到了3 d文化系统发展促进生长锥更高的平均数量和更长的平均长度的丝状伪足和一个更大的生长锥区。三维培养系统胡志明市的突触密度也显著升高。最后,我们发现3 d文化系统结合神经营养因子积累效应在促进神经突的结果与3 d文化或NFs只治疗组。在一起,我们认为3 d文化系统保存在外植体培养胡志明市的结构和功能。

1。介绍

在哺乳动物cochleae,螺旋神经节神经元(胡志明市)专业双极神经元传输从耳朵听觉信息到大脑。胡志明市源自cochleovestibular神经节(1,2),然后成熟的专业化毛细胞(高碳钢)prosensory域内的耳蜗。最后,胡志明市扩展外围轴突,夫妇在带状突触高碳钢(3),通过该胡志明市传输听觉信息从高碳钢到中枢神经系统。因此,胡志明市的生存是必不可少的保护听力,和胡志明市加重损伤听力损失4]。然而,刺激和引导机制的神经突从胡志明市到目标产物仍不清楚,需要进一步的探索。

的两种传统方法分离细胞培养和传统器官型培养常用的培养胡志明市的先前的研究。分离细胞培养被广泛用于研究的生存5,6和轴突再生7胡志明市的]。虽然分离螺旋神经节细胞培养包含所有螺旋神经节细胞类型的地区,也可能包含的可溶性因子提供的神经胶质细胞(GCs)胡志明市的支持,信息粘连是中断,胡志明市之间生理信息交互GCs被摧毁。胡志明市被安排在一个三维(3 d)耳蜗的结构在活的有机体内;因此,有必要维护这种环境下如果想观察胡志明市行为通常在生物过程以及它们如何应对压力3]。传统的器官型培养包括坚持新鲜解剖螺旋神经节器官在盘表面,和这种类型的文化也被称为二维(2 d)文化8,9]。传统2 d器官型培养被用来探索的影响小分子的发展胡志明市(神经突9)和基因表达的变化,以应对损伤和缺氧10)等等。然而,因为它是无法提供所需的物理脚手架胡志明市的产物,从2 d条件下螺旋神经节的神经突很少和很短的11,12),这使得二维文化不到理想文化系统研究胡志明市的结构和功能。因此,3 d文化系统,它可以封装胡志明市模拟正常的3 d环境在活的有机体内,被认为是理想的模型来保护脆弱的结构和功能的胡志明市外植体在文化。

在各种三维培养系统,人工基底膜,这是一个重组basement-membrane-like矩阵(BM),已成功用于3 d在内耳文化模型的研究。例如,人工培养的优越的前庭艾丁等人在3 d-matrigel神经节在体外探讨内耳神经再生(13,斯宾塞等人用鸡耳蜗基底膜基质为支架开发HC文化再生模型(14]。这些研究证明了生物活性和组织相容性内耳基底膜基质的组织。然而,3 d-matrigel文化的影响保持胡志明市的结构和功能在外植体培养仍被知晓。

在这项研究中,我们成功地建立了三维文化系统与人工基底膜封装从新生儿分离小鼠螺旋神经节区域。这个系统能够保护胡志明市对抗细胞凋亡,促进生长锥的生长,促进神经突发芽结果,提升胡志明市的突触密度。当结合神经营养因子,3 d系统也有累积效应显著促进神经突的的结果。总之,3 d-matrigel文化系统保存胡志明市短期文化的结构和功能,这可能是适用的在体外内耳的生理和病理生理学的研究。

2。材料和方法

2.1。动物和胡志明市解剖

所有的实验都获得山东大学动物保健委员会批准,中国实验动物保健和使用的研究目的。产后抱(P3) C57BL / 6小鼠从山东大学动物中心购买(济南,中国)。

解剖过程进行描述与轻微的修改(先前的研究9,15]。P3 C57BL / 6小鼠斩首,头骨了矢用一双小手术剪刀。立即颞骨的双方被切断并放在无菌汉克的平衡盐溶液(美国Hyclone)在平坦的冰包。耳蜗胶囊被罚款钳暴露解剖显微镜下的膜迷路。纹vacularis和螺旋器被移除,中间被选为保持采样组之间的一致性。丢弃的耳蜗轴后,残余胡志明市散装切成四等分大约有200μ米直径。

2.2。Organotypic细胞培养

有两个不同的媒体研究中使用;主要的生长培养基(PGM)由10%胎牛血清(美国Gibco)和50μ在DMEM / F12 g / mL氨苄青霉素。完整的媒介(FM)补充了N2(表达载体1:100年,美国),B27(1: 50,英杰公司)、表皮生长因子(EGF), 20 ng / mL,σ,美国),碱性纤维母细胞生长因子(bFGF, 10 ng / mL,σ),胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1、50 ng / mL,σ),硫酸乙酰肝素(50 ng / mL,σ)和氨苄青霉素(50μg / mL,σ)在DMEM / F12 (Gibco),应该在两周内使用。

孤立的胡志明市外植体附着到10毫米玻璃盖玻片预镀与CellTak(美国BD生物科学)和培养在4道菜的PGM(他一一Bio-One、德国)一夜之间没有任何治疗。然后,第二天,媒体变成了调频结合不同的治疗方法如下。

2 d文化,外植体在调频没有任何添加剂,统一控制的其他治疗组。

对3 d文化,基底膜基质的浓度添加到调频包括2%,10%,20%,50%。相应地,2μL, 10μL, 20μL,或50μ98年L冰冷的基底膜基质混合在一起了μL, 90μL, 80μL,或50μL调频和在组织外植体直接下降。凝胶是启动立即凝固在室温和十分钟后完成。然后,培养皿被转移到孵化器。

神经营养因子- (NF)治疗组、10 ng / mL BDNF(美国研发系统)和10 ng / mL NT3(美国研发系统)中加入2 d文化或20%人工基底膜3 d文化系统中,它被认为是2 d-nf或3 d-nf组,分别。

所有处理外植体被培养48 h或7天37°C, 5%的公司₂,95%的湿度。

2.3。疣状

器官型培养后,胡志明市外植体培养在冰冷的PBS 4°C与PBS 30分钟,洗两次。为了保持胡志明市的建筑结构,涂层基底膜基质是仔细删除除了培养组织包围,紧随其后的是有4%多聚甲醛固定透化作用和PBS tritonx - 100 1%(σ),样本沉浸在屏蔽解决方案(驴血清tritonx - 100 0.1%, 8%, 1%的牛血清白蛋白,叠氮化钠和0.02% PBS)在室温下1 h。然后,样本不同孵化主要抗体:β微管蛋白(Neuromics 1: 1000年,美国),神经丝(微孔1:1000年,美国),和synaptophysin(1: 1000年,微孔),稀释在屏蔽解决方案,分别在4°C。第二天,组织与FITC-conjugated孵化或TRITC-conjugated(1: 1000年,英杰公司)二级抗体与DAPI(1: 800年,Sigma-Aldrich)或phalloidin(1: 1000年,Sigma-Aldrich) 0.1% tritonx - 100和1% BSA在PBS室温1 h。然后,盖玻片是安装和激光扫描共聚焦显微镜下观察(德国徕卡)。

2.4。末端转移酶的重击尼克结束标记(TUNEL)检测

细胞凋亡研究DNA碎片TUNEL染色工具包(点击+ TUNEL检测原位细胞凋亡检测,英杰公司)根据制造商的指示。细胞核与DAPI染色,外植体进行评估使用共焦显微镜(德国徕卡)。

2.5。RNA提取和实时聚合酶链反应(rt - pcr)

后在3 d-matrigel培养48 h,胡志明市外植体首先孵化在冰冷的PBS 30分钟4°C和涂层基底膜基质变成液态形式;然后,外植体与冰冷的PBS洗了三次去除人工基底膜明显。然后,收集20个外植体为试剂盒(生活技术,美国)获得制造商的指令后的总RNA。RNA浓度Bio-Rad分光光度计测量。1的互补脱氧核糖核酸合成μ使用恢复援助g总RNA逆转录合成第一链cDNA工具包(热科学、美国)后,制造商的协议。定量实时聚合酶链反应(rt - PCR)进行使用SYBR预混料Taq交货(豆类、日本)。GAPDH是用作看家基因。每个25μ12.5 L PCR反应混合物中μL 2 x SYBR绿色PCR反应混合液,0.5μL正向引物(10μ0.5米),μL反向引物(10μM), 2μL模板,和9.5μL无菌蒸馏水。每组包含三个样品和PCR是一式三份。PCR条件如下:95°C 10分钟紧随其后40 95°C的周期15秒,60°C 15和72°C 30年代离解紧随其后在95°C 15年代,30年代60°C, 95°C 15 s。所有的数据进行了分析使用艾本德Realplex 2。表中列出的基因的PCR引物1。

2.6。图像分析

胡志明市的共焦图像被使用徕卡SPE共焦荧光显微镜(莱卡)。Z-stack图片为0.2μ米间隔跨度样本。数量、长度、高度和区域的神经突产物分别进行评估。数据图所示的模式2(一个)- - - - - -2 (d)神经突,胡志明市的数量直接从每个外植体数,延长神经突的长度测量的基本神经突外植体边缘的最远端,和之间的距离染色的上和下飞机被认为是神经突神经突的平均高度在胡志明市外植体。至于面积测量,每个外植体的神经突远远的都是连接到形成一个封闭的形状不规则,其面积是由图像J软件计算的。

2.7。统计分析

对于每个处理条件,至少有三个独立的实验。数据提出了均值±SEM(平均数标准误差),和对比组被学生的测试以及。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。建立三维培养系统和优化人工基底膜的浓度

培养后在体外7天,外植体与胡志明市标记应用β微管蛋白和共焦显微镜下观察到。如图1 (c)二维培养组,只有几个神经突扩展延伸从外植体,和有限的长度。3 d文化与基底膜基质促进神经突胡志明市的显著的增长(图1 (c))。我们比较四个参数的神经突产物(数量、长度、高度和面积)来分析三维文化统计的影响,如图2 (e)- - - - - -2 (h),2%的基底膜基质没有增加神经突的生长与2 d文化对照组相比,除了轻微的神经突数量增加(数据未显示),而10%的基底膜基质文化显著促进了数字,高度,和神经突面积的2.57倍,1.17倍和1.25倍(,,),在对照组。值得注意的是,所有四个参数人工基底膜显著增加20%的胡志明市神经突,产物平均数量,长度,高度,和神经突面积提高到9.31倍、1.50倍、1.60倍和2.00倍的控制(,,,、职责),而50%的人工基底膜数量增加,高度,面积8.87倍,1.58倍和1.50倍(,,神经突的长度),但与对照组相比无显著差异。因此,这些数据表明,20%的基底膜基质培养的外植体胡志明市、最能受益,因他们增长更多和神经突长,扩展更大的高度和面积,以及被选为3 d文化在接下来的实验。

3.2。3 d文化保护胡志明市外植体对细胞凋亡

利用TUNEL分析来检测细胞凋亡,我们观察到大量的凋亡胡志明市2 d组后培养48 h在体外,发现三维培养系统有显著的保护作用对细胞凋亡在胡志明市外植体。正如在图3凋亡胡志明市显示异常或不规则的形态,如神经纤维的断裂,收缩的神经元,核凝结。TUNEL分析证实,2 d文化引起凋亡的死亡在胡志明市有10.17±2.87 TUNEL -β微管蛋白双阳性神经元的外植体。然而,很少TUNEL -β微管蛋白双阳性细胞被发现在基底膜基质为20%(图3 d的文化体系3 (c)),这表明3 d条件可能有助于减少细胞凋亡和存活时间的胡志明市外植体。

此外,rt - pcr数据显示,胡志明市外植体培养3 d-matrigel系统Casp8 proapoptotic基因的表达有显著降低,Casp9, Casp3, Apaf1,伯灵顿相比2 d组(,图3 (d)),而他们已经明显高于mRNA的表达凋亡基因bcl - 2 3 d组(,图3 (d))。这些数据表明,3 d文化与基底膜基质可以调节细胞凋亡相关基因的表达,保护了胡志明市外植体从细胞凋亡。

3.3。3 d文化保留了胡志明市的精致结构外植体

我们发现一些异常生长的神经突胡志明市的在2 d模式培养的组织培养后7天在体外,如逆转,束状、卷曲和肿胀,缺席的三维培养组。图4 (c)显示神经突的扭转性能的,而不是从外植体的边缘延伸和发展中径向结构的3 d组,一些神经突生长回到原来的外植体和无序模型。有时候,改变径向神经突生长方向从外植体的边缘和成群成神经束(图4 (b)),一些弯曲的过程中(图4 (d)),这被认为是束状卷曲,分别。此外,一位杰出的神经突肿胀终止时可以看到一些在2 d文化集团(图4 (e))。然而,这些模式被发现在三维培养组。这些结果表明,三维文化保存胡志明市的微妙的神经突结构扩展的外植体。

3.4。3 d文化促进增长的生长锥

接下来我们研究了3 d文化的影响在胡志明市生长锥通过比较数量,长度丝状伪足,生长锥的面积在培养48 h在体外。我们玷污了胡志明市phalloidin和培养β微管蛋白,发现丝状伪足走出生长锥的平均数量是更大的在三维培养文化系统相比2 d组(,图5 (c))。同样,丝状伪足的平均长度的技巧个人丝状伪足的边缘生长锥长(,图5 (d))和神经突的生长锥区较大时培养的3 d条件下比在2 d系统(,图5 (e))。总之,胡志明市的3 d文化条件促进了增长生长锥和丝状伪足的发展相比2 d组。

3.5。3 d文化增强神经突的萌芽在胡志明市外植体

神经突的萌芽在胡志明市外植体培养后测定了7天在体外,图6 (b)说明有更多的树突扩展从胡志明市的细胞体外植体在三维培养系统比2 d组(图6 (b))。统计分析表明,主树突的数量,总分支长度、分支提示的数量,和分支点的数量都是在3 d组相比显著升高2 d文化集团(数字6 (c)- - - - - -6 (f),,,,、职责),这表明3 d文化促进神经突的萌芽和结果胡志明市外植体。

3.6。3 d文化提升突触密度在胡志明市外植体

进一步研究3 d的影响文化的功能organotypic胡志明市,我们也发现了synaptophysin表达分析神经突突触密度。Synaptophysin是特定于突触囊泡膜蛋白,直接与相关的神经递质(16,17]。因此,它也是一个特定presynapse标记。代表图像文化20%后人工基底膜系统如图7天7。3 d系统显著提高突触密度在文化相比,2 d控件(数字7 (b)和7 (c))。统计分析证明synaptophysin puncta密度显著增加在3 d系统相比,2 d组(,图7 (d)),表明3 d系统促进突触的成熟和突触可塑性在胡志明市外植体培养。

3.7。基底膜基质的3 d系统的协同影响脑源性神经营养因子和神经突上NT3结果

据报道,在听觉系统中,不同的因素扮演了一个重要的角色在胡志明市的发展和形态,包括脑源性神经营养因子(BDNF)和neurotrophin-3 (NT3)。基于上述发现,3 d-matrigel文化系统可以促进胡志明市的结果,我们进一步探讨了3 d的文化系统与NFs胡志明市外植体在7天的文化。如图8、治疗与BDNF NT3 3 d系统显著增加的数量和面积相比,神经突NFs-only和3 d组(,,,、职责),但不是胡志明市的长度。此外,数量、高度和面积显著增强的神经突3 d-nf组相比,2 d-nf集团(,,、职责)。总之,这些结果表明,三维培养系统结合NFs神经突积累效应推动的结果,表明BDNF和NT3的协同影响神经突的胡志明市外植体,特别是3 d-matrigel文化条件下。

4所示。讨论

螺旋器的器官文化一直作为流行的模型来研究耳蜗细胞类型的生物学和生理学和病理过程的影响。具体来说,2 d文化已经被用于检查在胡志明市(生长因子的影响18- - - - - -21]。虽然这个方法很简单,提供了一个可行的文化胡志明市外植体,它并不足以保护自然耳蜗的复杂的三维结构。在这项研究中,我们使用了基底膜基质构建3 d文化系统总结胡志明市组织批量体外。据我们所知,这是第一次报告的3 d文化系统提供物质支持鼠胡志明市外植体和维护它的生理结构和功能。

基底膜基质的商用模拟生理BM,已用于制造文化不同的3 d模型(22- - - - - -24]。在目前的研究中,3 d-matrigel文化系统促进了神经突的胡志明市外植体与2 d组相比显著;不仅是平面特征,包括神经突胡志明市的长度和数量,增加,而且空间属性,如神经突的高度和区域产物,放大明显,后者被认为是更重要的因素维持螺旋神经节区域的空间结构。与此同时,3 d文化保存的精致结构胡志明市外植体没有异常生长模式三维培养的神经突胡志明市的观察组。因此,这些结果表明,文化系统由人工基底膜可用于模拟的三维组织在生理条件下胡志明市。此外,我们的结果也表明了,影响神经突的胡志明市外植体是依赖于基底膜基质浓度,和20%的基底膜基质浓度被认为是最有效的,因为它促进了所有的四个参数测试实验。一个可能的原因是人工基底膜的物理性质与它的浓度:在我们的研究中,20%的基底膜基质成为胶状的物质在37°C,而2%的基底膜基质仍然是液体,不能提供一个3 d的条件,或50%人工基底膜太厚,可能会限制了紧张和神经突的胡志明市的蔓延。

以前的研究报道,胡志明市在二维培养的外植体在几天内不可避免地退化(25),和3 d系统被认为是潜在的改善文化条件和保存的方法培养的外植体的结构和功能。在我们的研究中,我们还观察到大量的凋亡胡志明市2 d文化集团就是明证TUNEL分析和rt - pcr结果(图3),而在3 d文化系统很少观察凋亡胡志明市,显著降低proapoptotic基因的表达和更高的抗凋亡基因的表达被发现(图3 (c)),这表明3 d条件下显著降低细胞凋亡和增强的生存胡志明市外植体。因此这些发现使我们能够推测,3 d环境不仅提供支架支持胡志明市外植体也进行了防护行动建立一个三维结构提供更大的表面积和更好的营养传输。基底膜基质的3 d文化系统,人工基底膜的主要成分是层粘连蛋白,但文化媒体也含有EGF, igf - 1、bFGF和其他生长因子。自从3 d结构体系提供了更大的表面和更好的营养传输,培养基中的生长因子可以更好地采取内部培养的器官。据报道,FGF参与胡志明市发展和支持他们的分化后产后生还(26,27];FGF / FGF受体信号影响C-Jun-N-terminal激酶或caspase-dependent通路改变在耳蜗细胞凋亡28]。表皮生长因子受体表达被发现在新生儿和成年小鼠螺旋神经节(29日,30.],IGF-1-deficient耳蜗神经元显示增加caspase-3-mediated凋亡[31日]。因此,更好的吸收这些生长因子3 d-matrigel系统可能调节上面的信号通路在胡志明市和proapoptotic的差别可能是负责对这些因素和提高成活率,但这在未来仍然需要进一步探讨。

生长锥是动态的,actin-supported发展中寻求其突触神经突的扩张目标。在生长锥丝状伪足的主要结构。在目前的研究中,培养后在3 d-matrigel文化系统中,丝状伪足的数量、长度、和区域生长锥相比显著增强的2 d文化集团(图5)。此外,主树突的数量,总分支长度、分支提示的数量,和分支点的数量也显著升高3 d-matrigel文化系统。总之,这些结果表明,三维文化条件促进增长的生长锥,丝状伪足的发展,和神经突发芽结果相比,2 d系统。

在哺乳动物中,检测到声音信息mechanosensitive高碳钢和传播通过带状突触胡志明市。通过检查体突触前和突触后蛋白质含量在胡志明市新见解听觉初级传入纤维的功能性组织可以提供。在我们的研究中,使用synaptophysin presynapse标记,和3 d的表达增强文化集团相比2 d组,表明突触密度显著改善三维培养条件下,这进一步表明,3 d-matrigel文化系统有可能促进突触的成熟和突触可塑性的胡志明市。

在听觉系统中,BDNF和NT3的NFs,具有不同的功能的开发和维护发展中内耳(胡志明市32]。在我们的研究中,治疗与BDNF和NT3胡志明市外植体的数量和面积增加探明在2 d和3 d系统相比分别NF-only和3 d组。数量,更重要的是,高度,和神经突面积显著增强3 d-nf组与2 d-nf组相比,表明3 d文化系统积累的影响在促进神经突的结果结合NFs。然而,神经突的长度是不受政府影响BDNF和NT3的2 d和3 d系统,这是与以往的研究一致二维培养系统(8]。

综上所述,3 d文化系统与人工基底膜表现出良好的生物相容性和促进了生存,结构,产物,胡志明市的函数在整个文化时期相比,二维文化。本研究强调了潜在的基底膜基质应用于3 d的文化体系在体外内耳的生理和病理生理学的研究。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Gaoying太阳和刘了雯雯的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持由中国国家973计划基础研究,2014 cb541703;中国主要国家Basci研究发展计划(973计划),2015 cb965000;中国的国家自然科学基金,81570918,81200744,81470692,81500790,31500852,81570921,31501194;山东省自然科学基金、中国ZR2014HQ076;山东省级重点工程项目的研究和开发,2015 gsf118153;从江苏省自然科学基金BK20150022、BK20140620 BK20150598;中央大学的基础研究基金,2242014 r30022和2242014。