文摘

尼曼C病是一种常染色体隐性存储疾病,特点是异常封存unesterified胆固醇endolysosomal末隔间内的细胞和神经节甘脂和其他鞘脂类的积累。进行性神经恶化和起义的共济失调等症状,癫痫,认知能力下降,直到严重痴呆疾病的特殊的特性。在这里,我们研究了海马的突触可塑性现象和评估erk激活BALB / c NPC1−−老鼠,井描述疾病的动物模型。我们的研究结果表明一个障碍的感应和维护长期突触NPC1−−/鼠标切片,与缺乏erk的磷酸化。然后我们调查Miglustat的影响,最近批准的药物治疗NPCD。我们发现在活的有机体内Miglustat政府NPC1−−/老鼠能够拯救突触可塑性赤字,恢复erk激活和抵消兴奋过度。总体而言,这些数据表明Miglustat可能有效治疗神经赤字与NPCD有关,如癫痫、痴呆。

1。介绍

C型尼曼氏病病(NPCD)是一个panethnic,致命的,常染色体隐性、脑脊髓交感神经系统脂质储存障碍幼儿和青少年发病病例的95%和成人发病在5%的情况下(1]。全国人大的基因,NPC1在大约95%的疾病和突变NPC2突变在剩下的5%,编码的蛋白质参与细胞内脂质运输。突变NPC1和NPC2引起严重的异常功能的交通系统存储过剩的脂质胆固醇,鞘糖脂,endosomal末和鞘氨醇与溶酶体胞内区域,与周边和中央有关器官功能障碍(2]。

疾病的特征是进行性神经恶化和起义的共济失调等症状,癫痫,认知能力下降,直到严重痴呆导致过早死亡(2,3]。虽然遗传缺陷导致NPCD是众所周知的,很少的信息可以在神经赤字和神经病理学的原因。目前的治疗方法NPCD是有限的。N-butyldeoxynojirimycin (Miglustat;Zavesca Actelion股价制药),用于治疗的药物最初几个dyslipidosis包括GM1 gangliosidosis,高雪氏症I型,和家族黑蒙性白痴病,2009年被批准用于治疗进行性神经系统表现在成人和儿科患者受到NPCD [4- - - - - -7]。药物的有效成分是一个iminosugar能够专门抑制酶葡糖神经酰胺合成酶(GCS)神经酰胺产生的能量转换成鞘糖脂葡糖神经酰胺(即。,第一个产品在复杂鞘糖脂的合成,包括神经节甘脂)。虽然不可否认的优势关于一些神经症状已经注意到在诊所,为什么细胞呈现交通系统偏差的胆固醇和鞘脂类的所有类都应该受益于块糖脂合成是不清楚8]。

等离子体膜胆固醇含量的变化和鞘糖脂/胆固醇比例尤为重要的影响脂质筏、平台,许多转换信号生成过程,多种细胞功能的基础和重要的监管机构谷氨酸受体的活动(9,10]。我们在之前的论文证明胆固醇减少海马神经元NMDA receptors-mediated受损展示出一个突触可塑性(11]。因此,正确的cholesterol-sphingolipids动态内容的改变神经元质膜在神经功能障碍可能有关键作用与人大疾病有关,如记忆障碍和痴呆。

本研究的目的是评估突触可塑性现象,是否参与学习和记忆的过程,是影响NPC1−−老鼠、完善的全国人大小鼠模型的疾病,如果在活的有机体内Miglustat治疗能够抵消突触赤字。这一目标,我们采用多学科的方法在野生型(WT)和NPC1−−老鼠,包括在(我)在急性海马切片和电生理记录(2)细胞内途径的分子分析。

2。方法

2.1。动物

我们首先建立了一个殖民地NPC1−−/老鼠代表一个著名的实验模型NPCD因为他们显示大多数疾病的临床特征包括认知障碍。育种对BALB / cNctr-Npc1m1N / J(股票编号:003092)老鼠从杰克逊实验室购买(美国马巴尔港)。该菌株包含NPC1的自发突变位点(12]。据意大利动物培育和维护动物保健委员会的规则。杂合的(男性×女性)小鼠饲养动物和后代的基因型测定基因分型的杰克逊实验室通过聚合酶链反应(PCR)协议数据库(12]。简单地说,使用以下引物PCR进行:WT意义:CTG标签CTC ATC TGC猫CG, WT反义:TCT CAC AGC CAC亚美大陆煤层气有限公司总部CC;突变的意义:GGT GCT GGA CAG CCA AGT,突变反义:TGA GCC CAA GCA TAA CTT CC。预期的产品如下:突变= 475个基点,WT = 173个基点,杂合子= 173个基点和475个基点。与WT担任控制。

2.2。Miglustat管理

实验已经进行研究的影响在活的有机体内Miglustat (N-butyldeoxynojirimycinσ)治疗NPC1−−老鼠突触活动。除了WT老鼠()和NPC1−−未经处理的小鼠(),我们分布在四组治疗动物:WT小鼠口服治疗(填喂法)与盐溶液()或Miglustat(0.2毫克/公斤)()和NPC1−−/小鼠口服治疗(填喂法)与盐溶液()或Miglustat(0.2毫克/公斤)()。

NPC1−−/老鼠显示明确的症状包括共济失调和意向性震颤百分比较天的年龄。起义前的症状的病理特征(生活)的38天,NPC1−−和WT小鼠治疗20天。在这个时间窗口,没有胃肠的副作用与immino糖政府明显和他们能够养活,不显示起义的神经系统症状表现正常功能运动系统(见视频在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3830424)。因为我们旨在评估Miglustat对突触可塑性的影响赤字而不是它的一般临床症状和寿命的影响,动物被牺牲在治疗结束时,58-60天的生活。

2.3。在小鼠海马细胞外记录

BALB / cNctr-npc1N老鼠,遗传型的特点同窝出生的(5 - 7周),根据建立的程序使用动物保健欧洲共同体的欧盟委员会1986年11月24日理事会指令(86/609 / EEC)。都是努力减少实验用动物的数量,他们的痛苦。根据与安氟醚麻醉,他们被斩首,大脑很快被删除并放置在寒冷、含氧人工脑脊髓液(ACSF)包含以下(毫米):124年氯化钠,氯化钾2,KH₂阿宝₄1.25,MgSO₄2,CaCl₂2,NaHCO₃26日和葡萄糖10 [13]。海马体是快速切割和片(450μ米厚)是减少横向McIlwain组织直升机(很多实验室工程有限公司Gomshall,英国)转移到一个组织室,在那里,他们躺在一个接口之间的含氧ACSF和湿润气体(95%啊₂/ 5%股份有限公司₂尺码)°C (pH = 7.4),经常在过冷1.2毫升/分钟的流量。细胞外记录的人口峰值(PSs)在地层pyramidale玻璃微电极的CA1领域充满了2 M氯化钠(5 - 10 MΩ阻力)。顺行的刺激(10 - 500 mA, 20 - 90 ms, 0.1赫兹)是通过一个铂电极放置在地层radiatum谢弗抵押/连合CA1通路。测试刺激广场50毫秒脉冲强度调整引起PS的2 - 3 mV在0.03赫兹。PS幅值计算每分钟执行的六个录音的平均每10 s。利用基础突触传递,PS被记录为1小时。记录稳定信号(20 - 30分钟)后,强直刺激(100 Hz, 1 s)是诱导长期势差现象(LTP)在同一刺激强度用于基线反应。Posttetanic势差(PTP)和LTP被计算PS幅值测量之前和之后的破伤风。

场势喂养2 Axoclamp放大器,通过数字/模拟的系统(Digidata 1440、轴突仪器)和分析软件pCLAMP10(轴突,福斯特城、钙、美国)。

振幅的变化PS tetanization后基底PS幅值表示为百分数(,在那里是意味着PS振幅tetanization之前)。总体影响PTP和LTP被计算的平均测量,对于每一个切片,PS的振幅记录前5分钟期间破伤风(BST),在第一分钟破伤风(PTP)后,在60分钟期间,破伤风后(LTP)。

2.4。免疫印迹分析

海马切片用于电生理实验快速切割分离CA1区然后在冰冷的均质里帕缓冲区包含1 x完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂(σ)。蛋白质浓度由微BCA评估分析工具包(皮尔斯)。蛋白质(30μg)受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)聚丙烯酰胺凝胶和electrophoretically转移到硝化纤维膜如前所述14]。加载的蛋白质样品验证了Coomassie和朱红色染色。主要抗体针对phospho-p44 /页MAPK (Thr202 / Tyr204),总p44 /页MAPK得到从细胞信号技术。膜第一次加工可视化蛋白质的磷酸化形式,dehybridized(恢复免疫印迹剥离缓冲区,皮尔斯,罗克福德,美国),然后用抗体针对总蛋白质reprobed正常化。定量是由光密度分析的电影。

2.5。统计数据

电生理实验,数据表示为测量±SEM和意思代表的片数进行了研究。与学生的数据进行了比较以及方差分析测试和被认为是明显不同的。5.0 Excel软件被用于生成图表。erk的活化研究数据,表示为±SEM,使用学生的进行统计分析以及。

3所示。结果

3.1。Miglustat对基底突触传递的影响

在先前的纸,我们表明,基底突触传递(BST)记录在海马的CA1区片从NPC1−−/老鼠是增强对片从WT老鼠15]。在目前的研究中,我们分析是否在活的有机体内Miglustat政府能够减少突触传递NPC1−−老鼠。

在NPC1−−和WT片从未经处理的动物,PS %值在20分钟的录音时间BST 127.1±6和104.1±6.1,而在60分钟144.7±10.8和111±9.3,分别为(从每组8种不同的动物,< 0.05,图1)。片从WT动物生理盐水处理(从5个不同的动物)和Miglustat (从5个不同的老鼠),BST值没有显著改变比未经处理的小鼠(105.1±5.9,103.2±6.3,分别地。在20分钟,而104±6.1;109.1±7.1,109.7±8.7和111±9.3 60分钟,图1),因此不包括任何事件由于填喂法技术或Miglustat非特定的效果。事实上,在片从NPC1−−老鼠用生理盐水治疗(从5个不同的动物),PS值没有改变对未经处理的(129.4±7.2和127.1±6 20分钟;147.2±11.2和144±10.8 60分钟)。经过20天的口腔Miglustat管理、PS记录在海马的CA1区片从NPC1−−老鼠(从11个不同的动物)保持稳定的记录时间相比NPC1−−/生理盐水治疗小鼠:价值20分钟95.2±5.6和129.4±7.2 (< 0.01)和价值60分钟107.4±7.3和147.2±11.2 (< 0.01),表明药物的抵消效应在超兴奋性观察NPC1−−老鼠(图1)。

(一)

(b)

(一)
(b)

图1

片基底在CA1海马突触传递的子领域获得WT和NPC1−−老鼠。(一)录音了和:曲线(A)、(B)和(C)是指WT治疗,WT盐水治疗,和WT Miglustat老鼠片治疗,而曲线(D), (E)和(F)代表的PS NPC1−−未经处理的,NPC1−−盐水、和NPC1−−/ Miglustat治疗老鼠。(b) % PS幅值作为时间的函数所示WT未经处理(横向模式酒吧,),在WT盐水治疗(黑条),在WT Miglustat治疗(对角线模式酒吧,),在NPC1−−治疗(垂直模式酒吧,),在NPC1−−/生理盐水治疗(灰色酒吧,),并在NPC1−−/ Miglustat治疗(白色的酒吧,)鼠标片1分钟,10、20和60。PS振幅对应于平均6录音/分钟。酒吧在情节意味着±SEM值获得不同的片。注意在PS振幅显著统计学差异小时记录:在20分钟记录127.1±6和104.1±6.1,分别在NPC1−−和WT片未经处理的小鼠()和95.2±5.6和129.4±7.2,分别在NPC1−−片Miglustat和NPC1−−片/生理盐水治疗小鼠();60分钟记录144.7±10和111±9 NPC1−−和WT片未经处理的小鼠()和107.3±7.3和147.2±11 NPC1−−/片,分别Miglustat和盐水治疗小鼠()。

3.2。损伤CA1海马突触可塑性的地区NPC1−−老鼠被Miglustat救起处理

首先我们对突触可塑性在海马的CA1 NPC1−−和WT老鼠因为失忆是一种特殊的人大疾病的症状。为此,我们诱导长期势差现象(LTP)在谢弗抵押/连合fiber-CA1突触在海马切片使用一列火车的高频刺激(HFS) (1 s 100赫兹)。这刺激诱导持续增强的PS WT老鼠(图2(一个)):20元的值分别为323.8±29.8 LTP记录的值为10,20和60分钟后破伤风分别为250.2±29.9,222±31.9,195.6±29.8,分别为((图来自12个不同的动物)2 (c))。同样的刺激NPC1−−/鼠标片诱导显著抑制PTP和LTP的表达一个完整的封锁LTP维护阶段。PTP和LTP值10、20和60分钟强直刺激后分别为221.8±42.5,137.3±11日分别为103.3±20.9,117.8±14日(,< 0.05和< 0.01 WT与治疗;有关详细信息,请参阅传说)。的减少约20元。而LTP减量32%约为45%,50%,和47%的10,20,分别和60分钟的录音。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图2

在CA1海马突触可塑性领域WT和NPC1−−老鼠。(一)% PS幅值作为时间的函数显示强直刺激后应用于时间(箭头所指)。PS幅值,测量每一分钟,对应于平均6录音/分钟。分情节意味着±SEM值获得不同的片。注意障碍的感应和LTP的表达NPC1−−未经处理的小鼠(白色rombs,)相比WT(黑圈,)未经处理的小鼠。(b)记录了从不同片WT (A)和NPC1−−未经处理的(b)、WT盐水(C)和NPC1−−/生理盐水治疗(D)和WT Miglustat (E)和NPC1−−/ Miglustat (F)治疗的老鼠。每组的第一条曲线是指BST并记录应用程序前的强直刺激,而其他曲线是指人口峰值* 1,10、20和60分钟后HFS中。(c) % PS后振幅HFS中作为时间的函数所示WT未经处理(横向模式酒吧,),在WT盐水治疗(黑条),在WT Miglustat治疗(对角线模式酒吧,),在NPC1−−治疗(垂直模式酒吧,),在NPC1−−/生理盐水治疗(灰色酒吧,),并在NPC1−−/ Miglustat治疗(白色的酒吧,1)小鼠切片分钟,10、20和60。酒吧在情节意味着±SEM值获得不同的片。注意显著统计学差异在PS幅值在小时记录NPC1−−/治疗与WT未经处理的小鼠切片:PTP和LTP值10,20,和强直刺激后60分钟,分别为221.8±42.5,137.3±11日117.8±14日和103.3±20.9和323.8±29.8,250.2±29.9,222±31.9,195.6±29.8 (在1和60分钟;在10到20分钟)。统计上的显著差异也存在于NPC1−−/ Miglustat治疗与NPC1−−/生理盐水治疗小鼠切片:记录的值分别为355.7±46.8,295.8±30.5,249.4±29日和211.1±29.1和216.7±40.4,130.3±12.4,120.8±13.5,108.3±21.4 (< 0.05 1分钟;所有以下分钟p < 0.01)。

片从WT动物生理盐水处理(从5个不同的动物)和Miglustat (从5个不同的老鼠),PTP和LTP值10,20,强直刺激后60分钟没有显著变化对未经处理的小鼠。的值分别为320.3±36.9、246.7±19.3、226.9±34.5、188.6±24.4,分别为WT盐水治疗小鼠和318.3±31.2,258.6±21.3,232.6±23.1,200.1±30.8 WT Miglustat治疗老鼠。片从NPC1−−老鼠用生理盐水治疗(从5个不同的动物),强直刺激诱导的抑制PTP和LTP的报道NPC1−−未经处理的小鼠。PS PTP %值分别为216.7±40.4,130.3±12.4,120.8±13.5,108.3±21.4 10,20,强直刺激后60分钟。

Miglustat治疗NPC1−−/老鼠能够恢复的损害PTP和LTP观察切片NPC1−−/生理盐水治疗老鼠。PTP和LTP的值10,20,和强直刺激后60分钟355.7±46.8,295.8±30.5,211.1±29.1,249.4±29日分别,从而达到价值观相似的生理盐水治疗WT老鼠(,< 0.05和< 0.01与生理盐水治疗NPC1−−/;有关详细信息,请参阅传说)。

3.3。Miglustat对ERK的磷酸化的影响海马片NPC1−−老鼠

ERK磷酸化已被证明发生在海马LTP诱导不同范式后片(16]。事实上,LTP感应后,erk大大磷酸化,磷酸化的程度取决于LTP诱导范式的类型(17]。在这里,我们分析erk的磷酸化状态在不同的时间段(5、15和30分钟)后高频破伤风。这一目标,每个时间点的单片(从一个鼠标)受到电生理学,快速切割分离CA1区之前单一化和蛋白质的溶解产物通过免疫印迹(图分析3)。量化的免疫反应性的水平激活ERK2激酶,规范化的总激酶,显示感应的LTP ERK2磷酸化片从WT老鼠增加了约。在5 47%、60%和80%,15日分别和LTP后30分钟(从6为每个时间点不同的动物,)。同样的强直刺激NPC1−−/鼠标片未能诱导显著erk磷酸化在每个时间点(从6个不同的动物,)(图3)。我们接着问Miglustat是否能够恢复erk的磷酸化在刺激NPC1−−鼠标片。因此,我们评估ERK2磷酸化水平在CA1区片NPC1−−/小鼠与Miglustat或生理盐水后不同时期LTP归纳。我们发现Miglustat重建ERK2磷酸化水平主要是在5和15分钟后LTP(增加40%和45%,分别地。30分钟后,20%;从每组5种不同的动物,图4)。填喂法的控制程序和验证的特异性Miglustat行动,我们也评估erk激活片从WT与生理盐水或Miglustat小鼠。我们发现erk的磷酸化水平没有显著变化对片从未经处理的动物(从4组动物不同,图4)。

图3

时间进程分析磷酸化的变化ERK1/2在WT LTP和NPC1−−老鼠。代表西方滴erk的磷酸化和总形式上部面板所示。光密度定量的免疫反应性的乐队在不同时间后LTP感应了下面板。价值观代表了规范化ERK2蛋白磷酸化的变化百分比LTP后为每一个时间点。酒吧的情节代表意味着±SEM (WT老鼠,与控制值(T0);对于NPC1−−老鼠,与WT老鼠在相应的时间点)。

图4

效应引起Miglustat治疗ERK1/2的激活在WT LTP和NPC1−−治疗小鼠。激活的免疫反应性的水平和总激酶代表实验表明时间的上面板;归一化值(意味着±SEM)激酶激活说明在下面的面板(为NPC1−−/老鼠Miglustat处理;与未经处理的NPC1−−/老鼠在相应的时间点)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们分析了突触可塑性是否改变NPC1−−老鼠,NPCD[的行之有效的小鼠模型12),我们提出Miglustat治疗,以抵消突触赤字。主要来自本研究的发现可以概括如下:(i) BST,以前我们发现增强NPC1−−/鼠标片,Miglustat治疗后恢复正常的价值观;(2)海马PTP和LTP感应和维护大大减少片从NPC1−−老鼠而Miglustat在活的有机体内政府能够恢复这个障碍;(iii)应用程序的强直刺激,诱导快速和强大的增量erk的磷酸化在WT海马切片中,未能引起显著的兵磷酸化NPC1−−/鼠标片和Miglustat治疗可以恢复这个激活;(iv)口服治疗NPC1−−/老鼠Miglustat能够防止出现症状在活的有机体内。

谢弗络脉的强直刺激的海马CA3区NPC1−−/小鼠诱导的突触可塑性特点是部分抑制PTP和LTP感应,而维护阶段完全阻塞。这些结果,通过记录PS的锥体层,部分符合周观察et al。18],它演示了一个缺陷在NPC1突变小鼠海马LTP EPSP减少字段。

Posttetanic海马LTP的地区已被广泛研究,归因于NMDA和AMPA受体活动(19,20.]。PTP和LTP的减少,我们发现在NPC1−−/片可能是几种不同机制的故障造成的与这些受体激活。首先,PTP在人大老鼠可能会受到减少的影响在突触前神经递质释放由于海拔降低Ca2 +强直后调节。事实上,一些研究支持中发挥的重要作用胆固醇和膜筏在神经递质释放过程。例如,据报道,胞外分泌的突触囊泡,包括Ca2-dependent谷氨酸释放,受损后降低胆固醇水平(21,22]。此外,在以前的论文,我们提供证据证明代理干扰质膜胆固醇(methyl-beta-cyclodextrin (Cdex))在海马细胞抑制钙的NMDA-stimulated涌入文化(23]。事实上,在另一篇论文从我们组,我们证明了Cdex强烈减少突触传递和阻断LTP的表达11]。

的NPC1−−/小鼠海马神经元可能存在一个脂质域组织影响NMDAR转导通路受损导致LTP诱导的损伤。LTP维护阶段的阻碍可能是由于有缺陷的监管GluR1 AMPA受体贩运和减少暴露这些受体在细胞表面的神经节甘脂和/或胆固醇积累的结果。这些结果可能与雌猎犬et al。10)最近证明NMDAR在LTP感应激活导致的损失分配神经元触发细胞内胆固醇的AMPA受体的突触传递,反过来,突触。

整体而言,这些结果表明,胆固醇dysmetabolism可能负责突触可塑性损伤现象,表明所描述的LTP障碍NPC1−−/老鼠可能导致脂质运输系统的一个缺陷。

在WT鼠标片,我们之前报道的快速和强大的增量交付LTP诱导HFS中erk的磷酸化后,持续了至少30分钟(14]。应用程序的强直刺激NPC1−−/成功诱导海马切片是一位重要的erk磷酸化。给定的可能性减少NMDA受体的激活依赖于胆固醇水平,从而降低钙离子涌入NPC1−−/片,它是合理的假设缺乏erk的磷酸化可能取决于传导机制的失败由NMDAR [24]。

在目前的研究中,我们观察到Miglustat政府能够恢复的超兴奋性之前报道NPC1−−/鼠海马片(15)和PTP和LTP的障碍。以下的假设的机制Miglustat能够恢复的突触可塑性损伤NPC1−−/老鼠涉及erk磷酸化,我们预期在活的有机体内Miglustat政府可以在刺激恢复erk的磷酸化NPC1−−鼠标片。的确,Miglustat治疗能够重建erk激活片从NPC1−−/老鼠建议直接影响药物的突触的信号转导途径。

自2009年以来Miglustat指定孤儿药品EMA的NPC患者的神经系统症状的治疗。事实上,一些优势一直特别注意到在Miglustat诊所治疗和改善神经损伤的NPC患者,主要在青少年或成人发病,不可逆的神经损伤发生之前。然而,这一改进的原因尚未确定。

我们的观察关于保护作用的Miglustat NPC1−−/老鼠(视频辅助材料)与其他作者报道的数据协议虽然在我们的研究中我们使用低剂量的药物(0.2毫克/公斤/死于填喂法)(25,26]。强饲法政府的选择是给确切数额的药物而,在其他的研究中,Miglustat治疗是由饮食喂养动物混合药物颗粒(50 - 1200毫克/公斤/天)。

在体外,Miglustat充当葡糖神经酰胺合成酶的抑制剂,神经节苷脂合成的酶,调节的第一步,因此被用来改善几个dyslipidosis,包括高雪氏症和GM1 gangliosidosis。损耗Miglustat鞘糖脂的治疗可以减少病理性血脂存储,提高endosomal吸收,和规范脂质贩卖NPC患者外周血B淋巴细胞(27]。Miglustat,没有直接影响胆固醇代谢,纠正脂质异常交易在NPC患者B淋巴细胞可能表明鞘糖脂积累可能是人大病的重要致病的事件。

5。结论

它最近提出,超出其影响鞘糖脂合成、Miglustat可以扮演其他角色,如干扰组蛋白乙酰化作用(28),阻断氧化应激(NPC细胞中观察到病人),或作为监护人给正确的折叠突变NPC1 [29日]。更好的理解的作用机制Miglustat改善其治疗作用是至关重要的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

C·弗兰克·D·梅洛,和g D 'Arcangelo支持由格兰特Progetto di Ricerca ISS-Istituzioni,美国在尼曼C疾病:神经细胞死亡的机制从分子到诊所(fascicolo 11美元)。a . Zaratti是由Associazione Italiana尼曼氏病。作者感谢Cortese和s Germoni动物屋的组织和维护鼠标殖民地,c . Mollinari批评,和m·马里尼图形援助。

补充材料